CC BY
111УДК 582.282.123.4
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИХ И БИОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ПРИРОДНЫХ И КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ ASPERGILLUS NIGER
Халдеева Е.В. (зав. лаб.)*, Лисовская С.А. (в.н.с.), Глушко Н.И. (с.н.с.), Баязитова А.А. (м.н.с.)
Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии Роспотребнадзора, Казань, Россия
©Коллектив авторов, 2018
Изучены культурально-морфологические и биохимические свойства 36 клинических и 27 природных изолятов Aspergillus niger. Проведено сопоставление их скорости роста, интенсивности спорообразования при различных температурах культивирования. Отмечена способность всех изученных изолятов к росту при 37 оС. Показано, что повышение температуры культивирования приводит к снижению скорости роста, у части изолятов - к существенному (в 2 и более раз) увеличению количества спор. Обнаружен более высокий уровень амилолитической и липолитической активности природных изолятов по сравнению с клиническими.
Выявлены различия в изменении амилолитической и липолити-ческой активности клинических и природных изолятов A. niger при повышении температуры культивирования. Установлен высокий уровень целлюлазной активности клинических штаммов. Полученные данные могут быть использованы для разработки механизмов оценки потенциального риска контаминации плесневыми грибами и подтверждения этиологической роли A. niger в патогенезе заболевания.
Ключевые слова: Aspergillus niger, скорость роста, спорообразование, липолитическая активность, амилолитическая активность, целлюлазная активность
COMPARISON OF CULTURAL-MORPHOLOGICAL AND BIOCHEMICAL PROPERTIES OF ENVIRONMENTAL AND CLINICAL ISOLATES OF ASPERGILLUS NIGER
Khaldeeva E.V. (head of the laboratory), Lisovskaya S.A. (leading scientific collaborator), Glushko N.I. (senior scientific collaborator), Bayazitova A.A. (junior scientific collaborator)
Kazan Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Kazan, Russia
©Коллектив авторов, 2018
The cultural-morphological and biochemical properties of 36 clinical and 27 environmental isolates of Aspergillus niger have been studied. A comparison of their growth rate, the intensity of spore formation at different temperatures of cultivation was carried out. The ability of all studied isolates to grow at 37 oC was noted. It is shown that the increase in the temperature of cultivation leads to a decrease in the growth rate, in some isolates - to a significant (2 or more times) increase in the number of spores. Higher level of amylolytic and lipolytic activity of environmental isolates, compared with clinical, was shown. Differences in the changes in amylolytic and lipolytic
Контактное лицо: Халдеева Елена Владимировна, e-mail: [email protected]
activity of clinical and environmental A. niger isolates were noted with the increasing of cultivation temperature. High level of cellulase activity of clinical strains was revealed. The obtained data can be used to develop mechanisms for assessing the potential risk of contamination with molds and to confirm the etiological role of A. niger in the pathogenesis of the disease.
Key words: Aspergillus niger, growth rate, spore formation, lipolytic activity, amylolytic activity, cellulase activity
ВВЕДЕНИЕ
Грибы рода Aspergillus, в том числе Aspergillus niger, широко распространены в окружающей среде. Основным местообитанием и резервуаром Aspergillus spp. считают почву, где они выполняют функцию редуцентов органических субстратов [1]. Обильное образование спор, распространяемых воздушными потоками, приводит к появлению конидий этих грибов в воздухе, в том числе общественных зданий, жилых помещений, лечебных учреждений и т.д. Споры аспергиллов, постоянно присутствующие в воздухе, обладают термо- и засухоустойчивостью, имеют небольшие размеры и, попадая в организм человека, могут приводить к колонизации грибами слуховых проходов, носоглотки и легких. Вдыхание спор и последующая колонизация дыхательных путей могут обусловливать развитие аспергиллеза легких у людей, предрасположенных к оппортунистическим микозам, а также к микогенной сенсибилизации организма [2-7].
Природные штаммы Aspergillus отличаются генетическим разнообразием, при этом их вирулентность для человека зависит от многих факторов [7]. Среди известных факторов вирулентности Aspergillus spp. отмечают термотолерантность, т.е. способность роста при различных температурах (в т.ч. +37 оС), скорость роста, интенсивность спорообразования, протеазную активность и др.
