CC BY
27УДК 616.992
ВИРУСНЫЙ ГЕНОМ в КЛЕТКАХ FUSARIUM JAVANICUM VAR. RADICICOLA WR.y ПАТОГЕННОГО ДЛЯ ЧЕЛОВЕКА
Н.П. Журавлева, Н.П. Блинов, С.Г. Давыденко, Н.В. Васильева, Е.В. Чихиржина, В,В, Семенов, Е.И. Костылева
НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, ГОУ ДПО СПб МАПО МЗ РФ, институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия
© Коллектив авторов, 2005
Разработаны условия периодического глубинного культивирования Fusarium javanicum van radicicola в колбах с целью оптимального внутриклеточного накопу\ения миковируса. В процессе выращивания мицелия в жидком неохмеленном сусле отмечена корреляция между максимальной репродукцией внутриклеточного вируса гриба и такими параметрами, как масса глубинных спор в куль-туральной жидкости, масса внутриклеточных вирусных частиц, зона лизиса тест-кулътуры после закапывания культуралъной жидкости на ее поверхность. В результате определен период глубинного выращивания гриба в течение 16 суток; биомассу такого мицелия использовали для последующего выделения и изучения нуклеиновых кислот миковируса «гриба-хозяина».
В итоге обнаружена высокомолекулярная фракция, размером около 10 тысяч пар нуклеиновых оснований, устойчивая к ДНКазе, и, по предварительным данным, представляющая собой двунитевую РНК (ds-PHK).
Ключевые слова: ДНКаза, миковирус Fusarium javanicum var. radicicola, РНКаза, цитоморфология, электронная микроскопия
VIRUS GENOM IN CELLS OF FUSARIUM JAVANICUM VAR. RADICICOLA WR. - THE HUMAN PATHOGEN
N.P. Zhuravleva, N. P. Yelinov, S.G. Davydenko, N.V. Vasilyeva, Ye.V.Chihirjina, V.V. Semenov, Ye.l.Kostyleva
Kashkin Research Institute of Medical Mycology, Saint Petersburg Medical Academy of Postgraduate
Education, Russia
© Collective of authors, 2005
Conditions of periodic deep cultivation ofFusarium javanicum var. radicicola in retorts for optimal intracellular accumulation of mycovirus have been worked out. In the growing mycelium process in non-liop beer marked a correlation between maximal reproduction intracellular fungal virus and such parameters as mass of the depth spores in cultural fluid, mass of intracellular virus particles, lysis's zone of test-culture after the culturalfluid dropping on its surface.
On the whole exposition's time to grow the culture has been determinated (16 days); biomass of such mycelium have used for the following pick up and study nycleimc acids of virus particles.
In result the high molecular fraction (10000 nb) stabled to DNAasa and according to preliminary data's presenting itself the double strand RNA (ds-RNA).
Key words: cytomorphology, DNAasa, electron microscopy, mycovirus Fusarium javanicum var. radicicola, RNAasa
ВВЕДЕНИЕ
В цитоплазме многих дрожжей и плесневых грибов обнаружены вирусоподобные симбионты, для которых характерен сегментированный геном, обычно представленный несколькими видами двуните-вой-РНК (ds-PHK) [1-5]. Однако у Agricus bisporus, Selerophthora macrospora и Pleurotus ostreatus, геном вируса состоит из единственной линейной нити РНК (ss-PHK) [6-8]. Редко, но встречаются микромицеты, вирусный геном которых представлен двунитевой ДНК (ds-PHK), например, у Rhizidiomyces и Rhizocto-nia solani [9,10].
