CC BY
31УДК 616.992:616-057
МИКОВИРУС
в клетках
ПАТОГЕННОГО ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА ГРИБА
fusarium javanicum
VAR. RADicicoLA WR.
Журавлева Н.П. (вед.н.с.)1, Елинов Н.П. (зам. директора по НИР)1, Васильева Н.В. (директор)1, Семенов В.В. (вед.н.с.)1, Сироткин А.К. (вед.н.с.)2, Давыденко С.Г. (ст.н.с.)3
1НИИ медицинской микологии им. П.Н.Кашкина ГОУ ДПО СПб МАПО, 2НИИ гриппа РАМН, 'Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2008
Нами обнаружен литический эндофактор в клетках патогенного для человека гриба Fusarium javanicum var. radici-cola, способный к репродукции и названный нами миковирусом. Работа зарегистрирована как научное открытие (диплом №326) с приоритетом 01 июля 1999 г.
Ключевые слова: аллергены, вирусы грибов, миковирус Fusarium javanicum var. radicicola, патогенный для человека, ридостин, статолон
MYCOVIRUS IN CELLS OF PATHOGENIC FOR MAN FusARiuM
javanicum VAR. radicicola wr.
Jhuravleva N.P. (leading researcher)1, Yelinov N.P. (deputy director for Research Program)1, Vasilyeva N.V. (director)1, Semenov V.V. (leading research worker)1, Syrotkin A.K. (leading research worker)2, Davydenko S.G. (senior research worker)3
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of SEI APE SPb MAPE1, Research Institute of grippe RAMS2, Institute of Cytology RAS3, Saint Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2008
We have discovered the lytic endofactor in cells of pathogenic for man Fusarium javanicum var. radicicola capable of reproduction and named mycovirus by us. This work has been registered as the scientific discovery (diploma N326) with priority 1st July, 1999.
Key words: allergens, fungal viruses, mycovirus Fusarium javanicum var. radicicola pathogenic for man, ridostin, statolon
ВВЕДЕНИЕ
Ранее были известны вирусы фитопатогенных грибов (около 50 видов): пенициллов, аспергиллов, сахаромицетов, мукоров, а также 3-х видов фуза-риев - Fusarium solani f. sp. robiniale [1], F poae [2], F graminearum [3]. Известно, что вирусы фитопатогенных грибов представляют собой организованные частицы величиной 20-50 нм, как правило, икосаэ-дрической формы [4]. Это рибонуклеиновые частицы, сегментированный геном которых содержит большей частью двунитевую РНК (ds-РНК), находящуюся внутри белкового капсида [2, 3, 5-7]. Однако известны фитопатогенные грибы, такие как Agarieus bisporus, Sclerophthora macrospora и Pleurotus ostrea-tus, геном вируса которых состоит из линейной единственной нити РНК (ss-РНК) [8-10]. А также редко, но встречаются микромицеты, геном вируса которых представлен двунитевой ДНК (ds-ДНК), как у Rhizidiomyces и Rhizoctonia solani [11, 12]. Известна молекулярная масса ds-РНК вирусов, пределы колебаний которой зависят от рода, вида и штамма гриба: с мелким сегментом — 1, 4 килобаз (кЬ) - у Botrytis ci-nerea и с крупным - до 14,8 кЬ - у Rhizopus microspo-rus [13, 14].
Из немногочисленных данных по изучению вирусов фитопатогенных грибов следует, что наличие вирусных частиц в грибных клетках изменяет морфологию макроколоний, пигментацию, потерю воздушного мицелия, замедляет скорость роста [15-18]. Показано, что у ряда грибов продукция некоторых метаболитов, включая антибиотики и токсины, также зависит от присутствия в штамме гриба миковируса [17, 19]. Тем не менее, к настоящему времени нет однозначного ответа на вопрос - коррелируют ли определенные свойства гриба с присутствием в нем вируса? Так, итальянские ученые отмечают зависимость киллерной активности штаммов Saccha-romyces cerevisiae, продуцирующих токсин, от наличия ds-РНК вируса в этой культуре [20]; английские исследователи доказывают обратное, что между содержанием ds-РНК и охратоксином корреляции у штаммов вида Aspergillus не наблюдали [21]. В 2002 г. корейские ученые при исследовании вируса Fusarium graminearum установили, что присутствие ds-РНК коррелирует с изменением морфологии и роста гриба [3]. Ими же показано, что наличие ds-РНК в клетке гриба снижает вирулентность штамма. В связи с этими данными, можно отметить недостаточность изучения взаимоотношений фитопатогенных грибов с их внутриклеточным вирусом.
Функции ds-РНК вирусов грибов и возможности ее использования многообразны. Так, ds-РНК стимулирует образование антител и активирует другие механизмы иммунитета против опухолевых заболеваний [22]. ds-РНК может быть использована в качестве иммуномодулятора биологического происхождения для повышения иммуногенности антигенов [23]. В середине ХХ века впервые был получен пре-
парат под названием статолон, обладающий антивирусной и интерферон-индуцирующей активностью (продуцент - Penicillium stoloniferum) [24]. В конце ХХ и в начале XXI веков интерес к миковирусам «вспыхнул» вновь из-за поиска новых природных иммуномодуляторов.
В настоящее время в медицинской практике широко применяют природный индуктор интерферона
- ридостин - лекарственный препарат, содержащий ds-РНК, выделенную из киллерных штаммов дрожжей S. serevisiae [25]. Ридостин обладает анти-ВИЧ-активностью, аналогичной активности азидотими-дина, но при значительно меньшей токсичности [26]. Он перспективен также в клинической практике при гриппе, ОРВИ, бешенстве, энцефалитах, герпесе [27].
