CC BY
13
4. Перетягин О.А., Сердюк В.Н. Влияние оксида-тивного стресса на степень воспалительной реакции и уровень оксипролина и ткани корнеосклеральной зоны после экспериментальной склеротомии // Офталь-мол. журн. - 2006. - № 6. - С. 76 - 78.
5. Перетягин О.А., Сердюк В.Н. Исследование окислительного воздействия на функциональные группы белков склеры больных первичной откры-тоугольной глаукомой // Офтальмол. журн. - 2006. - № 3.-С. 99-101.
6. Сергиенко Н.М., Павлюченко К.П. Возможности прогнозирования и профилактики воспалительных осложнений после антиглаукоматозных операций // Офтальмол. журн. - 1992. - № 3. - С. 35 - 39.
7. Burdon R. H. Free radicals in cell proliferation // Rice-Evans C.A., R.H. Burdon Free radical damage and its control. - Elsevier Science, 1994. -P. 115- 185.
8. Eyre D. R. Cross-linking in collagen and elastin // Ann. Rev. Biochem. - 1984. -Vol. 53.-P. 717-748.
9. Hikichi Т., Ueno N., Chakrabarti B. Evidence of
cross-link formation of vitreous collagen during experimental ocular inflammation // Grafes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. - 1996. - Vol. 234. - P. 47 - 54.
10. Milne P. J., Zika R. G. Crosslinking of collagen gels: photo-chemical measurement // SPIE Ophthalmic Technologies. - 1992. - Vol. 1644. - P. 115 -124.
11. Murrell G. Radicals, granuloma formation and fibrosis // Winyard P. G.. Blake D. R., Evans C. H. Free radicals inflammation. - Basel, 2000. - P.195-205.
12. Sady C., Khosrof S.. Nagaraj R. Advanced Maillard reaction and crosslinking of corneal colla in diabetes // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1995. - Vol. 214.-P. 793-797.
13. Spoerl E., Huhle M., Seiler T. Induction of crosslinks in corneal tissue // Exp. Eye Res. - 1998. - Vol. 66. -P. 97 - 103.
14. Zhao H. R., Nagaraj R. H., Abraham E. C. The role of a- and e-amino groups in the glycation-mediated cross-linking of yB-crystallin // J. Biol. Chem. - 1997. -Vol. 272. - P. 14465 - 14469.
УДК611.6:611.012-092.9 I. О. Македонський
ВПЛИВ ПРИЗНАЧЕННЯ АДР1АМЩИНУ НА ФОРМУВАННЯ СПИННОÏ ХОРДИ ЕМБР1ОН1В ЩУР1В
Днтропетровська мкька клтчна лiкарня № 3 iM. проф. М. Ф.Руднева (гол. лкар - к. мед. н. 1.О. Македонський)
Ключовi слова: ембрюни, моде-лювання уроджених вад, адр1ам1-цин, спинна хорда
Key words: embryons, modeling of congenital defects, adriamycin, spinal cord
Резюме. Проведено экспериментальное моделирование пороков развития аноректальной и урогенитальной зон у эмбрионов крыс путем внутрибрюшинного введения адриамицина. Отмечено достоверное снижение массы, объема тела эмбриона, изменение объема спинной хорды. Аномальное увеличение объема спинной хорды в определенные периоды эмбриогенеза может влиять на органогенез плода с формированием широкого спектра пороков развития эмбрионов (аноректальные, уроге-нитальные, гастро-интестинальные, костно-мышечные). Summary. Experimental modeling of anorectal and urogenital defects in the rats' embryons were performed with the use of intraperitoneal adriamycin administration. A reliable decrease of weight, body volume, changes in no-tochord volume in experimental embryons were detected. The abnormal increase in notochord volume during some periods of embryogenesis may influence fetus organogenesis with formation of a wide spectrum of birth defects ( anorectal, urogenital, gastrointestinal, musculoskeletal).
