CC BY
12УДК 582.281.21:616-056.3
МАРКЕРЫ ЕСТЕСТВЕННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ШТАММОВ RHIZOMUCOR PUSILLUS - МИКОАЛЛЕРГО-ПРОДУЦЕНТОВ
Журавлева Н.П. (в.н.с.)*, Елинов Н.П. (профессор кафедры), Васильева Н.В. (директор института, зав. кафедрой), Фролова Е.В. (зав. лаб.), Соловьева Г.И. (в.н.с.), Чилина Г.А. (зав. лаб.)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СевероЗападного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
©Коллектив авторов, 2016
Род Rhizomucor относят к семейству Mucoraceae, порядку Mucorales, подотделу Mucoromycotina. Микромицеты из семейства Mucoraceae могут быть этиологически значимыми при аллергических заболеваниях, т.к. весьма распространены в окружающей среде. Для жилых помещений, пораженных плесневыми микромицетами, характерна высокая концентрация спор микроскопических грибов -факторов риска микогенной аллергии. В последние годы отмечают рост заболеваемости органов дыхания, обусловленной плесневыми грибами, в том числе и зигомицетами. Клиническими проявлениями микогенной аллергии при этом, как правило, являются аллергический ринит и бронхиальная астма.
В связи с этим разработка стандартных аллергодиагностиче-ских тест-систем и создание банка штаммов микромицетов - продуцентов специфичных, активных и стабильных аллергенов являются актуальной проблемой.
С этой целью проведены генетико-селекционные исследования по изучению естественной изменчивости популяций селекционированных штаммов (СШ) Rhizomucor pusillus в многоступенчатой селекции в сравнении с исходным штаммом (ИШ), выделенным от больного, по двум маркерам - морфологии колоний и активности прорастания спор. Популяция селекционированных и исходного штаммов была гомогенна по маркеру макроморфологии колоний (МК) и состояла из основного -1 типа. По маркеру активности прорастания спор (ПС) отмечено преимущество популяций СШ в сравнении с ИШ. Так, в популяции ИШ на всех ступенях селекции превалирует количество низкоактивных клонов по ПС. У СШ с каждой ступенью количество низкоактивных клонов уменьшается. При этом количество клонов у СШ с высокой активностью значительно увеличивается. Селекционирован ряд стабильных типичных по морфологии колоний штаммов с активностью прорастания спор от 71 до 75%, превышающие ИШ на 40-44%.
С применением генетико-селекционных методик интенсифицированы и стандартифицированы штаммы Rhizomucor pusillus. При естественном многоступенчатом отборе селекционированы штаммы с генетической однородностью клонов в популяции по маркеру МК и повышен потенциал жизнеспособности спор при увеличении маркера интенсивности ПС в сравнении с ИШ.
Селекционированные штаммы специфичны, высокоактивны, стабильны и рентабельны. В перспективе штаммы могут быть использованы при создании технологии получения тест-систем для микоаллергодиагностики.
Ключевые слова: активность прорастания спор, морфология колоний, аллергопродуценты, Rhizomucor pusillus, селекция, спонтанная изменчивость
Контактное лицо: Журавлева Нина Петровна, тел.: (812) 303-51-40
MARKERS OF VARIABILITY OF RHIZOMUCOR PUSILLUS STRAINS - PRODUCENT OF MYCOALLERGENS
Zhuravleva N.P. (leading scientific collaborator), Yelinov N.P. (professor of the chair), Vasilyeva N.V. (director of institute), Frolova E.V., (head of the laboratory), Solovjova G.I. (leading scientific collaborator), Chilina G.A. (head of the laboratory)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of NorthWestern State Medical University named after I.I.Mechnikov, St.Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2016
Rhizomucor belongs to Mucoraceae family, order Mucorales, subdivision Mucoromycotina. Micromycetes of Mucoraceae family may be etiologically significant in allergic diseases, since they are widespread in environment. The living spaces, affected by molds, are characterized by high concentrations of microfungal spore, - risk factors for fungal allergy. In recent years growth of the respiratory diseases caused by molds including Zygomycetes is observed. Clinical manifestations of fungal allergy are allergic rhinitis and bronchial asthma.
In this regard, the development of standard test systems for allergodiagnostics and the creation of the bank of micromycetes strains -producents of specific, active and stable allergens are an actual problem.