Кроме того, показано, что штаммы микроорганизмов изначально содержат вирусные и фаговые частицы (без заражения извне) и способны в определенных условиях освобождать вирус в окружающую среду. Такие штаммы обычно устойчивы к литическо-му действию собственного вируса. Однако, при некоторых условиях, подобные вирусы, накапливаясь в большом количестве, проявляют склонность к изменчивости и мутированию. Мутантные формы приобретают способность лизировать культуру-хозяина [4,28,29]. Это явление лизиса штаммов-продуцентов различных метаболитов опасно для производственных культур. Как сказано выше, изменение морфологии и ультраструктуры грибов под влиянием внутриклеточного вируса могут сопровождаться утратой важнейших признаков, характерных для каждого вида и штамма микромицета и учитываемых таксо-номистами, а также лицами, сохраняющими грибы-продуценты биологически активных веществ.
С учетом сказанного, изучение миковирусов и их взаимоотношений с «грибами-хозяевами» имеет большое научное и практическое значение.
В отличие от известных ранее вирусов грибов, патогенных для растений, нами обнаружен неизвестный ранее внутриклеточный вирус у Fusarium javanicum var. radicicola (F. j. v. r.), патогенного для человека. Генезис штамма № 69 F. j. v. r. выделен с пораженного участка руки больного; при дальнейшей естественной селекции этого штамма с оценкой интенсивности прорастания спор получены штаммы №69/73 и №69/9/6, составляющие банк производственных культур - продуцентов аллергенов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования послужил микромицет Fusarium javanicum var. radicicola штамм № 69, патогенный для человека. Он выделен в 1987 г. с пораженной кисти больного и хранится в музее культур грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Каш-кина СПб МАПО, а также селекционированные из него штаммы по интенсивности прорастания спор
№69/73, №69/9/6.1 Газоны роста этих штаммов на агаризованной питательной среде (без оптимизации условий для репродукции МВ) служили тест-культурами.
I) Биологическую оценку спонтанного освобождения МВ в виде негативных колоний (н.к.) и обширных зон лизиса гриба проводили по описанным ранее методам, по аналогии с актинофагами [28, 29, 30], разработав при этом модификации для накопления МВ, создавая оптимальные условия, провоцирующие выявление МВ в клетках гриба F. j. v. r. за счет его интенсивной репродукции, на агаризованных и в жидких средах.
1) Выявление вируса на агаризованной среде. Модификация заключалась в варьировании рH среды и концентраций агара: рH устанавливали равным 4,5; 6,0; 8,0; использовали две среды - агар Сабуро с 4% глюкозы (АС) и пептонно-кукурузный (ПКА), концентрации агара — 2,0 и 1,4%. Опыты проводили в чашках Петри. В качестве контроля использовали среды с 2% агара, рH 6,5. Для доказательства факта, что зоны лизиса мицелия вызваны МВ, а не возникали под влиянием антибиотиков, ферментов или других химических факторов, продуцируемых культурой, ставили опыт на перевиваемость вируса, т.е. способность литического эндофактора к репродукции [31].
2) Перевиваемость МВ. Для перевиваемости МВ кусочек агара с лизированной зоной наносили в центр газона индикаторной к нему культуры F. j. v. r. на ПКА в чашках Петри и распределяли материал шпателем последовательно с I чашки на II, III-ю методом истощающегося мазка. Затем гриб выращивали в термостате при 28 оС в течение 3-х суток, после чего отмечали результат действия МВ на газон гриба. № 2-й и 3-й чашке наблюдали последовательное увеличение зоны лизиса мицелия, что служило доказательством содержания в исходной пробе размножающегося МВ [31].
3) Выявление МВ в жидкой питательной среде. Штамм гриба засевали в колбу емкостью 750 мл с 150 мл пептонно-кукурузного бульона (ПКБ) при варьировании рH среды: 4,5; 6,2; 8,0 и выращивали при
27 оС на шуттель-аппарате при 100 об/мин в течение 72 час. После чего стерильный фильтрат закапывали на газон индикаторного штамма гриба в чашках Петри и выращивали гриб в термостате при 28 оС в течение 72 час. Затем отмечали результат действия МВ на мицелий гриба и ставили опыт на перевиваемость МВ. Контролем служил газон тест-культуры гриба без закапывания фильтрата или без нанесения кусочка стерильной зоны на центр газона [31].
4) Для исследования фильтруемости МВ гриб
1 Согласно атласу клинически значимых грибов Fusarium javanicum var. radicicola относят как синоним F. solani — специальная форма (forma speciale-radicicola). Впервые описан Мацумото и Соеджима (1976) в качестве причины кератита (de Hoog G.S., Guarro J., Gene J., Figueras M.J. Atlas of Clinical Fungi, 2nd еdiition, Centraalbureau voor Schimmelcultures/Universitat Rovira I Virgili, 2000. S.1030).
выращивали на агаризованной среде (в оптимальных условиях для размножения вируса) при 28 оС в течение 72 ч. Затем кусочки агара с зонами лизиса переносили в колбу с мясо-петонным бульоном (МПБ без NaCl). Колбу оставляли на 7 час при комнатной температуре, периодически встряхивая. Известно, что если исследуемые зоны лизиса гриба вызваны вирусом, то он хоть в малом количестве, но перейдет в бульон. Затем из бульона получали стерильный фильтрат, используя фильтр Зейтца, и закапывали в виде петли на центр газона микромицета. Через 72 ч. выращивания газона при 28 оС отмечали стерильную зону лизиса газона по центру и ставили на перевива-емость, подтверждая наличие в лизированной зоне профильтрованного вируса. Контролем служил газон тест-гриба без нанесения фильтрата [31].