Молекулярная масса ds-PHK миковирусов различна и зависит от рода, вида и штамма «гриба-хозяина», У Botrytis cinerea (штамм 25) обнаружены нуклеиновые кислоты (НК) — ds-PHK с молекулярной массой (ММ) 1,4; 2; 8,3 киллооснований (1<Ь), у другого штамма №55 MM ds-PHK - 1,8 1<Ь [11, 12]. У разных видов мукоров размеры MM ds-PHK могут достигать от 2,48 до 6,101<Ь, у Fusarium graminearum - 7,5 l<b, у Helicobasidium тотра они могут быть малые — 2,0-2,51<Ь, средние - 8,01<Ь и крупные - более 10 kb [5,13,14]; 5 штаммов Rhizopus, выделенных из 27 изолятов, представлены от 1 до 5 несхожими ds-PHK с ММ 2,2-14,8 1<Ь. Самый крупный сегмент ds-PHK - 14,8 kb обнаружен у R. microsporus [15].
Наиболее полно изучена система киллерных симбионтов дрожжей Saccharomyces. cerevisae. Она представлена двумя видами вирусных частиц (ВЧ) с дву-нитевыми РНК, упакованными в белковую оболочку. При введении дрожжевой ds-PHK в организм млекопитающих происходит индукция синтеза интерферона, оказывающего противовирусное действие, повышается иммунологическая сопротивляемость организма [16,17]. Таким образом, ds-PHK является потенциальным иммуномодулятором и интерферо-геном. Поэтому не угасает интерес к поиску новых объектов, образующих большие количества ds-PHK.
Ныне известны вирусы многих фитопатогенных грибов. Нами впервые обнаружены ВЧ у патогенного для человека гриба Fusarium javanicum var. radicicola (F.j.v.r.)[ 18,19].
Целью нашего исследования было изучение генома вируса в клетках «гриба-хозяина» Hj.v.r., и необходимым условием достижения этой цели стало накопление достаточно большого количества ВЧ в мицелии гриба при оптимальных условиях культивирования с последующим проведением запланированных исследований с НК, выделенными из мицелия.
ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Тест-культура — штамм гриба 69/9/6 F.j.v.r., выращенный на агаризованной среде сусло pH — 4,5 при t 28 °С в течение 3 суток и содержащий ВЧ.
Выращивание микромицета проводили периодически глубинно в неохмеленном пивном сусле с 5,7% сахарозы, при pH 4,7, в колбах емкостью 750 мл, при постоянном встряхивании на шуттель-аппарате (100 об/мин) при температуре 27 °С в течение 24 суток. Названную среду применяли в 2-х вариантах: без внесения дрожжевого экстракта (№ 1) и с добавлением его в количестве 2 мл на 100 мл среды (№ 2).
Цитоморфологию гриба изучали в окрашенных метиленовым синим препаратах, приготовленных из КЖ через 2, 3,6,11,13,16, 24 суток, при этом использовали биологический микроскоп МБИ-15 [20].
Проведено электронномикроскопическое исследование ВЧ в мицелии, выращенном на средах № 1 и № 2, при максимальном накоплении глубинных спор в культуральной жидкости и интенсивном лизисе тест-культуры после закапывания КЖ на поверхности ее газона. При этом мицелий с 2-х сред обрабатывали по общепринятой методике: фиксация в смеси глутарового альдегида и осмия.
После осмирования материал обрабатывали в 1% растворе галловой кислоты в фосфатном буфере 0,15 М, pH 7,3 в течение 30 мин на предмет повышения контрастности мембранных структур и ВЧ. После промывания и обезвоживания в серии спиртов и ацетоне материал заливали в аралдиг. Срезы изготавливали на ультратоме (LKB, Швеция), помещали на медные сетки, контрастировали по Рейнольдсу [21]. Материал анализировали в электронном микроскопе JEM-100 SX. Известно, что ВЧ локализуются в цитоплазме, вакуолях и спорах «гриба-хозяина», поэтому было изучено накопление глубинных спор в динамике роста и развития микромицета при глубинном выращивании. Критериями контроля оптимального накопления спор послужили: pH КЖ, цито-морфология развития гиф и глубинных спор, лизис ТК при закапывании КЖ на поверхность ее газона.
Для изучения генома внутриклеточного вируса культуры F.j.v.r. использовали 16 суточный мицелий, который отделяли от КЖ фильтрованием через марлю, промывали дважды ТЕ-буферным раствором
(10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0), излишек влаги удаляли фильтровальной бумагой.