We have carried out genetic-selection studies of the natural variability of selected strains populations (SS) Rhizomucor pusillus in a multi-step selection in comparison with the initial strain (IS), isolated from a patient, on two markers: the morphology of the colonies and the activity of spore germination. Population of selected and initial strains was homogeneous for macromorphology of the colonies (MC) and consisted of the main - I type. Advantage of the SS population as compared with IS on the marker of the activity of spore germination was revealed. Thus, the amount of low-active clones on SG prevails in population of IS at all steps of selection. With each step of selection at SS the amount of low active clones decreases, while the amount of clones with high activity increases significantly.
A number of stable strains which typical on morphology of the colonies with the activity of spore germination from 71 to 75% exceeding IS for 40 -44% had been selected.
Rhizomucor pusillus strains have been intensified and standardized with application of genetic-selection methods. At natural multi-step selection strains with genetic uniformity of clones in population on marker MC have been selected. At increase in a marker of intensity of SG in comparison with IS the potential of spores viability was also raised
The selected strains are specific, highly active, stable and profitable. In perspective: the strains can be used in the development of test systems for mycoallergodiagnostics.
Key words: activity of spore germination, allergoproducents, morphology of the colonies, Rhizomucor pusillus, selection, spontaneous variability
ВВЕДЕНИЕ
Целенаправленное исследование изменчивости грибов по определенному маркеру обеспечивает возможность получения чистых культур со свойствами стабильных и рентабельных штаммов микромицетов - продуцентов различных целевых продуктов, в частности микоаллергенов. Создание микоаллергодиагно-стических препаратов из селекционированных штаммов является острой необходимостью в медицинской практике, так как истинная частота микогенной аллергии у больных не может быть установлена до тех пор, пока среди аллергенов нет стандартных препаратов [1; Dziadzio L.K., Bush R.K. //Curr. Allergy and Asthma Reports. - 2001].
Ранее сотрудниками НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина изучена изменчивость таких родов грибов, как Aspergillus, Alternaria, Cladosporium,
■
Fusarium, Pénicillium, являющихся аллергопродуцента-ми [2-5]. При этом показано, что штаммы, выделенные от больных, имеют широкий диапазон изменчивости по таким маркерам, как морфология колоний и активность прорастания спор. Нами селекционированы наиболее активные штаммы по этим признакам и стабильные в ряде генераций. На примере селекционированных штаммов вышеперечисленных микромицетов показано, что полученные из фильтратов культураль-ных жидкостей аллергенные препараты обладают высокой специфичностью, достаточной активностью и стандартностью. Результаты были четкими при обследовании больных атопическими заболеваниями в клиниках Санкт-Петербурга и России, т.е. показано явное преимущество селекционированных штаммов для создания аллергодиагностических препаратов [Соболев А.В. и др.// Int. J. on Immunoreabilitation. - 1999. -№14; Журавлева Н.П. и др. // Патент на изобретение № 2172342. - 2000; Журавлева Н.П. и др.// Патент на изобретение № 2213772 - 2001].
В последнее время выявлен ряд микромицетов, являющихся контаминантами воздуха жилых помещений в Санкт-Петербурге, таких, как Aspergillus spp., Alternaria spp., Cladosporium spp., Fusarium spp., Mucor spp., Pénicillium spp., Rhizopus spp. [6]. Для жилых помещений с признаками плесневого поражения была характерна высокая концентрация спор микромицетов. Частота микогенной аллергии у жителей помещений, пораженных микромицетами, составляла 58,1%. Частота сенсибилизации к Mucor spp. - 20,9%, к Rhizopus spp. - 34,0%. При этом основными клиническими формами микогенной аллергии были бронхиальная астма (38,0%) и аллергический ринит (34,0%) [6]. В одной из работ этих же авторов показано влияние концентрации микромицетов в воздухе жилых помещений на течение бронхиальной астмы (БА). Отмечено, что повышение концентрации плесневых микромицетов является фактором риска развития тяжелой БА. Наиболее распространенными грибковыми аллергенами были Aspergillus, Alternaria, Pénicillium, а также Mucor (от 15,6 до 33,7%) [7, 8].
В задачу нашего исследования входило изучение естественной изменчивости клонов в популяции исходного и селекционированных штаммов Rhizomucor pusillus по двум маркерам - морфологии колоний и интенсивности прорастания спор.
Цель эксперимента - в процессе многоступенчатой селекции микромицета R. pusillus отобрать клоны, типичные по маркерам МК и активности ПС, для пополнения банка чистых стабильных по ценным свойствам рентабельных штаммов - продуцентов аллергенов для возможного использования их в отечественной аллер-годиагностике.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объекты исследования - 3 штамма R. pusillus: исходный РКПГБ - F158/3848, выделенный ранее от больного из тромба легочной артерии; селекционированные - при изучении спонтанной изменчивости популяции штаммов: № 158/3848/13, № 158/3848/13/63.
