CC BY
14УДК 616-002.828:161-056.3
МАРКЕРЫ СПОНТАННОЙ И ИНДУЦИРОВАННОЙ ИЗМЕНЧИВОСТИ ШТАММОВ - МИКО-АЛЛЕРГОПРОДУЦЕНТОВ FUSARIUM JAVANICUM VAR. RADICICOLA
журавлева н.П. (в.н.с.)*, Елинов н.П. (профессор кафедры), Васильева н.В. (директор института, зав. кафедрой), фролова Е.В. (зав. лаб.), соловьева г.и. (в.н.с.)
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2014
В настоящее время имеет место рост микозов и микоал-лергозов, обусловленных микромицетами-патогенами, включая грибы рода Fusarium. При фузариозах необходима и существенно значима разработка стандартных аллергодиагностических тест-систем, что влечет за собой создание банка штаммов грибов - продуцентов специфичных, активных и стабильных аллергенов.
Нами разработан способ сочетанного действия на штаммы F. javanicum var. radicicola (Fusarium j.v.r.) естественной и индуцированной селекции с дифференциальной термообработкой. При этом изучены морфобиологические маркеры изменчивости популяций Fusarium j.v.r. и доказан результативный отбор типичных клонов по морфологии колоний и постепенному росту активности прорастания спор (ПС) на каждом этапе многоступенчатой селекции гриба.
При этом показано, что на III-ем этапе отбора, в результате действия индуцированной селекции, в популяции селекционированного штамма (СШ) активность ПС возросла в результате расширения диапазона отбора активных клонов до 100% (против предыдущего естественного отбора до 80%). С применением штамма РКПГ 69/9/6/34, активного по маркеру ПС, на IVэтапе многоступенчатой селекции возросли все критерии изменчивости в результате сочетанного действия на штаммы Fusarium j.v.r. естественной и индуцированной селекций.
Из популяции СШ на IV этапе отобраны 11 штаммов с активностью ПС от 85 до 90%, превышающие среднюю активность исходного штамма (ИШ) на 61,5%.
Селекционированные штаммы специфичны, высокоактивны, стабильны в ряде генераций и рентабельны для использования в стандартных тест-системах в микоаллергодиагностике.
Селекционированные штаммы Fusarium j.v.r. депонированы в банке чистых культур грибов - продуцентов аллергенов в НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина.
Ключевые слова: активность прорастания спор, аллергопро-дуцент, спонтанная и индуцированная селекция, типичность морфологии колоний, Fusarium javanicum var. Radicicola
Контактное лицо: Журавлева Нина Петровна, Тел.: (812) 303-51-40
MARKERS AT SPONTANEOUS AND INDUCED VARIABILITY OF STRAINS -MYCOALLERGO-PRODUCENTS FUSARIUM JAVANICUM VAR. RADICICOLA
Zhuravleva N.P. (leading scientific collaborator), Yelinov N.P. (professor of the chair), vasilyeva N.v. (director of the institute, head of the chair), Frolova E.V. (head of the laboratory), solovjova G.I. (leading scientific collaborator)
Kashkin Research Institute of Medical Mycology of North-Western State Medical University named after I.I.Mechnikov, St. Petersburg, Russia
© Collective of authors, 2014
In present time take place a growth of the pathogenic and allergic diseases caused by micromycetes-pathogens including spesies of Fusarium genus. At fusarioses a development of standard test systems for allergodiagnostics is necessary and essentially significance, that involve the creation of the bank offungalstrains -producents of specific, active and stable allergens.
We have developed the method of combinated actionof natural and induced selection with differential thermotreatment in Fusarium javanicum var. radicicola (Fusarium j.v.r.). Under this morphobiological markers of Fusarium j.v.r. population's variability have been studied and proved efficient selection of typical clones on morphology of colony and a gradual increase of spore germination (SG) activity at each step of a multistep fungal selection.
It was shown, that on 3-ed step of the induced selection, as a result of action of differential thermal processing, activity of SG in populations of the selected strains increased significantly since induced selection considerably expanded the range of selection of active clones till 100%. 11 strains from 4th stage of multisteps selection had activity of SG from 85% to 90%, exceeds average activity of initial strain on 61,5%.
The selected strains are specific, highly active, stable on the selected markers in a number of generations and profitable for the use in standard test systems in mycoallergodiagnostic.
The selected strains of Fusarium j.v.r. are deposited in the Bank of pure fungal cultures - producents of allergens in Kashkin Research Institute of Medical Mycology.