Особенность диагностики заболеваний, вызываемых Aspergillus spp., обусловлена тем, что эти грибы достаточно часто присутствуют в посевах, однако доказать их этиологическую значимость не всегда возможно, и нередко присутствие плесневых грибов рассматривают как контаминацию либо первичного материала, либо самих посевов. До настоящего времени не существует тестов, позволяющих однозначно доказать клиническое или природное происхождение штамма, хотя их разработка, безусловно, могла бы заметно повысить эффективность диагностики и лечения таких инфекций.
Несмотря на широкую распространенность A. niger и частоту вызываемых им заболеваний, в частности отомикозов, остается неясным, имеют ли клинические изоляты A. niger те же характеристики, что и природные штаммы, или же попадание в организм человека приводит к проявлению особых свойств, а также могут ли природные штаммы представлять угрозу здоровью человека в качестве возбудителя грибковых инфекций.
Цель работы - изучение морфологических, биохимических и вирулентных особенностей клинических и природных изолятов A. niger.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования служили:
1. Клинические изоляты A. niger, в том числе: 9 штаммов, выделенных из слуховых проходов при ото-микозах (1 группа), и 27 штаммов, изолированных с кожных покровов при микозах (вторая группа).
2. Природные изоляты A. niger: 27 штаммов, выяв-
Ï--
ленных из объектов окружающей среды, в том числе: из почвы городской среды (6 штаммов) и из жилых помещений (21 штамм).
3. Музейный штамм А. niger У-1 из коллекции.
Идентификацию A.niger проводили по ККсЬ М.А. [8]. Отбор материала для выделения грибов из клинического материала осуществляли методом мазков и соскобов с последующим посевом на среду Сабуро и культивированием при 30±2 оС в течение 3-5 суток.
Отбор проб почвы для оценки обсемененности ми-кромицетами выполняли согласно ГОСТ 17.4.4.02-84. Полученную пробу суспендировали, из разведенной в сто раз суспензии выполняли посев газоном на среды Чапека и Сабуро. Пробы из жилых помещений отбирали методом мазков и соскобов с последующим посевом на среды Сабуро и Чапека. Культивирование проводили при температуре 30±2 оС. Колонии микроми-цетов подсчитывали и идентифицировали на 3-5 день.
Оценивали морфологические особенности выделенных штаммов: линейную скорость роста при различных температурах культивирования, интенсивность спорообразования. Выделенные изоляты тестировали на гемолитическую, липолитическую, амило-литическую и целлюлазную активность.
Для определения линейного роста А. nigerизмеряли диаметр колоний (от места посева до конца зоны роста мицелия), растущих на плотной питательной среде. Для этого исследуемый штамм уколом высеивали на поверхность чашки Петри со средой Сабуро. Чашки помещали в термостат на 28 оС и 37 оС на пять дней. Диаметр колонии измеряли в двух взаимоперпендикулярных направлениях в двух-трех повторностях на третий, четвертый и пятый день роста культуры.
Интенсивность спорообразования оценивали микроскопически путем подсчета количества конидий с помощью счетной камеры. Для этого лабораторным сверлом отбирали агаровые блоки с культурой, помещали их в пробирку с 5 мл физиологического раствора и встряхивали в течение 10 минут. Полученную суспензию микроскопировали, используя счетную камеру (камеру Горяева), подсчет проводили не менее чем в 5 каплях суспензии.
Липолитическую активность А. niger оценивали в тесте на гидролиз эфиров жирных кислот. Штаммы А. niger пересевали на индикаторную среду (содержащую твин-80) для определения липолитической активности [9]. Засеянные чашки Петри культивировали при 30 оС и 37 оС в течение 3-5 суток. На наличие липазы указывало образование вокруг штриха или колонии непрозрачной зоны кальциевых солей жирных кислот, освобожденных из твина.
Для выявления амилолитической активности использовали агаризованную среду с добавлением КН2Р04 и растворимого крахмала в качестве единственного источника углерода. На среду для определения амилолитической активности уколом высеивали исследуемые штаммы А. niger. Чашки помещали в термостат на 30 оС и 37 оС на пять суток.