Разрушение клеток производили после замораживания 5 г мицелия в жидком азоте и последующего растирания пестиком в фарфоровой ступке до гомогенного состояния, постепенно добавляя 2 мл буфера LETS (0,1 m LiCl, 10 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,5% SDS), 0,5 мл суспензии переносили в пробирку эппендорфа и добавляли 0,5 мл фенола, насыщенного LETS, перемешивали 1 мин на вортексе, центрифугировали 10 мин при 14000 об/мин. Отбирали супернатант и добавляли к нему равный объем хлороформа, перемешивали 1 мин на вортексе, отбирали супернатант и добавляли к нему равный объем смеси хлороформа с изоамиловым спиртом в соотношении 24:1. Верхнюю фазу отбирали, добавляли к ней 2,5 объема 96% этанола и оставляли на ночь при 20 °С для осаждения. Затем пробу центрифугировали 10 мин при 14000 об/мин. Осадок растворяли в буфере ТЕ с последующим переосаждением дважды 2,5 объемами 96% этанола (ночь — при 20 °С), осадок растворяли в буфере ТЕ и проводили высаливание до концентрации 2 М и 4 М LiCl в течение ночи при 4 °С. Пробы центрифугировали 10 мин при 14000 об/ мин, дважды переосаждали 2,5 объемами 96% этилового спирта (ночь - при 20 °С). Осадок растворяли в буфере ТЕ.
Идентификацию НК проводили электрофорети-чески в буфере TBE с использованием 1% или 1,4% агарозного геля. НК окрашивали бромистым этиди-ем.
Для более точной характеристики полученных НК пробы обрабатывали ферментами — РНКазой А и ДНКазой I. РНКаза А (Bovine Pancreas, фирма Sigma, США) выделена из поджелудочной железы быка. Рабочий раствор — 15 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5. Конечная концентрация - 10 мкг/мл. ДНКаза I - панкреатическая (фирма Worthington, США). Рабочий раствор — 1 mJVI MgCl2, 1 mM Tris-HCl, pH 7,5. Конечная концентрация - 5 мкг/мл.
В первом случае к 20 мкл пробы добавляли 5 мкл РНКазы А и инкубировали 40 мин при 37 °С; во втором - к 20 мкл пробы добавляли 2 мкл ДНКазы I и 1 мкл РНКазина; инкубировали 30 мин при 37 °С. РНКазин - сильный ингибитор РНКаз. Данный белок выделяют из печени крыс или человеческой плаценты. Он эффективно ингибирует РНКаЗу при трансляции в бесклеточной системе и его широко используют в ферментных реакциях. Все пробы для электрофоретического анализа готовили следующим образом. Осадок растворяли в буфере ТЕ, затем добавляли буфер для проб (0,25% — бромфеноловый синий, 0,25% — ксилолцианол, 30% — глицерин) -1/6 от объема пробы.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты мониторинга накопления ВЧ в КЖ зависел от различных условий периодического культивирования «гриба-хозяина» F.j.v.r. на протяжении 24
суток (Рис.1) при аерации КЖ в процессе роста гриба на средах № 1 и № 2.
В динамике роста и развития гриба на обеих средах наблюдали постепенное накопление ВЧ до 3 суток культивирования, что проявлялось в единичных негативных колониях (НК) (+) на поверхности ТК на 1 сутки до слившихся НК (+++) на 2 сутки и полного лизиса ТК (++++) на 3-й сутки (Рис.1); рН КЖ на средах № 1 и № 2 была одинаковой - 4,5-4,7. В последующий период культивирования гриба на средах № 1 и № 2 отмечали следующие отличия по накоплению ВЧ в КЖ. После 3 суток культивирования гриба на среде № 1 накопление ВЧ в КЖ значительно падало и к 16 сут. на поверхности ТК образовывалось много отдельных НК (++) вместо полного лизиса ТК (++++). В то же время на среде № 2, в период от 3 до 16-24 суток, наблюдали полный лизис (++++) ТК (Рис.1,2).