Key words: activity of spore germination, allergoproducents, Fusarium javanicum var. radicicola, spontaneous and induced selection, typicalness of colonies' morphology
введение
Микотические инфекции нередко осложняют иммунодефицитные состояния больного. Наиболее часто этиологическими факторами при этом являются плесневые грибы, в частности, микромицеты рода Fusarium. Ныне патогенная роль этих микро-мицетов подтверждена на практике. Так, у пациента при диссеминированной инфекции были выделены Fusarium oxysporum, F. verticillioides, F. sporotrichoides [1], у больных астмой идентифицирован аллерген из
■
F. solani [2], который также был обнаружен при полипозе носа [3]. У пациента с злокачественной гематологией наблюдали инвазивный фузариоз [4, 5]. Из 65 больных у 44,4% был установлен микотический кератит, обусловленный инфекцией Fusarium spp. [69]. Известны заболевания у пациентов с иммуносу-прессией, в случае инвазивной и диссеминированной инфекции Fusarium spp., онихомикозами, паранихи-озами, кератомикозами [10-12].
Актуальность иммунологической диагностики таких микозов очевидна, но при этом необходимо создание банка для сохранения культур грибов -продуцентов аллергенов, состоящих из стандартных по маркерам морфологии колоний и активности прорастания спор, что, очевидно, будет рентабельно при наращивании стандартной биомассы мицелия при создании тест-систем для микоаллергодиагностики.
Цель - сравнить диапазон изменчивости клонов по маркерам макроморфологии (МК) и прорастания спор (ПС) в популяциях штаммов, выбранных при спонтанной и индуцированной селекции; отобрать из популяции варианты, наиболее перспективные для научно-практического использования.
материалы и методы1
Объекты исследования - 4 штамма Fusarium j.v.r.. Генеалогия их различна: исходный штамм ВКПГ - 69, выделенный с пораженной грибом кисти пациента; селекционированные штаммы, выделенные в разном диапазоне изменчивости популяции штаммов - 69/9 - при изучении спонтанной изменчивости ИШ 69; СШ-69/9/6 - при спонтанной изменчивости популяции штамма СШ 69/9; СШ-69/9/6/34 - после индуцированной изменчивости штамма СШ-69/9/6 в результате воздействия дифференциальной термообработки (ДТО).
Изучали клоны из моноспорового рассева, выше-представленных популяций штаммов по маркерам МК и ПС в 4-х ступенях селекций. При многоступенчатом отборе разработали способ сочетанного действия на ИШ и СШ Fusarium j.v.r. естественной и индуцированной селекции с ДТО.
Изменчивость клонов по маркеру МК исследовали на агаризованной среде Сабуро с 4% глюкозы после выращивания при 28 оС в течение 7 суток. Оценивали, в среднем, по 500 колоний каждого штамма.
Естественную изменчивость активности ПС изучали после выращивания клонов в жидкой среде Сабуро с 4% глюкозы и добавлением органического азота после встряхивания пробирок с микромице-том на шуттель-аппарате в течение 10 час. 30 мин. при 27 оС. Из популяции каждого штамма оценивали, в среднем, по 100 клонов. Количество ПС подсчитывали в процентах к общему числу спор в 10 полях зрения микроскопа МБИ-15. С целью отбора активных клонов по ПС провели статистическую обработку результатов по методу сумм, изложенному Плохинским И.Н. в кн.: «Биометрия».
Индуцированную изменчивость активности ПС
клонов в популяции изучали после дифференциальной термообработки штамма 69/9/6 по разработанной нами методике, представленной ранее [13].
результаты и обсуждение
На I ступени селекции изучали естественную изменчивость популяции исходного штамма. Популяция ИШ №69 по маркеру макроморфологии колоний была представлена двумя типами: I тип составлял 55,8%, а II тип - 44,2%. I тип отнесли к типичным колониям исследуемого микромицета. Размер колонии
- от 10 до 20 мм в диаметре, центр радиально-склад-чатый, край широкий, плоский. Колония бархатисто-войлочная, воздушный мицелий розовато-фиолетового цвета в центре, по краю белый; реверзум фиолетовый. II тип - колония небольшого размера
- 8 мм в диаметре, плоская, центр бархатистый, край войлочный, воздушный мицелий белого цвета; ре-верзум также белый.