II. Для выделения МВ из гриба и изучения его морфологии штамм №69/9/6 выращивали глубинным методом в колбах со средой ПКБ рH 4,5 при 27 оС на шуттель-аппарате при 100 об/мин в течение 72 час. Затем мицелий отделяли от культуральной среды путем фильтрации через тройной слой стерильной марли, дважды промывали фосфатным буфером (100 mM натрия фосфата, рH 7,4; 10 mM магния хлорида) и удаляли избыток жидкости, помещая мицелий, завернутый в марлю, под пресс между слоями фильтровальной бумаги на 1 час. Отжатый мицелий в количестве 30 г замораживали в жидком азоте и растирали в порошок в фарфоровой ступке. Измельченный мицелий разводили в 200 мл фосфатного буфера и центрифугировали при ускорении 10 000 g в течение 20 мин для удаления клеточного детрита. Для осаждения вирусных частиц супернатант центрифугировали при 100 000 g в течение 2 часов на центрифуге L8 (Beckman, USA). Осадок ресуспендировали в 1 мл фосфатного буфера, наносили на линейный градиент 10-40% сахарозы и центрифугировали при 35 000 об/мин на бакет-роторе SW-50L в течение 1,5 часов [32, 33]. Микродозатором отбирали две четко сформированные зоны плотности 1,3 и 1,45 г/мл. 10 мк/мл взвеси из каждой зоны исследовали в электронном микроскопе JEM-100S (JEOL, Япония), используя стандартную методику негативного контрастирования: каплю взвеси наносили на тефлоновую подложку, сверху на каплю помещали медную сетку с углеродной подложкой на 1 мин, затем сетку однократно отмывали дистиллированной водой в течение 15 сек и контрастировали 1,5% раствором калия фосфо-вольфрамата. Просмотр препаратов осуществляли при инструментальном увеличении 20000-50000. Съемку производили на пленку ФТ-41.
III. Для исследования внутриклеточного МВ штаммы гриба № 69 и №69/9/6 выращивали на ага-ризованной среде ПКА при оптимальных условиях для репродукции МВ и контрольных. Образцы с газона гриба обрабатывали по общепринятой методике: фиксация в «глютаральдегиде-осмии» с последующей заливкой в аралдит. Срезы изготавливали на ультрамикротоме типа LKB-4, контрастировали
по Рейнольдсу [34]. Материал анализировали в электронном микроскопе JEM-100SM [33].
IV. Культурально-морфологические свойства гриба изучали на агаризованной среде ПКА (в оптимальных условиях для репродукции вируса) и контрольных условиях, используя чашки Петри [33].
V. Исследовали спектр литического действия МВ на другие микромицеты, которые составили банк селекционированных нами ранее штаммов - продуцентов аллергенов, хранящихся в НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СПб МАПО. Банк грибов представлен 10 нитчатыми микромицетами: Aspergillus fumigatus, A. clavatus, A. niger, Penicillium notatum, P sp., P verrucosum var. ciclopium, Fusarium javanicum var. radicicola, Rhizomucor pusillus, Rhizopus nigricans, Alternaria tenuis.
Литический спектр вируса Fusarium определяли методом нанесения стерильных зон лизиса на свежезасеянные газоны 10 тест-культур выше представленных грибов, которые выращивали на оптимальной для провокации миковируса агаризованной питательной среде в термостате (28 оС) в течение 5 суток и 2 суток - на свету при комнатной температуре. Контролем служили газоны культур, выросшие в тех же условиях, но без нанесения материала со стерильных зон лизиса [33].
VI. Целью последующего исследования было изучение особенности взаимоотношений вируса и «микромицета-хозяина» при различных температурах [35]. Селекционированный штамм (контроль) засевали на агаризованные среды в чашках Петри, в которые вносили по 0,1 мл суспензий спор. Суспензию спор готовили из 7-суточной, хорошо спорули-рующей культуры, в стерильной дистиллированной воде. Затем освобождали ее от обрывков мицелия и комков спор фильтрованием через двойной бумажный фильтр ФО-ФС-15, медленной фильтрации. Приготовленная суспензия содержала 1106 спор в 1 мл. Эту суспензию подвергали дифференциальной термообработке (ДТО) при 50 оС в течение 4 ч и при 70 оС - от 10 мин до 3 ч 40 мин, ступенчато, в 6 этапов. Контрольный штамм выращивали на 3-х агаризован-ных средах: агаре Сабуро с глюкозой и сусло-агаре с рН 6,2 при 28 оС, а также на сусло-агаре с рН 4,8 при
28 оС в течение 72 ч. Эти условия максимально провоцировали интенсивную репродукцию вирусных частиц (ВЧ) на газоне тест-культуры в виде негативных колоний (НК) или обширных зон лизиса мицелия; при этом использовали следующие условные обозначения: полный лизис мицелия (++++), слившиеся НК ВЧ (+++), много НК ВЧ (++), единичные НК ВЧ (+), НК ВЧ отсутствуют (-). Вариант микромицета, споры которого после ДТО проявляли устойчивость к высокой температуре (70 оС) в течение 3 ч 40 мин и резистентность к лизису вирусом, был проверен на изменчивость клонов в популяции по морфологии колоний, устойчивости к внутриклеточному вирусу и интенсивности прорастания спор [36]. Изменчивость морфологии колоний к устойчивости клонов
к ВЧ изучали на агаре Сабуро, а интенсивность прорастания спор - в жидкой среде Сабуро. Оценивали, в среднем, по 100 вариантов. Количество проросших спор подсчитывали в процентах к общему числу спор в 10 полях зрения на микроскопе МБИ-15. Стабильность вариантов, по вышеперечисленным свойствам, проверяли в генерациях и по длительности сроков хранения. Полученные данные обрабатывали статистически методом сумм [37].