При цитологических исследованиях гриба на средах № 1 и № 2 в период от 1 до 6 суток выращивания отмечали одинаково равномерное прорастание спор, первичных гиф и развитие мицелия, окрашивающихся метиленовым синим в синий цвет, что подтверждало присутствие РНК в гифах. После 6 суток культивирования микромицета наблюдали значительные морфологические различия гриба а зависимости от сред. Так, на среде № 2 отмечали более интенсивное развитие разных типов гиф (тонких - I типа, утолщенных - II типа), большое количество глубинных свободных спор в КЖ к 14 суткам и масса набухших спор и мицелия к 16 суткам, в сравнении со средой № 1 (Рис.3). Цитоплазма гиф и спор в этот период окрашивались метиленовым синим в интенсивно-синий цвет, что подтверждало большое содержание РНК в них. От 16 до 20 суток в КЖ (среда № 2) отмечали набухшие, полулизированные и лизированные гифы и массу набухших спор, часть из которых окрашивалась метиленовым синим в бледно-голубой цвет, что увязывалось со снижением содержания РНК в них; базофилия цитоплазмы также заметно снижалась. Цикл развития гриба на среде № 2 закончился к 24 суткам массой лизированных гиф и глубинных спор. На среде № 1 пик образования свободных глубинных спор отмечали на 20 сутки и в значительно меньшем количестве, чем на среде № 2. Цикл развития гриба на среде № 1 до состояния лизиса гиф и спор завершился на трое суток позже, чем на среде № 2.
При исследовании ультратонких срезов мицелия, выращенного на средах № 1 и 2, на электронном микроскопе обнаружено следующее: ВЧ как на обеих средах представлены электронноплотными частицами, которые локализовались в цитоплазме и вакуолях, но при этом на 16 сутки выращивания гриба на среде № 1 в клетках отмечали небольшое количество ВЧ, а на среде № 2 в этот же период - большую их концентрацию (Рис.4).
В результате проведенных исследований оптимальная среда № 2 определена для накопления ВЧ, Для нее, в отличие от среды № 1, на 16 сутки культивирования гриба характерно:
1. сплошной лизис тест-культуры при закапывании КЖ на ее газон в виде петли (по центру);
2. образование массы свободных набухших глубинных спор;
3. большое количество внутриклеточного вируса в виде электронноплотных частиц в клетках «гриба-хозяина» F.).v.r.
При этом в указанный период на среде № 2 масса внутриклеточных ВЧ коррелирует с образованием большого количества свободных набухших глубинных спор и полным лизисом ТК при закапывании КЖ на поверхность ее газона.
В итоге оптимальная среда N° 2 для накопления внутриклеточного вируса была использована для выращивания мицелия с целью изучения генома ВЧ в клетках «гриба-хозяина». Для этого проведено трехкратное выращивание мицелия с последующими экстракциями из него нуклеиновых кислот и анализом их с помощью электрофореза в агарозном геле. После разрушения мицелия в жидком азоте, проведения фенольной депротеинизации, очистки препарата хлороформом и переосаждения этанолом последовательно высаливали НК 2-х и 4-х молярными растворами лития хлорида. Известно, что у S. cerevi-siae при высаливании 2М раствором лития хлорида происходит осаждение хромосомной ДНК и рибо-сомальной РНК, а при высаливании 4M раствором в осадок выпадает двунитевая РНК [22]. После проведения электрофоретического анализа НК гриба мы обнаружили высокомолекулярную фракцию L размером около 10 тысяч пар оснований амплифициро-ванной нуклеиновой кислоты, выпадавшую в осадок в результате высаливания НК 2М и 4 М хлористым литием (Рис.1, дорожки 9 и 10). Эта фракция L была обнаружена во всех независимых изолятах НК. Размер фракции L был определен по положению полос контрольного маркера (фирма Fermentas) с указанием молекулярной массы соответствующих фрагментов ДНК (Рис.5, дорожки 5 и 11).
Известно, что в большинстве случаев геном ВЧ представлен двунитевой РНК, а не ДНК. Для более точной характеристики полученных фракций НК мы провели обработку фракций — РНКазой А и ДНКа-зой I в присутствии РНКазина.