Гидролиз крахмала обнаруживали после обработки агаровой пластинки раствором Люголя. Среда, содержащая крахмал, окрашивалась в синий цвет, если крахмал гидролизовался до декстринов. Зону гидролиза крахмала измеряли в миллиметрах от края колонии до границы светлой зоны, по величине зоны оценива-
ли амилолитическую активность [9].
Наличие гемолитической активности клинических штаммов устанавливали с помощью синтетической среды с добавлением крови. На среду уколом высеивали исследуемые штаммы А. niger. Чашки помещали в термостат при 28 оС на пять дней. Наличие гемолитической активности выявляли по наличию и размерам зон просветления вокруг растущей колонии грибов [9].
Наличие протеолитической активности оценивали с помощью синтетической среды (1К2НР04; 0,5 М§804; 0,0^е804) с добавлением яичного белка [9]. На среду уколом высевали исследуемые штаммы А. niger. Чашки помещали в термостат при 28 оС на пять дней. Наличие протеолитической активности определяли по образованию зон просветления вокруг колонии.
Определение целлюлазной активности проводили на среде Гетчинсона с фильтровальной бумагой в качестве единственного источника углерода. О цел-люлазной активности судили по степени деградации фильтровальной бумаги [9]. Рост грибов оценивали по 5-бальной системе: 1 балл - обнаружено прорастание отдельных спор; 2 балла - слабый рост мицелия, отсутствие разрушенных участков целлюлозы; 3 балла - обильный рост мицелия, в виде ветвящихся гиф; 4 балла - отчетливо виден рост грибов, хорошо развитый мицелий обволакивает целлюлозный субстрат; 5 баллов - визуально отмечается деградация субстрата.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Способность роста при 37 оС является одним из признаков потенциальной вирулентности штаммов плесневых грибов, в частности А. niger.
При культивировании клинических и природных изолятов А. niger на среде Сабуро при +37 оС выявили, что способностью роста обладали все изученные штаммы. В то же время линейная скорость роста большинства штаммов была ниже, чем при +30 оС. Незначительное увеличение скорости роста (не более 15%) демонстрировали два клинических штамма первой группы (У-12 и У-13) и три - второй (К-14, К-210, К-212), а также один природный (Ш-8) штамм. При этом скорость роста и величина колоний клинических и природных штаммов практически не отличались, за исключением природного штамма Ш-9, показавшего высокую скорость роста при 30 оС, и клинических штаммов первой группы У-15 и У-16, скорость роста которых была в 1,5 раза ниже, чем остальных клинических изолятов.
При культивировании на среде Чапека при +30 оС скорость роста колоний была существенно ниже, чем на среде Сабуро. При повышении температуры культивирования до +37 оС скорость роста на среде Чапека практически не менялась или незначительно повышалась.
Интенсивность спорообразования является одним из факторов, способствующих распространению грибов в окружающей среде и последующей колонизации. При исследовании интенсивности спорообразования обнаружили существенное (в 2 и более раз) увеличение количества спор при 37 оС для 36,1% клинических и 11,1% природных штаммов.
Снижение количества спор было отмечено у 55,5% и 40,7% клинических штаммов 1 и 2 групп соответственно и у 33,3% природных штаммов. Незначительное влияние температуры на спорообразование на-
блюдали у 18,5% и 22,2% клинических штаммов 1 и 2 групп соответственно и у 55,5% природных штаммов. Наиболее заметное увеличение интенсивности спорообразования под влиянием температуры установлено для клинических штаммов 2 группы (выделенных с кожи). Контрольный штамм У-1 при 37 оС демонстрировал очень слабый рост при полном отсутствии спорообразования.
Для А. niger, как и других видов Aspergillus, характерна секреция большого количества различных ферментов, многие из которых эволюционировали, чтобы обеспечить грибу питание за счет разложения растительных и животных остатков. Помимо этого, ферменты являются факторами вирулентности, разрушая структурные барьеры хозяина и, тем самым, облегчая инвазию в ткани.
Гемолитическая активность A. fumigatus, обусловленная присутствием гемолитического протеина Asp-гемолизина, изучена достаточно хорошо [10-11]. В литературе имеются упоминания о гемолитической активности экстрактов некоторых штаммов A. niger [11]. Однако в результате проведенных нами исследований среди изученных штаммов обладающих гемолитической активностью изолятов A. niger выявлено не было.