Тяжю урогештальш аномали, як правило, виникають разом з аноматями шших оргашв та систем, наприклад, аноректальними аноматями та аноматями хребта [1,4,9]. Так, VATER-асощащя вперше описана Quan та Smith (1973) як спонтанна мутащя з ураженням хребта, стра-воходу, анальною атрезieю, уролопчними вада-ми та вадами кшщвок. VATER-асощащя вражае
1,05 на 5000 новонароджених дтей, та майже 48% iз них вмирають протягом першого року життя [1,4,9]. Аноректальш вади е найбшьш по-ширеними аномалiями травного тракту людини, зус^чаються з частотою 1: 3000 новонароджених [1,9]. Найтяжчою та найскладшшою формою комбшовано! аноректально! та урогештально! вади е екстрофiя клоаки. Етюлопя, патогенез та
ембрюлопчш основи формування цих вад за-лишаються незрозумiлими [3,4,7]. У попередшх експериментальних дослiдженнях вивчалися pi3-ш твариннi моделi, починаючи з мишиних та свинячих природних мутантiв (лшя SD)[3,7,8], впливу рiзних тератогенних факторiв (етиле-нетiорея, цитостатики, етретинат) [7,10], гене-тичнi технологи (Gli2 та Gli 3 блокованi гени) [10]. Але, незважаючи на цi дослщження, ембрь ологiчнi механiзми цих вад залишаються незро-зумiлими та протирiчними [4,7,9].
Метою нашого дослiдження було вивчення процешв формування спинно! хорди у ембрюшв щурiв при використанш запропоновано! експе-риментально! патогенетично! моделi комбшова-них аноректальних та урогештальних вад.
МАТЕР1АЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛЩЖЕНЬ
Дослiдження проведено на щурах лши Wistar вагою 200-250г, яких було отримано iз тваринно! дослщницько! лаборатори ДДМА. Тварини утри-мувалися при температурi повiтря 21° С та вщ-носнiй вологостi 55% зi спiввiдношенням тем-ного-свiтлого перiоду 12\12. Тварини мали вшь-ний доступ до лабораторно! !жi та води. День, коли у вагшальному асшрат знаходили сперма-тозо!ди, вважали днем 0 гестаци. Цим щурам штраперитонеально вводили адрiамiцин у дозi 1,75 мг/кг ваги тша на 6-й, 7-й, 8-й, 9-й дш гестаци. Контрольна група отримувала штра-перитонеальш iн'eкцi! фiзiологiчного розчину у т ж самi перiоди гестаци. Плоди отримували шляхом кесаревого розтину на Е10, Е11, Е12, Е13, Е14 день гестаци ( повний строк 22 дш) та негайно фшсували у 4% парафальдегад у фосфатному буферному розчиш. Визначали об'ем ембрюну та об'ем спинно! хорди. Тварин ви-водили iз експерименту шляхом передозування галотану. Плоди фшсували у рiдинi Боуена на 48 годин, парафiновi блоки нарiзали товщиною 8 мкм. Вздовж та впоперек препарати забар-влювали гематоксилiн-еозином та вивчали шд свiтловим мiкроскопом. Фотографування ембрюшв проводили за допомогою цифрово! камери при збiльшеннi х4 для ембрiонiв Е10,Е11,Е12 та збшьшенш х 2 для Е13 та Е14 дшв гестаци. Зображення спинно! хорди отримували при збшьшенш х 100 для ембрюшв Е10,Е11,Е12 та збшьшенш х 40 для Е13 та Е14 дшв гестаци. Цифрова обробка зображень виконувалася за допомогою програми Stereology Toolbox v1.1 (Morphometrix, Davis, USA). Методи сучасно! стереологи основаш на теори, що будь-яка кшьюсть зрiзiв через цилiндричнi структури дае змогу обчислити обсяг цилшдру, якщо вiдомi площа кожного зрiзу та вщстань мiж зрiзами
(метод СауаПей). Усi кiлькiснi данi представленi як середш (М±т), та достовiрнiсть рiзницi вив-чалася за допомогою критерда Стьюдента, рiзни-ця вважалася достовiрною при р< 0,05. Прове-дення дослiджень було погоджено на засщанш Ради з питань бiомедичноi етики ДДМА.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ
35 плодiв було отримано вщ 7 самок (10 самцiв та 25 самок) та 27 - вщ 3 самок у кон-трольнш групi (12 самцiв та 15 самок). Плоди вщ адрiамiцин-лiкованих самок були значно меншоi маси у порiвняннi з контрольною групою (Р< 0,05). Розподiл ембрiонiв за об'емом ембрiону представлено на рис. 1.
Об'ем ембрiону та спинноi хорди був об-числений за допомогою формули V=C х (D)2 х S, де С - сума шдрахованих точок у кожному зрiзi, D - вщстань мiж двома точками вимiрювальноi штки, S - вiдстань мiж зрiзами ( 100цт).