На Рис. 2 представлены данные электрофореза НК после обработки РНКазой А и ДНКазой I, соответственно. Видно, что лишь в одном случае при обработке ДНКазой I (Рис.6, дорожка 5) произошло разрушение фракции L, что может свидетельствовать о том, что эта фракция представлена ДНК, а не РНК.
Мы провели независимое выделение НК, осаждение 4 М хлористым литием, обработку ферментами и получили тот же результат (Рис. 7, дорожка 1). Произошло разрушение фракции L только под действием ДНКазы I.
Однако известно, что очень часто коммерческие препараты ДНКазы не являются полностью очищенными от РНКаз. Очистка от РНКаз - очень сложная
задача. В молекулярной биологии для ингибирования РНКаз применяют специфический белок РНКазин. Мы использовали РНКазин при обработке проб 1 и 2 РНКазой А и ДНКазой I. После обработки пробы 1 РНКазином, ДНКаза I перестала разрушать фракцию Ь (Рис. 8,9).
Возможно, что фракция I, представляет собой двунитевую РНК, устойчивую к действию РНКазы.
Использованная нами в работе РНКаза А разрушает преимущественно однонитевые участки. Для разрушения двунитевых участков надо использовать другую РНКазу. Но вопрос о ДНКовом составе этой фракции также нельзя считать закрытым.
Для дальнейшего изучения состава ВЧ необходимо выполнить секвенирование выделенной нуклеиновой кислоты.
ЛИТЕРАТУРА
1. Wickner R.B. The killer double-stranded RNA plasmids of yeast // Plasmid.- 1979,- Vol. 2.- P. 303-322.
2. Van der Lende T.R., Harmsen Go S.J., Wessel J.G.H. Double-stranded RNA mycoviruses in myce lium of Pleurotus ostreatus //FEMS Microbiology Letters.-1995.- Vol.125, N 1,- P.51-56.
3. Compel P., Papp I., Bibo M., et A Genetic interrelationships and genome organization of double elements of Fusarium poae // Virus Genes.-1999,-Vol. 18, №l.-P.49-56.
4. Chu Yeon-Mee, Jeon Jae-Jin, Yea Sand-Jin, et al. Double-stranded RNA Mycovirus from Fusarium graminearum //Applied and Environmental Microbiology.-2002.- P.2529-2534.
5. Ikeda K., Nakamura H., Arakawa M., et al. Dynamics of double-stranded RNA segments in a Helkobasidium mompa clone from a tulip tree plantation // FEMS Microbiol., Ecology. / In Press Corrected proof, Aviable online 11-2004.
6. Revill P.A., Davidson A.D., Wright P.J. The nucleotide sequence and genome organization of mushroom bacilliform virus: a single-stranded RNA virus of Agaricus bisporus (Lange) // Imbach.Virology.- 1994.- Vol.202.- P. 904-911.
7. Yokoi Т., Takemoto V., Suzuki M., et al. The nucleotide sequence and genome organization of Sclerophtora macrospora virus В// Virology.- 1999.- Vol. 264.- P. 374-349.
8. Hyun Jue Vit.j Dongbin L., Hyun-Sook L. Characterization of a novel single-stranded RNA mycovirus in Pleurotus ostreatus II Virology.- 2003,- Vol. 314, N 1,- P. 9 -15.
9. Dawe V.H., Kuhn C.W. Isolation and characterization of double-stranded DNA mycovirus infecting the aquatic fungus, Rliizid-iomyces II Virology.- 1983,- Vol. 130.- P. 21-28.
10. Zhang J., Liang P. A double-stranded DNA mycovirus in Rhizoctonia solani I/ Clin.J.Virol.-1993.- Vol.9.- P.386-389.
11. Vilches S., Castillo A. A double-stranded RNA mycovirus in Botrytis cunerea II FEMS Microbiology Letters.-1997.- Vol.155.-P.125-130.
12. Castro М-, Kramer K, Valdiviul L., et al. A new double-stranded RNA mycovirus from Botrytis cunerea // FEMS Microbiology Letters.-1999.- Vol.175, N 1,- P.95-99.