VII. Для изучения генома вируса в клетках «гриба-хозяина» F. j. v. r. необходимым условием для достижения цели было накопление достаточно большого количества ВЧ в клетках гриба. Известно, что ВЧ локализуются в цитоплазме, вакуолях и в спорах «гриба-хозяина». Поэтому было изучено накопление глубинных спор в динамике роста и развития микро-мицета при его глубинном периодическом выращивании на неохмеленном пивном сусле с 5,7% сахарозы при рН 4,7 в колбах емкостью 750 мл при постоянном встряхивании на шуттель-аппарате (100 об/ мин) при 27 оС в течение 24 суток. Названную среду применяли в 2-х вариантах: без внесения дрожжевого экстракта (№1) и с добавлением его в количестве
2 мл на 100 мл среды (№2) [38]. Критериями контроля оптимального накопления спор служили: рН культуральной жидкости (КЖ), цитоморфология развития гиф и глубинных спор, лизис тест-культуры (ТК) при закапывании КЖ на поверхность ее газона и электронно-микроскопическое исследование срезов материала гриба. Для последнего исследования образцы гриба обрабатывали по общепринятой методике с 2-х сред [33, 34, 38]. При этом использовали электронный микроскоп JEM-100 SM. В качестве ТК использовали штамм №69/9/6 F. j. v. r., выращенный на агаризованном сусле рН 4,5 при 28 оС в течение
3 суток.
Цитоморфологию гриба изучали в окрашенных метиленовым синим препаратах, приготовленных из КЖ через 2,3,6,11,13,16,24 суток выращивания ТК, используя биологический микроскоп МБИ-15 [38, 39].
VIII. 16-суточный мицелий, полученный в результате глубинного выращивания F. j. v. r. (см. выше VII), использовали для изучения генома внутриклеточного МВ.
Мицелий отделяли от КЖ фильтрованием через марлю, промывали дважды ТЕ-буферным раствором (10 тМ Tris-HCl, 1 mM ЕБТА, рН 8,0), излишек влаги удаляли фильтровальной бумагой.
Разрушение клеток производили после замораживания 5 г мицелия в жидком азоте и последующего растирания пестиком в стерильной фарфоровой ступке до гомогенного состояния, постепенно добавляя 2 мл буфера LETS (0,1 m LiCl, 10 mM EDTA,
10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5% SDS), 0,5 мл суспензии переносили в пробирку Эппендорфа и добавляли
0,5 мл фенола, насыщенного LETS, перемешивали 1 мин на вортексе, центрифугировали 10 мин при 14000 об/мин. Отбирали супернатант и добавляли к нему равный объем хлороформа, перемешивали 1
мин на вортексе, отбирали супернатант и добавляли к нему равный объем смеси хлороформа с изоами-ловым спиртом в соотношении 24:1. Верхнюю фазу отбирали, добавляли к ней 2,5 объема 96% этанола и оставляли на 12 час при 20 оС для осаждения. Затем пробу центрифугировали 10 мин при 14000 об/мин. Осадок растворяли в буфере ТЕ с последующим переосаждением дважды 2,5 объемами 96% этанола (12 час — при 20 оС), осадок растворяли в буфере ТЕ и проводили высаливание до концентрации 2 М и 4 М LiCl в течение 12 час при 4 оС. Пробы центрифугировали 10 мин при 14000 об/мин, дважды перео-саждали 2,5 объемами 96% этилового спирта (12 час
- при 20 оС). Осадок растворяли в буфере ТЕ.
Идентификацию HK проводили электрофорети-чески в буфере ТВЕ с использованием 1% или 1,4% агарозного геля. HK окрашивали бромистым этиди-ем.
Для более точной характеристики полученных HK пробы обрабатывали ферментами — РHKазой А и ДHKазой I. РHKаза А (Bovine Pancreas, фирма Sigma, США) выделена из поджелудочной железы быка. Рабочий раствор — 15 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5. Конечная концентрация - 10 мкг/мл. ДHKаза I
- панкреатическая (фирма Worthington, США). Рабочий раствор — 1 mM MgCl2, 1 mM Tris-HCl, pH 7,5. Конечная концентрация - 5 мкг/мл.
В первом случае к 20 мкл пробы добавляли 5 мкл РHKазы А и инкубировали 40 мин при 37 оС; во втором - к 20 мкл пробы добавляли 2 мкл ДHKазы I и
1 мкл РHKазина; инкубировали 30 мин при 37 оС. РHKазин - сильный ингибитор РHKаз. Данный белок выделяют из печени крыс или человеческой плаценты. Он эффективно ингибирует РHKазy при трансляции в бесклеточной системе и его широко используют в ферментных реакциях. Все пробы для электрофоретического анализа готовили следующим образом. Осадок растворяли в буфере ТЕ, затем добавляли буфер для проб (0,25% — бромфеноловый синий, 0,25% — ксилолцианол, 30% — глицерин) -1/6 от объема пробы [38].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате проведенных исследований получены следующие данные.
I. — № отдельно изученных штаммах патогенного F. j. v. r., обнаружен литический фактор, способный к размножению, названный нами миковирусом (МВ). Способность МВ к размножению доказана по пере-виваемости фактора [31].
- Определены сравнительно оптимальные условия, обеспечивающие интенсивную репродукцию МВ и его выявление при выращивании гриба на ага-ризованной и в жидкой средах в виде негативных колоний или зон лизиса.
Описание колоний и газонов с лизисом мицелия представлены на пептонно-кукурузном агаре (ПКА) с концентрацией агара 1,4%, рH среды 4,5 и засеянным взвесью спор: точечно и газоном [31,38]; в жидком
пептонно-кукурузном бульоне (ПКБ) с рН 4,5 [31].