У строки Е12 адрiамiцин-лiкованi (А-лiкованi) ембрiони мали об'ем 5,397±0,334мм3 та мали достовiрно менший об'ем, нiж ембрiони кон-трольноi групи - 8,320±0,640 мм3 (р<0,001). У строки Е 14 ембрюни дослiдноi групи мали об'ем 40,309±3,421 мм3 та залишалися значно меншими за ембрiонiв контрольно!' групи 55,532±2,347 мм3 (р<0,005). Але вiдносний об'ем спинно!' хорди до об'ему всього ембрюну в строки Е 12 був значно вище в грут А-лшованих тварин: 0,0032±0,0003мм3 проти 0,0027±0,0001мм3 у контрольнiй групi (р<0,05).
При цьому самi ембрiони були значно меншими. У строки Е 14 об'ем спинно! хорди у дослщнш груш дорiвнював 0,0107±0,001мм3, що було менше за контрольну групу -0,0119±0,001мм3. Рiзниця була неважливою, тому що не бралася до уваги рiзниця в об'емi самих ембрюшв, яю у вказанi строки значно вiдрiзнялися у бiк зниження об'ему ембрюшв у дослщнш грут. При вивчент спiввiдношення об'ему спинно! хорди до об'ему ембрюну вщ-мiченi значнi вiдмiнностi мiж А-лшованою та дослiдною групами. Це видно при калькуляци об'ему спинно! хорди як вщсотка загального об'ему ембрюна. У перiоди гестацii Е12 та Е14 вщсоток об'ему спинно! хорди у вщношенш до об'ему ембрюну був значно вищим у А-грут у порiвняннi з контролем . Достовiрнiсть вщ-мiнностей склала на Е 12 Р< 0,025, на Е14 р<0,001. Вiдмiчено, що тд впливом адрiамi-цину на ембрюн спинна хорда може форму-вати множиннi аномальнi вiдгалуження , що проникають вентрально до мезенхiми до голов-но! кишки та навт можуть торкатися !!. С iмовiрним, що тривала адгезiя спинно! хорди до
06/ Том XI/ 4
21
головно! кишки може викликати аномальний розвиток мезенхiми та призводити до форму-вання вад розвитку аноректально! та уроге-
нiтальноi зон. Нашi данi свiдчать, що об'ем спинно! хорди значно зростае вщносно об'ему ембрiону у термiн як 12, так i 14 дшв гестацii.
60 -,
«Ц 50 2
й 40 х
о
а 30
ю 2
«и 20
2 и
ю 10
Е10 Е11 Е12 Е13 Е14
дш гестаци
□ контрольна Вдосл1дна
Рис. 1. Об'ем ембрюшв дослвдноТ та контрольно!' груп на 10-14 дш гестаци
Це свiдчить про те, що А мае значний вплив на формування спинно! хорди та викликае зро-стання !! об'ему у перюд до 12 дня гестацп. Зростання спинно! хорди з головною кишкою викликае як мехашчну тракщю та деформацiю останньо!, так i тривалий локальний вплив ви-дiлених спинною хордою протеiнiв на формування головно! кишки. При цьому iмовiрне локальне тдвищення градiенту концентрацii ре-
гуляторних протеiнiв. Вщомо, що цi проте'ни дiють як клггина-клггина сигнальнi фактори та модулятори клггинного диференцiювання та росту, можуть дiяти на короткiй та довгш вiдстанi вiд спинно! хорди. Зменшення зростання об'ему спинно! хорди у термш 14 днiв свщчить про включення компенсаторних механiзмiв захисту клггин вiд ди тератогенного фактору.