13. Vagvolgy (.., Magyar К., Papp Т., etal. Detection of double-stranded RNA molecules and virus-like particles in different Mucor species if Kluwer Academic Publishers. Printed in the Netherlands. Antonie van Leeuwenhoek.-1998.- Vol.73, № 2.- P.207-210.
14. Chu Y.M., Jeon /./., Yea S.J. etal. Double-stranded RNA mycovirus from Fusarium graminearum If Appl. Environ. Microbiol-2002. - Vol.68,№5.-P.2529-2534.
15. Papp Т., Nyilasi L, Fekete C., et al. Presence of double-stranded RNA and virus-like particles in Rhizopus isolates // Can. J. Microbil.-2001.- Vol.47.- P.443-447.
16. Носик H.H., Ершов Ф.И. Свойства двуспиральной РНК как индуктора интерферона //Вопросы вирусологии.- 1984.- № 5,- С. 599-603.
17. Булычев А.Е., Гончарова Е.П., Пьянкова О.Г. и др. Некоторые аспекты интерферонообразования в организме белых мышей // Вестник Российской Академии медицинских наук.-1998.-№4.-С.34-37.
18. Журавлева Н.П., Елинов Н.П., Семенов В.В., Зуева Е.В. Вирусные частицы в клетках Fusarium javankum var. radkkola WR II Ж. Проблемы медицинской микологии .-2001.-Т.З, №2.-С.62-63.
19. Журавлева Н.П., Елинов Н.П., Семенов В.В., Сироткин А.К., Зуева Е.В. Индукция вирусных частиц в клетках Fusarium javankum var. radkkola WR и их свойства // Ж. Проблемы медицинской микологии .-2004.-Т.6, №3.-С. 44-54.
20. Журавлева H.H., Танкевич М.Е., Жукова P.A., Большакова E.H. Цикл разивтия и цитоморфологические особенности продуцента олеандомицина Streptomyces antibioticus // Ж. Антибиотики.- 1982.- № 9.- С.3-5.
21. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electronopaque stain in microscopy // J. of Cell Biology.-1963.-Vol.17.-P.208-212.
22. Нестерова Г.Ф. Биологическая активность двунитевых РНК // Биотехнология.-1990.- №4.- С.7-12.
Поступила в редакцию журнала 22.02.2005 Рецензент:
ЭКСП1 :НТ л
По оси абсцисс: время выращивания, сутки
По оси ординат: интенсивность лизиса тес-культуры (ТК), условные единицы условные единицы:
1. единичные негативные колонии (НК) (+);
2. много НК (++);
3. слившиеся НК (+++);
4. полный лизис (++++). 3 6 11 13 16 24
Условные обозначения:
на среде № 1 Ф на среде № 2
Рис. 1. Накопление внутриклеточного вируса Я/у.г. при различных условиях глубинного периодического выращивания микромицета
4 2
3
2 1
1
Рис. 2. Литическое действие вирусных частиц (ВЧ) при закапывании культуральной жидкости (КЖ) на тест-культуру (ТК) на 2-х средах, а. Контроль - без закапывания КЖ (отсутствие лизиса газона ТК).
б. Опыт - закапывание КЖ со среды № 1 - 16 сутки
выращивания гриба (отсутствие полного лизиса ТК в зоне закапывания).
в. Опыт - закапывание КЖ со среды № 2 - 16 сутки
выращивания гриба (полный лизис ТК в зоне закапывания) (++++).
Рис. 3. Цитоморфологические особенности микромицета -16 сутки глубинного выращивания на разных средах (х1 ООО), а. Тонкие и редко набухшие гифы мицелия, окрашенные метиловым синим (м.с.) в синий цвет и небольшое количество свободных глубинных спор, б. Гифы мицелия преобладают, утолщенные, есть полулизированные, окрашены м.с. большей частью в интенсивно синий цвет, масса свободных набухших глубинных спор.