- МВ - микрообъект, фильтрующийся через фильтр Зейтца асбестовый и миллипоровый диаметром пор 0,22 цм. Содержимое фильтрата репродуцируется при перевивках на газоне тест-культуры [31].
II. При негативном контрастировании образцов из выращенного гриба во фракции плотностью 1,30 г/мл выявлены вирусные частицы (ВЧ) икосаэ-дрической формы. ВЧ I типа диаметром 20-25 нм, II типа - диаметром 53 нм [33].
III. В ультратонких срезах мицелия, выращенного при оптимальных и контрольных условиях на агари-зованных средах, внутриклеточный МВ выявлен в виде электронноплотных частичек, локализованных в цитоплазме клеток гриба. Размеры внутриклеточных ВЧ 2-х типов: 23-28 нм и 40-55 нм [33]. При этом на срезах мицелия выявлены патоморфологические изменения в ультраструктуре клеток, представленных двумя типами: темными — с электронноплотным содержимым и светлыми — с низкой электронной плотностью. В контрольных вариантах преобладали темные клетки, в опытных - светлые [33]. В «темных» клетках нарушений структуры клеток не выявлено, ВЧ в умеренном количестве локализованы в цитоплазме [33]. Для светлых клеток характерно снижение электронной плотности цитоплазмы; изменялась также структура митохондрий - в них уменьшалось количество крист и они были слабо выражены; количество ВЧ увеличено в сравнении с контрольными условиями выращивания гриба [33].
IV. При оптимальных условиях для идентификации репродукции ВЧ выявлены также изменения культурально-морфологических свойств гриба, что выразилось в замедленном росте колоний, их малом размере, полулизированном или с неровным краем колоний. Воздушный мицелий ослабленный, с наличием НК или зонами лизиса, измененной пигментацией; конидии уменьшены в размере в 1,5-2 раза в сравнении с развитием колоний в контрольных условиях [33]. Влияние МВ на культуральноморфологические свойства при оптимальных условиях выращивания гриба различно в зависимости от штаммов. Так, у исходного штамма наблюдали почти полный лизис газона из воздушного мицелия гриба в сравнении с селекционированным штаммом [33].
V. Литический спектр МВ F. j. v. r. выявлен на 5 видах микромицетов из 10 представленных в условиях эксперимента: Fusarium javanicum (4+), Aspergillus clavatus (3+), A. fumigatus (3+), Penicillium species (3+), Alternaria tenuis (2+) [33]. Кроме зон лизиса мицелия на газоне чувствительных к МВ культур, отмечен ослабленный рост воздушного мицелия и изменение его пигментации в сравнении с контрольными газонами тест-культур без воздействия МВ.
Проявление литических свойств МВ зависит от ряда особенностей: самого вируса, чувствительности к нему микробной культуры, состава среды и условий выращивания (температуры, аэрации) по
аналогии с фагами бактерий [28]. Вирус, проявляющий литическое действие только в отношении культуры «гриба-хозяина» в адекватных условиях (состав среды, определенная концентрация агара в ней, соответствующая рН и температурные условия), является специфическим. МВ, обладающий широким спектром ЛД на другие культуры, как в нашем исследовании, мы обозначаем полимиковирусом.
VI. Изучены особенности взаимоотношений внутриклеточного вируса с грибом-хозяином Р ). V. г. при различных температурах. ДТО индуцирован вариант микромицета, устойчивый к собственным ВЧ на питательной среде, оптимальной для репродукции ВЧ [35]. Клоны популяции вирусоустойчивого (ВУ) варианта микромицета исследовали на изменчивость по некоторым морфолого-биологическим свойствам: особенностям формирования колоний, интенсивности прорастания спор, устойчивости к литическому действию (ЛД) ВЧ. Морфология колоний при этом не изменялась - популяция состояла из гомогенных клонов. Отмечена большая вариабельность свойств устойчивости конов к ЛД ВЧ при хранении, а также выявлена нестабильность этого признака в генерациях. Заметно варьировали показатели изменчивости свойств интенсивности прорастания спор [35]. В итоге селекционированы штаммы Р ). V. г. с активностью прорастания спор, достигающей почти 90%. Они стабильны в генерациях и могут быть использованы при создании отечественных тест-систем для микоаллергодиагностики. Экспериментально показано, что интенсификация прорастания спор гриба после ДТО взаимосвязана с частичным ЛД внутриклеточных ВЧ на «культуру-хозяина». Варианты гриба, устойчивые к ВЧ, как правило, низко активны по прорастанию спор, что подтверждает сложности имеющих место взаимоотношений внутриклеточных ВЧ с «грибом-хозяином».
VII. В результате проведенных исследований для накопления ВЧ в мицелии «гриба-хозяина» при глубинном его выращивании в аэрируемых условиях разработана оптимальная среда №2 - неохмеленное пивное сусло с добавлением дрожжевого экстракта. На 16 сутки культивирования гриба для нее, в отличие от среды №1 без дрожжевого экстракта, характерно:
- сплошной лизис тест-культуры (ТК) при закапывании КЖ на ее газон в виде петли (по центру) [38];
- образование массы свободных набухших глубинных спор [38];
- большое количество внутриклеточного вируса в виде электронно-плотных частиц в клетках «гриба-хозяина» Р.). V. г. [38].
При этом в указанный период на среде №2 масса внутриклеточных ВЧ коррелирует с образованием большого количества свободных набухших глубинных спор и полным лизисом ТК при закапывании КЖ на поверхность ее газона.