Свойства клонов из моноспорового рассева популяций штаммов исследовали с применением генети-ко-се лекционных методов [Захаров И.А., Квитко К.В. Генетика микроорганизмов - Л., 1967]. Естественную
изменчивость МК грибов изучали на агаризованной среде Сабуро с 4% глюкозы после выращивания при 28 оС в течение 7 суток. Оценивали, в среднем, по 500 клонов каждого штамма.
Спонтанную изменчивость свойства интенсивности ПС исследовали на жидкой среде Сабуро с 4% глюкозы и добавлением органического азота. Грибы инкубировали при 27 оС при постоянном встряхивании пробирок на шуттель-аппарате в течение 17 часов. Из популяции каждого штамма просмотрели по 100 колоний. Количество ПС подсчитывали в процентах к общему числу спор в 10 полях зрения микроскопа. С целью отбора активных клонов по ПС провели статистическую обработку результатов, используя способ сумм [Плохинский Н.А. Биометрия - Новосибирск, 1970]. СШ проверяли при пересеве в ряде генераций на стабильность этих свойств.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При изучении спонтанной изменчивости свойств МК ИШ и СШ установлено, что популяции ИШ и СШ гомогенны по макроморфологии колоний.
Колонии на среде Сабуро светло-серого цвета, ва-тообразные, воздушный мицелий высотой 0,5-1см, обратная сторона колоний бесцветная. Микроскопическая картина представлена спорангионосцами шириной 6-8 мкм; гладкие, бесцветные, спорангии с апофизой, бурые, диаметром 44-50 мкм, колонка шаровидно-грушевидная, буровато-сероватая размером 2430 х 18-20 мкм. Споры округлые, диаметром 4-5 мкм, буроватые.
Естественную изменчивость маркера интенсивности ПС оценивали по критериям вариабельности клонов в популяциях ИШ и СШ (табл.).
Таблица
Естественная изменчивость клонов в популяции селекционированных и исходного штаммов & ривШив по маркеру ПС при многоступенчатой селекции
Ступени селекции № штаммов Размах изменчивости, % Средняя арифметическая, х,% Коэффициент изменчивости, cv, % Квадратичное отклонение о,% Частота вариантов, %
плюс минус
I ИШ РКП1Т-158 0 - 100 30,6 ± 1,8 60,9 18,6 4 ± 1,9 0
II СШ 158-3 0 - 100 37,4 ± 1,8 47,9 17,9 2 ± 1,4 0
III СШ 158-13-63 0 -100 40,0 ± 1,6 39,7 15,9 1 ± 1,7 0
Как видно из таблицы и рисунка, популяции ИШ и СШ I, II, и III этапов имеют одинаковый размах изменчивости по маркерам интенсивности ПС от 0 до 100%.
Рис. Естественная изменчивость активности прорастания спор в популяциях исходного и селекционированных штаммов Rhizomucorpusillus при многоступенчатой селекции. По оси абсцисс - активность прорастания спор, %. По оси ординат - количество вариантов с проросшими
спорами, %. а) исходный штамм - РКПГР-158 - I этап селекции. б) селекционированный штамм - 158 /13 - II этап селекции. в) селекционированный штамм - 158 /13/63 -III этап селекции
Но с каждым этапом селекции отмечали отличия по ряду критериев изменчивости. Так, из рисунка и таблицы видно, что в популяции ИШ превалирует количество клонов с низкой активностью ПС; в интервале от 0 до 20% активность ПС у ИШ - 33%, а у СШ с каждым этапом селекции количество низкоактивных клонов значительно уменьшается на 18,6% (II этап) и на 25,7% (III этап). Отметим, что на каждом этапе селекции возрастает процент клонов с интенсивным прорастанием спор. Модальный класс этого маркера на всех этапах одинаковый и находится в интервале от 21 до 40%. У СШ количество клонов с высокой активностью значительно выше ИС. Так, на II этапе на 2,4%, а на III - на 7,4% больше. А в пределах от 40 до 60% интенсивность ПС возрастает постепенно от 21% (I этап) до 27,7% (II этап) и до 37,7% (III этап) (табл., рис.). Далее в пределах высокоактивных классов от 61 до 80%, активность ПС практически одинаковая - 6%
(I этап), 10,3% (II) и до 7,2% (III); в пределах 80-100% -активность ПС одинакова.