о ч
0,07
0,06
ч ср
о „ х
* > 0,05
0 | ,
1 .2
2 о. 0,04 с ю
° 2
2 > 0,03
« 2
ю и
о Ь 0,02
2 О
О и ч т
0,01
1
Дн1 гестаци 1-Е12, 2-Е14 □ контрольна група Пдослщна група
Рис.2. Спiввiдношення об'ему спинно'! хорди як вiдсотка загального об'ему ембрюну контрольно'1 та
дослщноТ груп на 12 та 14 дш гестаци
0
Адрiамiцин (А) (доксорубiцин) е глшозидним антрациклiновим антибiотиком, який отримують вщ Streptomyces peucetius та широко засто-
совують у лшуванш злояюсних пухлин у лю-дини. У людини адрiамiцин (А) накопичуеться у жовч^ виводиться з нею (iнодi виводиться з
сечею) [5]. Наявш nporapi4m данi щодо вияв-лення А в амнютичнш рiдинi людини у першому тримес^ BariTHOCTi [5,6]. В експериментах in vitro виявлено, що А швидко проникае до кль нини та дiе специфiчно на певнi ядерш стру-ктури, TaKi як перинуклеарний хроматин, приг-нiчуе мiтоз, синтез РНК та ДНК. Цитогенш аномали та мутагенна aктивнiсть були шдтверд-женi на культурi лiмфоцитiв людини [5].
ЩДСУМОК
Нaшi результати свщчать, що певнi дози А у певш перiоди ембрiогенезу можуть викликати гшертрофда спинно1 хорди та зростання об'ему спинно1 хорди вiдносно об'ему ембрюну безпо-середньо пiсля призначення aдрiaмiцину. Пато-логiчне зростання об'ему спинно1 хорди у кри-тичш перiоди ембрiонaльного розвитку може впливати на процеси органогенезу, викликати формування аноректальних та урогенiтaльних вад розвитку. Анaтомiя та гiстологiя цих ком-
плексних вад дуже схож з аналопчними вадами у людини, що зустрiчaються при VATER- та VACTERL- aсоцiaцiï. Це пiдтверджують пол> пдрамнюн та зниження ваги плодiв, що свщчить про еднiсть патогенетичних мехaнiзмiв формування цих вад у тварини та людини. Ми не можемо стверджувати, що саме А вщповщае за формування усiх цих вад, але експериментальна модель показуе, що ембрюлопчне "вшно", крiзь яке дiе тератогенний чинник, може бути подiб-ним у обох видiв живих об'ектiв.
Вкaзaнi дози aдрiaмiцину в певнi перiоди ем-брюнального розвитку викликають гiпертрофiю спинноï хорди, що, на наш погляд, е причиною формування аноректальних та урогештальних вад розвитку в експериментальних тварин. Пер-спективним е пошук можливостей максимально рaнньоï дiaгностики формування описаних вад розвитку та пошук можливостей впливу на щ процеси.
СПИСОК Л1ТЕРАТУРИ
1. Лазюк Г.И. Тератология человека.-М.: Медицина, 1991.- 480 с.
2. Лопаткин Н.А., Люлько А.В. Аномалии мочеполовой системы. -К.: Здоров'я, 1987.-416 с.
3. Beasley S.W., Diez-Pardo J., Qi BQ. The contribution of the Adriamycin-induced rat model of the VATER association to our understanding of congenital abnormalities and their embryogenesis // Pediatr. Surg. Int.- 2000.-Vol.16, N 2.-P.465-472.
4. Bruch S., Adzick S., Harrison M. Challenging the embriogenesis of cloacal exstrophy // J.Pediatr.Surg.-1996.-Vol. 31, N 6.-P.768-770.
5. Carter S.R. Adriamycin: A review // J.Nation. Cancer Inst.- 1975.- Vol. 55.- P. 127.
6. Gillick J., Mooney E., Giles S. Notochord anomalies in the Adriamycin rat model: a morphologic and
molecular basis for the VACTERL association // J. Pediatr. Surg.- 2003.-Vol.38, N2.-P.469-473.
7. Khoury M.J., Cordero J.F., Greenburg F. A population study of the VACTERL association: evidence for its etiologic heterogeneity // Pediatrics.- 2003.-Vol.71.-P.815-820.
8. Kluth D., Hillen M., Lambrecht W. The principles of normal and abnormal hindgut development // J.Pedi-atr. Surg.-1995.-Vol.30,N3.-P.1143-1147.
9. Kubota Y., Shimotake T. Development of anorectal malformations using etretinate // J.Pediatr.Surg.-1998.-Vol.33,N1.-P.127-129.
10. Sasaki Y., Iwai N., Kimura O. Sonic Hedgehog and bone morphogenic protein 4 expressions in the hin-dgut region of murine embryo with anorectal malformations // J.Pediatr.Surg.-2004.-Vol. 39,N2.-P.170-173.
♦
06/ Том XI/ 4
23