VIII. Оптимальная среда №2 для накопления внутриклеточного МВ была использована при выращи-
вании мицелия с целью изучения генома ВЧ в клетках «гриба-хозяина». Проведено трехкратное выращивание мицелия с последующими экстракциями из него нуклеиновых кислот и анализом их с помощью электрофореза в агарозном геле. В итоге обнаружена высокомолекулярная фракция Ь, размером около 10 тыс. пар нуклеиновых оснований (кЬ), устойчивая к ДНКазе и, по нашим данным, представляющая собой двунитевую РНК ^-РНК) [38].
Полученные экспериментальные данные могут быть интерпретированы следующим образом. На примере патогенных штаммов нитчатого гриба ¥шагіит іауапіоит уаг. гайісісоїа нами показана вирусная природа литического фактора, названного миковирусом (МВ).
Известно, что штаммы бактерий и грибов, содержащие вирусные частицы, без заражения извне, способны в определенных условиях выделять вирус в окружающую среду. Такие штаммы обычно устойчивы к литическому действию собственного вируса. Однако, при некоторых условиях, подобные вирусы накапливаются в большом количестве и проявляют склонность к изменчивости и мутированию. Мутантные формы и, возможно, склонность их к интенсивной репродукции, приобретают способность лизировать культуру-хозяина [4, 28, 29].
Наличие внутриклеточного МВ у £ і. V. г. доказано нами по ряду критериев:
1) Симптоматически, в виде негативных колоний (НК) или обширных зон лизиса воздушного мицелия на газоне тест-культуры «гриба-хозяина» как при ограниченном спонтанном освобождении ВЧ, так и по интенсивности их репродукции под влиянием определенных условий: температурного воздействия (70 оС 2 ч 20 мин до 3 ч), определенной концентрации агара (1,4%), показателя рН среды (рН 4,5-4,7), разных по составу питательных сред (пептонно-кукурузный агар и бульон; неохмеленное пивное сусло с добавлением дрожжевого экстракта).
2) При создании оптимальных условий для накопления литического фактора из £ і. V. г. на агаризо-ванной и в жидкой средах мы исходили из того факта, что ВЧ из зон лизиса мицелия при встряхивании переходят в мясо-пептонный бульон [28, 29], таким образом мы накопили ВЧ, что видно по четкой зоне лизиса мицелия на газоне тест-культуры гриба [31].
3) Также показана перевиваемость литического фактора (ЛФ) на газоне тест-культуры гриба, полученного на агаризованной и жидкой средах, что служит доказательством биологической природы ЛФ, способного к репродукции, т.е. ЛФ патогенного штамма гриба £ і. V. г. является вирусом [31].
4) Фильтрат, полученный нами из накопленного ЛФ в мясо-пептонном бульоне, доказывает фильтрующиеся свойства данного объекта - МВ £ і. V. г.
5) При исследовании в электронном микроскопе при негативном контрастировании МВ показан в виде икосаэдрических ВЧ.
6) В ультратонких срезах мицелия обнаружен в
виде электронно-плотных частичек, локализующихся в цитоплазме и вакуолях клетки гриба.
7) По размерам ВЧ во внутриклеточном и изолированном виде практически одинаковы - 2-х типов: 23-28 нм и 40-55 нм.
8) МВ £ і. V. г. определены нами как полимиковирус с относительно широким спектром литического действия (ЛД), выявленном на 5 видах микромице-тов из 10 проверенных. Известно, что вирус, проявляющий ЛД только на свою культуру, является специфическим; миковирус, обладающий широким ЛД на другие культуры микромицетов, является вирусом широкого спектра ЛД (полимиковирусом).
9) Под влиянием МВ £ і. V. г. при оптимальных условиях для интенсификации репродукции ВЧ выявлены патоморфологические, культуральные и уль-траструктурные изменения клетки «гриба-хозяина» ВЧ. Но полного летального действия МВ на гриб не наблюдали. Очевидно, это можно объяснить антибиотическим взаимоотношением внутриклеточных ВЧ с «микромицетом-хозяином» и какими-то защитными структурами гриба, в частности, клеточной стенкой.
10) Разработаны условия периодического глубинного выращивания гриба £ і. V. г. в колбах с целью интенсивного внутриклеточного накопления МВ. В процессе выращивания мицелия в жидком неохме-ленном сусле с добавлением дрожжевого экстракта отмечена корреляция между максимальной репродукцией МВ и такими параметрами, как образование в культуральной жидкости (КЖ) глубинных спор и сплошной зоной лизиса газона тест-культуры при закапывании на нее КЖ, а также электронной микроскопией — цитоплазма клетки сплошь «забита» ВЧ. Биомассу 16-суточного мицелия использовали для изучения генома внутриклеточного вируса.
11) Из мицелия патогенного штамма £ і. V. г. выделена высокомолекулярная фракция (10 тысяч пар нуклеиновых оснований), устойчивая к ДНКазе, и, по нашим данным, представляющая собой двунитевую РНК ^-РНК). Из литературных данных, на примере миковирусов фитопатогенных грибов, известны ВЧ с сегментированным геномом, представленным несколькими видами двунитевой РНК ^-РНК), молекулярная масса которых от малых размеров 1,4 кЬ (ЕоЬгуЬіз сіпегеа) до крупных - 14,8 кЬ (Якіхорт ті-сго$рогиі) [13,14]. В наших исследованиях геном МВ £ і. V. г. представлен ds-РНК с молекулярной массой
10 кЬ. При обработке проб специфическим белком РНКазином ДНКаза не разрушала высокомолекулярную фракцию Ь. Использованная в нашем эксперименте РНКаза А разрушает преимущественно од-нонитевые участки. Можно сделать вывод, что геном МВ гриба £ і. V. г. действительно представлен ds-РНК с молекулярной массой 10 кЬ.