Липолитическая активность Aspergillus spp., обусловленная секрецией фосфолипаз, способствует нарушению мембраны клеток хозяина и их лизису [12]. Для A. fumigatus выявлена активность четырех фос-фолипаз (А-D), причем отмечено, что секреция фос-фолипаз у клинических изолятов A. fumigatus ниже, чем у природных штаммов [7, 13]. При изучении ли-политической активности клинических и природных штаммов A. niger подтвердили полученные ранее для A. fumigatus результаты. Так, было установлено, что ли-политическая активность природных изолятов A. niger была в 1,3-1,6 раз выше, чем клинических штаммов (Рис.1). При этом липолитическая активность клинических изолятов обеих групп при 30±2 оС практически не отличалась.
Рис. 1. Липолитическая активность некоторых клинических и природных изолятов А. п/дег при различных температурах культивирования.
Увеличение температуры культивирования до 37 оС приводило к снижению липолитической активности 92,6% природных и 69,4% клинических штаммов. В то же время повышение температуры обусловливало усиление липолитической активности 44,4 % клинических штаммов первой группы, а в случае 7,4% природных и 11,1% клинических штаммов уровень активности не
изменялся. В итоге при 37 оС липолитическая активность клинических и природных штаммов была практически одинаковой.
Похожие результаты были получены при изучении амилолитической активности. Природные штаммы А. niger в большинстве случаев (70,4%) при 30 оС демонстрировали значительно более высокий уровень амилолитической активности по сравнению с клиническими изолятами обеих групп. Однако при повышении температуры до 37±2 оС амилолитическая активность природных штаммов уменьшалась на 90-98%, тогда как клинических - в среднем на 30-40 % (Рис. 2), что, вероятно, связано с секрецией клиническими штаммами термостабильных амилаз.
Рис. 2. Амилолитическая активность некоторых клинических и природных изолятов А. п/дег при различных температурах культивирования.
Таким образом, сравнение амилолитической активности изолята при двух температурах культивирования может быть использовано в качестве простого теста, позволяющего определить происхождение штамма, исключить либо подтвердить его этиологическую значимость.
Протеолитическая активность как клинических, так и природных изолятов А. niger выражена слабо. При этом между клиническими и природными изо-лятами имелось некоторое отличие: протеолитическая активность при 30 оС отсутствовала у 74,1% природных изолятов и лишь у 22,2% и 25,9% клинических штаммов 1 и 2 групп соответственно (Рис. 3).
Рис. 3. Протеолитическая активность клинических и природных изолятов А. п/дег при темературе культивирования 30±2 оС на среде Сабуро.
Целлюлазная активность характеризует способность грибов к биодеструкции целлюлозосодержащих материалов. Как и другие аспергиллы, A. niger способен секретировать ферменты, разрушающие органические субстраты. Изучение целлюлазной активности клинических и природных штаммов показало, что большинство клинических штаммов проявляли высокую целлюлазную активность (на 4-5 баллов) и только 1 клинический штамм первой группы обладал более низкой активностью (3 балла). В то же время целлю-лазная активность природных изолятов варьировалась от 1 до 5 баллов. Так, максимальную активность (5 баллов) проявляли 55,6% природных штаммов, наиболее низкую - 3 (11,1%) природных изолята (Рис. 4).
Наиболее высокую целлюлазную активность среди природных штаммов демонстрировали изоляты, выделенные из почвы и жилых помещений с очагами биодеструкции, наименьшую - из жилых помещений без признаков биодеструкции.
ВЫВОДЫ
Способностью к росту при 37±2 оС обладают как клинические, так и природные изоляты A. niger.
Повышение температуры культивирования снижает скорость роста большинства как клинических, так и природных изолятов A. niger, при этом отмечено увеличение интенсивности спорообразования 36,1% клинических и 11,1% природных штаммов.
Природные изоляты A. niger при 30±2 оС проявляют более высокую липолитическую и амилолитическую активность по сравнению с клиническими штаммами.