При микроскопии нити мицелия септированные, макроконидии с 3 перегородками - 32 х 2 мкм, с 2 перегородками - 20 х 2 мкм; с одной перегородкой - 18 х 2 мкм; микроконидии - 8 х 2 мкм. Однако колонии II типа были фенотипическими, т.к. на последующих ступенях селекции процент МК II типа постепенно снижался. Так, на II ступени селекции он составлял 2%, а на последующих ступенях - III (индуцированной селекции) и IV (естественной селекции) популяция состояла из гомогенных клонов МК - I типа, стабильность которых сохраняется при проверке в 7 генерациях в течение 3-х лет.
Как при естественной, так и при индуцированной селекции исследовали изменчивость клонов в популяциях селекционированных штаммов по маркеру активности ПС в сравнении с популяцией исходного штамма.
Таблица
изменчивость при многоступенчатой естественной и индуцированной селекции клонов в популяциях селекционированных и исходного штаммов Fusarium j.v.r., по маркеру Пс
Рис. Естественная и индуцированная изменчивость активности прорастания спор в популяциях исходного и селекционированных штаммов Fusarium j.v.r. при многоступенчатой селекции. По оси абсцисс - активность прорастания спор, %. По оси ординат - количество вариантов с проросшими спорами, %.
а) исходный штамм РКПГ-69 - I этап селекции (естественная
изменчивость).
б) селекционированный штамм - РКПГ-69/9 - II этап селек-
ции (естественная изменчивость). в) селекционированный штамм - РКПГ-69/9/6 - III этап селекции (индуцированная изменчивость). г) селекционированный штамм - РКПГ-69/9/6/34 - IV этап селекции (естественная изменчивость)
Ступени селекции № штаммов Размах изменчиво-сти,% Средняя арифметическая, х, % Коэффициент изменчивости, CV, % Квадратичное отклонение, о,% Частота вариантов, %
плюс минус
I РКПГ-69 0-80 26±1,76 69,2 ±18,0 6±2,26 0
II РКПГ-69/9 0-80 37±1,73 39,2 ±14,6 3±2,41 0
III РКПГ-69/9/6 0-100 36±3,40 66,6 ±24,0 9±1,69 0
IV РКПГ-69/9/6/34 0-100 71.6±1,42 19,7 ±14,2 83±3,75 0
I, II, IV ступени - естественная селекция
III ступень - индуцированная селекция
Из рисунка и таблицы видно, что размах изменчивости этого маркера увеличился только на III ступени селекции, т.е. после индуцированной селекции. Так, на I и II ступенях естественного отбора клонов размах изменчивости был от 0 до 80%, а после индуцированной селекции увеличился на 20% и на III и IV ступенях составлял от 0 до 100%. При этом все критерии изменчивости возросли только на IV ступени в популяции штамма, отобранного на III ступени (после ДТО) - № 69/9/6/34 (рис., табл.). Модальный класс на IV ступени заметно сдвинулся в сторону более высокой активности ПС - от 60 до 80% с большим количеством активных клонов (до 56%) в сравнении с исходным штаммом, где модальный класс (с количеством клонов 45,7%) был со значительно низкой активностью ПС (от 0 до 20%).
На IV ступени селекции возросла средняя арифметическая активность ПС на 46%, что составляло 71,6%, а у исходного штамма на I ступени отбора -26,0% (табл.). Коэффициент изменчивости в популяции последнего штамма естественно уменьшился на 49,5% (IV ст.). В популяции штамма IV ст. значительно возросла частота «плюс» - вариантов, (в 13,8 раза), выходящих за пределы х ± 2ст (средней арифметической ± 2 квадратичных отклонения от средней арифметической исходного штамма I ст.), что составило 83%. Частота «минус»-вариантов не изменилась (0%) (рис., табл.).
На IV ступени селекции был взят СШ, полученный после индуцированной селекции, что расширило потенциальные возможности популяции при последующем естественном отборе клонов с маркером активности ПС. В результате из популяции СШ было отобрано значительное количество активных штаммов - 11 вариантов от 85-90%. Штаммы стабильны по учитываемым маркерам в ряде генераций в течение 3-х лет.
заключение
При многоступенчатой селекции изучено со-четанное действие спонтанной и индуцированной изменчивости популяций исходного и селекционированных штаммов. Показано, что на IV ступени естественной селекции в популяции штамма, вы-
деленного после индуцированной селекции (ДТО), расширился диапазон всех критериев изменчивости, что создало возможность селекционировать большое количество типичных МК и активных по маркеру ПС. Выделено 11 штаммов с активностью прорастания спор 85-90%, превышающих среднюю арифметическую исходного штамма на 61,5%. Штаммы стабильны по отобранным маркерам - типичности морфологии колоний и активности прорастания спор при проверке в 7 генерациях в течение 3-х лет.