С помощью электронного микроскопа изучена морфология ВЧ и определена икосаэдрическая форма их 2-х размеров: I тип — диаметром 20-25 нм и
11 — 53 нм. ВЧ в виде электронно-плотных частичек
и практически такого же размера, локализованные в цитоплазме клетки гриба, обнаруженны в ультратон-ких срезах клеток «гриба-хозяина».
Показан широкий литический спектр вируса Р іа-vanicum уаг. гайісісоїа на другие микромицеты, в связи с чем он назван полимиковирусом.
Авторами разработана оптимальная питательная среда (№2) для глубинного выращивания гриба Р іavanicum уаг. гайісісоїа с целью накопления ВЧ в клетках «гриба-хозяина» для изучения генома вируса вируса Р іavanicum уаг. гайісісоїа, представленный высокомолекулярной фракцией размером порядка 10 тысяч пар нуклеиновых оснований (кЬ), устойчивой к ДНКазе и представляющей собой двунитевую РНК ^-РНК).
Авторами теоретически и экспериментально установлен неизвестный ранее объект материального мира — вирус гриба Ршагіит іavanicum уаг. гайісісоїа WR., патогенного для человека, заключающийся в том, что обнаруженный литический фактор мицелиального, патогенного для человека гриба Р. Іavanicum уаг. гайісісоїа способен к фильтрации и репродукции и назван миковирусом. Ранее известны вирусы грибов, патогенных для растений.
Открытие вируса гриба Р. іavanicum уаг. гайісісоїа, патогенного для человека, имеет большое значение для фундаментальной науки как вновь открытый, ра-
нее неизвестный, объект материального мира, имеющий значение для лабораторной и клинической медицинской микологии. Для первой открытие вируса важно с таксономической точки зрения применительно к микромицетам-фузариям, а также для хранения музейных и производственных культур грибов. Так, под влиянием вируса могут изменяться ма-кро- и микроморфологии «гриба-хозяина», а также и его микроструктуры, что сопровождается утратой важных признаков, характерных для вида и штамма микромицета, возможен и лизис мицелия селекционированных штаммов грибов — продуцентов аллергенов. В связи с этим авторами даны рекомендации по условиям хранения селекционированных штаммов с внутриклеточным вирусом.
Селекционированные штаммы Р. ^аяатеит уаг. гаётсо1а являются продуцентами аллергенов и находятся на хранении в коллекции культур НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СПб МАПО. Аллергеноактивные препараты, получаемые из этих штаммов грибов, можно использовать в клиникомикологической практике для микоаллергодиагностики.
МААНОИ признало выполненную работу открытием под названием «Внутриклеточный вирус» с приоритетом 1.07.1999 г. [40].
ЛИТЕРАТУРА
1. Nogawa M., Kageyama T., Nakatani A., et al. Cloning and characterization of mycovirus double-stranded RNA from the plant pathogenic fungus, Fusarium solani f. sp. robiniae // Biosci. Biotechnol. Biochem.-1996.-T.60, №5.-P.784-788.
2. Campel P., Papp I., Bibo M., et al. Genetic interrelationships and genome organization of doubles elements of Fusarium poae // Virus Genes-1999.-Vol.18, №1.-P.49-56.
3. Yeon-Mee Chu, Jae-Jin Jeon, Sand-Jin Yea, et al. Double-stranded RNA Mycovirus from Fusarium graminearum //Applied and Environmental Microbiology.-2002.- P.2529-2534.
4. Бобырь А.Д., Садовский Ю.П. Вирусы грибов, их ингибирующие и индуцирующие свойства. - Киевйаукова думка, 1978.- 126 с.
5. Wickner R.B. The killer double-stranded RNA plasmids of yeast // Plasmid.- 1979.- Vol. 2.- P. 303-322.
6. Van derLende T.R., Harmsen Go S.J., Wessel J.G.H. Double-stranded RNA mycoviruses in micelium of Pleurotus ostreatus //FEMS Microbiology Letters.-1995.- Vol.125, N 1.- P.51-56.
7. Ikeda K., Nakamura H., Arakawa M., et al. Dynamics of double-stranded RNA segments in a Helicobasidium mompa clone from a tulip tree plantation // FEMS Microbiol., Ecology. / In Press Corrected proof, Aviable online 11-2004.
8. RevillP.A., Davidson A.D., WrightP.J. The nucleotide sequence and genome organization of mushroom bacilliform virus: a single-stranded RNA virus of Agaricus bisporus (Lange) // Imbach.Virology.- 1994.- Vol.202.- P. 904-911.
9. Yokoi T., Takemoto V., Suzuki M., et al. The nucleotide sequence and genome organization of Sderophthora macrospora virus B// Virology.- 1999.-Vol.264.- P. 344-349.
10. Hyun Jue Vn., Dongbin L., Hyun-SookL. Characterization of a novel single-stranded RNA mycovirus in Pleurotus ostreatus // Virology.- 2003.- Vol. 314, N 1.- P. 9 -15.
11. Dawe V.H., Kuhn C.W. Isolation and characterization of double-stranded DNA mycovirus infecting the aquatic fungus, Rhizidiomyces // Virology.- 1983.- Vol. 130.- P. 21-28.
12. Zhang J., Liang P A double-stranded DNA mycovirus in Rhizoctonia solani // Clin.J.Virol.-1993.- Vol.9.- P.386-389.
13. Castro M., Kramer K., Valdiviul L., et al. A new double-stranded RNA mycovirus from Botrytis cinerea // FEMS Microbiology Letters.-1999.- Vol.175, N 1.- P.95-99.
14. Papp T., Nyilasi I., Fekete C., et al. Presence of double-stranded RNA and virus-like particles in Rhizopus isolates // Can. J. Microbil.-2001.- Vol.47.- P.443-447.