Снижение амилолитической активности природ-
ЛИТЕРАТУРА
1. Марфенина О.Е., Фомичева Г.М. Потенциальные патогенные мицелиальные грибы в среде обитания человека. Современные тенденции // Микология сегодня / Под ред. Ю.Т.Дьякова, Ю.В. Сергеева. Том 1. М.: Национальная академия микологии, 2007: 235-266 [Marfenina O.E., Fomicheva G.M. Potencial'nye patogennye micelial'nye griby v srede obitaniya cheloveka. Sovremennye tendencii // Mikologiya segodnya / Pod red. Yu.T.D'yakova, YU.V. Sergeeva. Tom 1. M.: Nacional'naya akademiya mikologii, 2007: 235-266 (In Russ)].
2. Климко Н.Н., Шадривова О.В., Хостелиди С.Н. и др. Инвазивный аспергиллез: результаты многоцентрового исследования. Онкогематология. 2014; 9 (2): 13-19 [Klimko N.N., SHadrivova O.V., Hostelidi S.N. i dr. Invazivnyj aspergillez: rezul'taty mnogocentrovogo issledovaniya. Onkogematologiya. 2014; 9 (2): 13-19 (In Russ)].
3. Иванова Ю.А. Плесневые поражения кожи и мягких тканей в клинической практике. Проблемы медицинской микологии. 2012; 14 (3): 43-48 [Ivanova YU.A. Plesnevye porazheniya kozhi i myagkih tkanej v klinicheskoj praktike. Problemy medicinskoj mikologii. 2012; 14 (3): 43-48 (In Russ)].
4. Kousha M., Tadi R., Soubani A.O. Pulmonary aspergillosis: a clinical review. Eur. Respir. Rev. 2011; 20 (21): 156-72.
5. Chaturvedi R., Chaturved S. A brief survey of fungi as allergen in respiratory allergic patients by intradermal skin sensitivity test in Terai area. J. of Applied Biology & Biotechnology. 2013; 1 (03): 021-023.
6. Козлова Я.И., Васильева Н.В., Чилина Г.А. и др. Микогенная аллергия у жителей помещений, пораженных микромице-тами. Проблемы медицинской микологии. 2008; 10 (2): 17-21 [Kozlova YA.I., Vasil'eva N.V., Chilina G.A. i dr. Mikogennaya allergiya u zhitelej pomeshchenij, porazhennyh mikromicetami. Problemy medicinskoj mikologii. 2008; 10 (2): 17-21 (In Russ)].
7. AbadA., Fernandez-Molina J.V., Bikandi J., etal. What makes Aspergillusfumigatus a successful pathogen? Genes and molecules involved in invasive aspergillosis. Rev. Iberoam. Micol. 2010; 27: 155-182.
8. Klich M.A. Identification of common Aspergillus species. Utrecht: Centraalbureau voor Schimmelcultures. 2002: 116 pp.
9. Методы экспериментальной микологии / Под ред. В.И. Билай. «Наукова думка», 1982 [Metody ehksperimental'noj mikologii. «Naukova dumka». Pod red. V.I. Bilai. 1982 (In Russ)].
10. Berne S., Lah L., Sepcic K. Aegerolysins: Structure, function, and putative biological role. Protein Sci. 2009; 18: 694-706.
11. Nayak A.P., Green B.J., Beezhold D.H. Fungal hemolysins. Med. Mycol. 2013; 51:1-16.
12. Rementeria A., Lopez-Molina N., Ludwig A., et al. Genes and molecules involved in Aspergillus fumigatus virulence. Rev. Iberoam. Micol. 2005; 22: 1-23.
13. Shen D.K., Noodeh A.D., Kazemi A., et al. Characterisation and expression of phospholipases B from the opportunistic fungus Aspergillus fumigatus. FEMS Microbiol. Lett. 2004; 239: 87-93.
Поступила в редакцию журнала 29.06.2018
Рецензенты: Т.С. Богомолова, И.А. Рябинин
Рис. 4. Целлюлазная активность клинических и природных изолятов A. niger.
ных штаммов A. niger при повышении температуры культивирования до 37±2 оС может быть использовано в качестве критерия оценки этиологической роли гриба.
Клинические изоляты A. niger обладают выраженной целлюлазной активностью.