Селекционированные штаммы специфичны, активны, стабильны и рентабельны, что является не-
обходимым условием в наработке микоаллергодиаг-ностических тест-систем. Ранее нами показано, что штаммы - продуценты аллергенов с интенсивным ПС дают возможность наращивать большой объем биомассы мицелия как источника активных аллергенов, что увеличивает возможность создавать рентабельные штаммы - продуценты аллергенов [14].
Штаммы депонированы в банке культур микро-мицетов - продуцентов аллергенов и сохраняются в коллекции грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина и, при необходимости, могут быть использованы в создании отечественных тест-систем.
цитированная литература
1. Linares-Linares M.Y., Jutierrez Trivino C., et al. A comparative study of CLSI M38-A2 and E-test methods for antifungal susceptibility testing of Fusarium spp. isolated from humans, animals and plants// Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Medicina, Bogota, Colombia; Blackwell Verlag GmbH. Mycoses 55. - 2012. - Suppl. 4.- P. 753.
2. Khosravi A.P., Fatahinia M., Shokri H., Yadegari M.H. Allergens from Fusarium solani identified by immunoblotting in asthma patients in Iran // Arh. Hig. Rada. Toksikol. - 2012 - Vol. 63, №1.- P.1-6.
3. Muñoz-Del-Castillo F., Jurado-Ramos A., et al. Fungal sensitization in nasal polyposis// J. Investig. Allergol. Clin. Immunol.
- 2009. - Vol. 19, №1. - P. 6-12.
4. Raad I.I., Hachem R.Y., et al. Posaconazole as salvage treatment for invasive fusariosis in patients with underlying hematologic malignancy and other conditions// Clin. Infect. Dis. - 2006. - Vol. 42, №10. - P. 1398-1403.
5. Fanci R., Pini G., et al. Refractory disseminated fusariosis by Fusarium verticillioides in a patient with acute myeloid leukaemia relapsed after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation: a case report and literature review // Rev. Jberoam. Micol. - 2013. - Vol. 30, №1. - P. 51-53.
6. Fata S., Fata S., Derakhshan A., et al. Mycotic keratitis in Mashhad, Iran // Mashhau University of Medical Sciences, Mycology Mashhad, Iran. Blackwell Verlag GmbH. Mycoses 55. - 2012. - Suppl. 4. - P. 497.
7. Gomez-Acosta F.A., Pazza - Giralch C.M., et al. Keratinolitic activity of Fusarium spp. isolated from humans, animals and plants// Pontifica Universidad J.averiana, Colombia Blackwell Verlag GmbH. Mycoses 55. - 2012. - Suppl. 4.- P. 223
8. Troke P., Obenga G., Gaujoux T., et al. The efficacy of voriconazole in 24 ocular Fusarium infections// Infection. - 2013.
- Vol. 41. - P. 15-20.
9. Sid-keungEdmond Ma, Kellie So, et al. Multi -country outbreak of fungal keratitis associated with a brand of contact lens solution: the Hong Kong experience//Int. J. Infect. Dis. - 2009. - Vol. 13. - P. 443-448.
10. Brasch J., Wohlfei E. Recalcitzant purulent paronychia and onychomycosis caused by Fusarium oxysporum// University Hospitals, Departament of Dermatology, Kiel, Germany. Blackwell Verlag GmbH. Mycoses 55. - 2012. - Suppl.4. - P. 550.
11. Inano S., Kimura M., et al. Combination therapy of voriconazole and terbinafine for disseminated fusariosis: case report and literature review// J. Infect. Chemother. - 2013. - Apr.6.
12. Kaur R., Maheshwari M. Hyperkeratotic warty skin lesion of foot caused by Fusarium oxysporum// Indian J. Dermatol. -2013.- Vol. 58, №2. - P. 159.
13. Журавлева Н.П., Блинов Н.П., Васильева Н.В. Особенности взаимоотношений вируса и микромицета - хозяина Fusarium javanicum var. radicicola W.R. при различных температурах // Проблемы медицинской микологии. - 2004.
- Т.6, №4. - С. 27-32.
14. Журавлева Н.П., Зуева Б.В., Блинов Н.П., и др. Способ выращивания селекционированного штамма Penicillium notatum №1043/2 для получения аллергена для диагностики микогенной сенсибилизации и аллергии // Патент на изобретение №2213772. - 2001. - С. 12.
Поступила в редакцию журнала 25.02.2014 Рецензент: А.А. Степанова