15. Banks G.T., Buck K.W., Chain E.B. et al. Viruses in fungi and interferon stimulation // Nature. - 1968.-Vol. 218, may 11. -P. 542-545.
16. Гаузе Г.Ф., Максимова Т.С., Дудник Ю.В. и др. ^вые штаммы вирусов, выделенные из плесневых грибов рода Penicillium // Микробиология.-1971.-Т.ХЬ, Вып.3.-С.540-543.
17. Hollings M., Stone O.M. Viruses in fungi // Sci. Progr.-1969.-Vol.57, №4.-P.371-377.
18. Гребенюк Н.В., Грама Д.П. Морфологія Penicillium funiculosum Thom., ураженного вірусом // Мікробіол. журн.-1971.-Т.33, вип.3.-С. 364-368.
19. Adler J.P., Mackenzie D.W. Fungal viruses: intrahyphal localization of Penicillium stoloniferum viruses by fluorescent antibody // Abstr. Inn.Meet. Amer.Soc. Microbiol.-1972.- Vol.72, №1.-P.68-73.
20. Conti W.M.S., Gorloni M., Bertolotti D., et al. Yeast Killer System // Clin. Microbiol.Rev.-1997.- P.369-400.
21. Varega J., Rinyu E., Kevei E., et al. Double-stranded RNA mycoviruses in species of Aspergillus sections Circumdati and Fumigati // Can.J.Microbiol.-1998.-Vol.44.- P.569-574.
22. Braum W., Nakano M. Influence of oligodeoxyribonucleotides on early events in antibody formation //Proc.Soc.Exp.Biol. and Med.-1965.-Vol.119, N6.-P.701-708.
23. Елинов Н.П. Микология - на рубеже веков, на рубеже тысячелетий // Микология и Фитопатология.-1995.- Т.29, №1.-С.3-10.
24. Powell H.M., Walcher D.M., Mast M. Antiviral action of statolon against koxaacie A 21/col virus //Antibiot. And Cheomother.-1962.- Vol.12, N5.-P.337-341.
25. Булычев Л.Е., Сергеев А.Н., Рыжиков А.Б. и др. Изучение динамики интерферонообразования в организме у белых мышей при разных путях введения индуктора интерферона ридостина // Антибиотики и химиотерапия.-1998.-Т.43, №4.- С.20-23.
26. Носик Н.Н., Носик Н.И., Кузнецов Н.В. Ингибирующее действие индукторов интерферона на размножение вируса иммунодефицита человека //Вопросы вирусологии.- 1992.- Т.37, №2.- C. 92-94.
27. Булычев Л.Е., Гончарова Е.П., Пьянкова О.Г. и др. Некоторые аспекты интерферонообразования в организме белых мышей // Вестник Российской Академии медицинских наук.-1998.-№4.-С.34-37.
28. Раутенштейн Я.И. Бактериофагия.- М.: АН СССР, 1955.- 142 с.
29. Журавлева Н.П. Изменчивость продуцента леворина Actinomyces levoris Krass. под влиянием специфического фага и гитромицина Б: Автореф. Дисс.канд.мед.наук.- Л., 1976.- 19 с.
30. Жукова Р.А., Коммунарская А.Д., Пронина М.И, Терешин И.М., Журавлева Н.П., Шабас М.Н. Методы селекции продуцентов антибиотиков и ферментов.- Л.: Медицина, 1978. — С. 94-101.
31. Журавлева Н.П., Зуева Е.В., Бегаева Н.Н. Спонтанное освобождение вирусных частиц при хранении селекционированных микромицетов - продуцентов аллергенов // Ж. Проблемы медицинской микологии.-1999.-Т.1, №2. — С. 45-50.
32. Vilches S., Castillo A. A double-stranded RNA mycovirus in Botrytis cinerea // FEMS Microbiology Letters.-1997.-Vol.155.- P.125-130.
33. Журавлева Н.П., Елинов Н.П., Семенов В.В., Сироткин А.К., Зуева Е.В. Индукция вирусных частиц в клетках Fusarium javanicum var. radicicola WR и их свойства // Ж. Проблемы медицинской микологии .-2004.-Т.6, №3. — С. 44-54.
34. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in microscopy // J. of Cell Biology.-1963.-Vol.17.-P.208-212.
35. Журавлева Н.П., Елинов Н.П., Васильева Н.В. Особенности взаимоотношений вируса и микромицета-хозяина Fusarium javanicum var. radicicola при различных температурах // Ж. «Проблемы медицинской микологии».- 2004, Т.6, № 4. — С. 27-32.
36. Захаров И.А., Квитко К.В. Генетика микроорганизмов -Л., 1967. С. 92-96.
37. Плохинский Н.А. Биометрия. — Новосибирск, 1970.
38. Журавлева Н.П., Елинов Н.П., Давыденко С.Г., и др. Вирусный геном в клетках Fusarium javanicum var. radicicola, патогенного для человека // Ж. «Проблемы медицинской микологии». — 2005. — Т. 7, №1. — С. 33-40.
39. Журавлева Н.П., Танкевич М.Е., Жукова Р.А., Большакова Е.Н. Цикл развития и цитоморфологические особенности продуцента олеандомицина Streptomyces antibioticus // Ж. Антибиотики. — 1982. — № 9. — С. 3-5.
40. Потоцкий В.В. Научные открытия, идеи, гипотезы (1992-2007). Информационно-аналитический обзор. — М., 2008. — С. 306-307.
Поступила в редакцию журнала 25.03.08
Рецензировано: экспертной комиссией Международной
Академии авторов научных открытий и изобретений по заявке на открытие №А-406 от 06.02.2006 г.