Рис. 4. Внутриклеточные ВЧ в ультратонких срезах мицелия на 16 сутки глубинного выращивания на 2-х средах, а. Среда № 1 - небольшое количество электронноплотных частиц (ЭЧ) (х24700). б. Среда № 2 - масса ЭЧ (х46800).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ М И КОЛО [ Ш
супернатант осадок
м м
1 .
йк 3
2,5
2
1,5
1
I
0,75
Дорожки 1 2 3 4 5 7 8 910 111213 ТТ ТТ
2м4м2м4 2м4м2м4м
Рис. 5. Выделение фракции нуклеиновых кислот из грибного мицелия I. - фракция нуклеиновых кислот М - маркер (размеры фрагментов ДНК: 10, 8,6,5,4, 3,5 3,2,5,2,1,5,1, 0,75 тыс, пар оснований) 2М, 4М - молярность раствора лития хлорида при переосаждении
Дорожки 1 2 3 4
1_
Пробы 1234 567 89 10
Рис. 6. ДНКаза I и РНКаза А не расщепляют фракцию I. ни в осадке, ни в супернатанте после осаждения 2М раствором лития хлорида 1- маркер
2 -осадок (О) после осаждения 2М р-ром лития хлорида,
обработанный ДНКазой I 3 — (О) после осаждения 2М р-ром лития хлорида, без обработки ферментами
4 — (О) после осаждения 2М р-ром лития хлорида,
обработанный РНКазой А
5 — (О) после осаждения 4М р-ром лития хлорида,
обработанный ДНКазой I 6 — (О) после осаждения 4М р-ром лития хлорида, без ферментов
7 — (О) после осаждения4М р-ром лития хлорида, обработанный РНКазой А
8 — супернатант (С) после осаждения 2М р-ром лития
хлорида, обработанный ДНКазой I
9 — (С) после осаждения 2М р-ром лития хлорида, без
обработки ферментами 10 — (С) после осаждения 2М р-ром лития хлорида, обработанный РНКазой А
Рис.7. Расщепление ДНКазой I, но не РНКазой А, фракции 1_ без РНКазина в среде 1 -(С) после осаждения 4М р-ром лития хлорида, обработанный ДНКазой I
2 — маркер
3 — (С) после осаждения 4М р-ром лития хлорида, без обработки ферментами 4 — (С) после осаждения 4М р-ром лития хлорида, обработанный РНКазой А
Дорожки 1 2 3 4 5 6 7 8
I
проба 1
проба 2
Рис.8. Эффект применения РНКазы А или ДНКазы I в присутствии (проба 1) или отсутствии (проба 2) в реакционной среде РНКазина. 1 - (О после осаждения 4М р-ра лития хлорида, обработанный РНКазой А (проба 1) 2 — (С) после осаждения 4М лития хлорида, обработанный ДНКазой I (проба 1) 3 — (С) после осаждения 4М лития хлорида, обработанный повторно ДНКазой I (проба 1) 4 — (С) после осаждения 4М лития хлорида без обработки ферментами (проба 1)
5 - маркер
б — (О) после осаждения 4М лития хлорида без обработки ферментами (проба 2)
7 — (О) после осаждения 4М лития хлорида, обработанный ДНКазой I (проба 2)
8 — (О) после осаждения 4М лития хлорида, обработанный РНКазой А (проба 2)
Дорожки 1 2 3 4 М 5 6
Рис. 9. Обработка РНКазой А и ДНКазой I пробы 1, с РНКазином в реакционной среде
и без него (проба 2)
1- (С) после осаждения 4М р-ром лития хлорида, обработанный РНКазой А (проба 1) 2 — (О) после осаждения 4М р-ром лития хлорида, обработанной ДНКазой I (проба 1) 3 - (О) после осаждения 4М р-ром лития хлорида, обработанный повторно ДНКазой I (проба 1) 4 — (С) после осаждения 4М р-ром лития хлорида без обработки ферментами (проба 1)
5 — маркер
б — (С) после осаждения 4М р-ром лития хлорида, обработанный ДНКазой I (проба 2) 7 — (С) после осаждения 4М р-ром лития хлорида, обработанный повторно ДНКазой I (проба 2)