Однако в процессе статистической обработки результатов эксперимента на основе критериев изменчивости: средней арифметической (х) маркера, коэффициента вариации (cv), квадратичного отклонения (а) выделены несколько высокоактивных штаммов. В результате отбора у СШ х постепенно возрастал - на 6,8% на II этапе и на 9,4% - на III в сравнении с популяцией ИШ.
Для более точного определения разнообразия исследуемого признака определяли относительно среднее отклонение, выраженное в % cv. В данном эксперименте cv на II этапе селекции снижалось на 13 %, на III - на 21,2% в сравнении с популяцией ИШ. Незначительно, но также показана тенденция снижения а в популяциях СШ от 18,6 до 15,9%. Снижение коэффициента вариации (cv) и снижение отклонения от средней арифметической вариационного ряда (а) по активности ПС отражают постепенную стабилизацию СШ по исследуемому маркеру. В результате на последнем этапе селекции отобраны штаммы с активностью от 71 до 75%, что превышает среднюю арифметическую ИШ на 40 и 44%.
Так, в результате исследования показана значимость многоступенчатой селекции клонов в популяции R. pusillus по маркерам типичности МК и высокой активности ПС. Нами на третьей ступени селекции отобраны клоны, типичные по МК и высокоактивные по ПС от 71 до 75% на 17 часов выращивания в глубинных условиях роста, что превысило среднюю активность ИШ в 4,3 раза. Кроме того, СШ были стабильны по селекционированным свойствам в нескольких генерациях и специфичны.
Ранее нами показано, что штаммы с интенсивным ПС дают возможность наращивания большего объема биомассы мицелия как источника активных аллергенных веществ [8; Захаров И.А., Квитко К.В. Генетика микроорганизмов - Л., 1967]. В перспективе СШ могут быть использованы для наработки стандартных, специфичных и активных аллергенных отечественных препаратов.
Селекционированные штаммы R. pusillus депонированы в банке чистых культур микромицетов в НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СЗГМУ им. И.И. Мечникова.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате многоступенчатой селекции R. pusillus изучена спонтанная изменчивость популяции исходного и селекционированных штаммов. Выявлен потенциал этих штаммов по интенсивности прорастания спор и выделены 3 селекционированных штамма с активностью ПС от 71 до 75%, что превышает исходный штамм на 40-44%. Популяции СШ гомогенны по морфологии колоний, стабильны по активности ПС в ряде генераций. В перспективе СШ могут быть использованы при создании отечественных тест-систем для микоаллергодиагностики.
ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА
1. Митрофанов B.C., Козлова Я.И. Плесени в доме (обзор)// Проблемы медицинской микологии. - 2004. - Т. 6, №2. - С. 10-18.
2. Журавлева Н.П., Васильева Н.В., Соловьева Г.И. Спонтанная изменчивость популяций селекционированных штаммов микромицетов Cladosporium herbarum (Pers) Link - продуцентов аллергенов// Проблемы медицинской микологии. -2007. - Т. 9, №2. - С. 56-57.
3. Журавлева Н.П., Васильева Н.В., Чилина Г.А., Соловьева Г.И. Селекция штаммов Penicillium notatum Weste - продуцентов аллергенов// Проблемы медицинской микологии. - 2011. - Т. 13, №2. - С. 77-78.
4. Журавлева Н.П., Елинов Н.П., Васильева Н.В. и др. Маркеры спонтанной и индуцированной изменчивости штаммов микоаллергопродуцентов Fusarium javanicum var. radicicola //Проблемы медицинской микологии. - 2014. - Т. 16, №1. - С. 46-49.
5. Журавлева Н.П., Елинов Н.П.,Васильева Н.В. и др. Явление интенсификации штаммов микромицета Fusarium javanicum var. radicicola //Сборник «Научные открытия 2015». Изд. Российской академии естественных наук, 2016. - С. 10-12.
6. Козлова Я.И., Аак О.В., Чилина Г.А. Роль микромицетов - контаминантов жилых помещений в формировании мико-генной аллергии// Проблемы медицинской микологии. - 2007. - Т. 9, №2. - С. 64-65.
7. Козлова Я.И., Аак О.В.,Чилина Г.А. Особенности бронхиальной астмы у жителей помещений, пораженных микромице-тами// Проблемы медицинской микологии. - 2008. - Т. 10, №2. - С. 51-52
8. Козлова Я.И., Соболев А.В., Аак О.В. и др. Микогенная аллергия у пациентов с атопическими заболеваниями в Санкт-Петербурге// Проблемы медицинской микологии. - 2014. - Т. 16, №2. - С. 87-88.
Поступила в редакцию журнала 21.04.2016
Рецензент: А.А. Степанова
