CC BY
36
HayKOBHH BicHHK .HbBiBCbKoro HaqioHaibHoro ymBepcurery BeTepHHapHoi' mcahuuhh Ta 6ioTexHonorm iMeHi C.3. I^H^Koro Scientific Messenger of Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z. Gzhytskyj
doi: 10.15421/nvlvet6760
ISSN 2413-5550 print ISSN 2518-1327 online
http://nvlvet.com.ua/
УДК 612.6. 636.082.4:591.31
Використання тривалого мониторингу розвитку ембрюна (TLMED)
в репродуктивнiи бiOтехнологil
М.М. Шаран1, С.Г. Шаловило2, Х.М. Гримак1 m_sharan@ukr.net
'1нститут бюлогп тварин НААН, вул. В. Стуса, 38, м. Львiв, 79034, Укра'ша; 2Львiвський нацюнальний утверситет ветеринарное медицини та бiотехнологiй iMeHi С.З. Гжицького,
вул. Пекарська, 50, м. Львiв, 79010, Украта
Сьогодн вiдзначаeться значне збыьшення ттересу до доnомiжних репродуктивних технологт. Робота з удосконален-ня процедур штучного заплiднення призвела до створення таких методiв, як ICS1 (Intracytoplasmic Sperm Iniection - внут-ршньоклтинна т'екщя спермiя), IMSI (Morphologically Selected Intracytoplasmic Sperm Iniection - внутршньоклтинна iн'eкцiя морфологiчно вiдiбраного спермiя) i генетичних до^джень на бластомерах, отриманих за допомогою бюпсп ембрюна. Остантм часом появилася нова технологiя, яка дозволяе спостер^ати за динамжою розвитку ембрютв з викорис-танням тривалого монторингу Их розвитку (TLMED - Time Lapse Monitoring of Embryo Development). З ii допомогою мож-на устшно встановити правильш морфоктетичт параметри ембрюна i з быьшою точтстю стежити за його розвитком. Сьогодт на ринку найширше використовують чотири системи: Primo Vision (Vitrolife, Швещя), EEVA (Auxogyn, США), Embryoscope (Vitrolife, Швещя), MIRI (Esco, Датя), яш проводять морфоюнетичний аналiз ембрiонiв, що забезпечуе вiдбiр кращих ембрютв i тдвищуе результативтсть екстракорпорального заплiднення. Першi позитивн результати використання системи TLMED у альськогосподарськт бютехнологп на прикладi Центру медико-бiологiчних до^джень Варшав-ського природничого утверситету дозволяють прогнозувати впровадження ii у повсякденну практику ветеринарних клШк.
Knmnoei слова: тривалий монторинг розвитку ембрюна, морфоктетика, розвиток ембрiона, допомiжнi репродуктив-н технологт, бiотехнологiя розмноження тварин.
Использование длительного мониторинга развития эмбриона (TLMED) в
репродуктивнои биотехнологии
М.М. Шаран1, С.Г. Шаловило2, Х.Н. Грымак1 m_sharan@ukr.net
'Институт биологии животных НААН, ул. В. Стуса, 38, г. Львов, 79034, Украина;
2Львовский национальный университет ветеринарной медицины и биотехнологий имени С.З. Гжицкого,
ул. Пекарская, 50, г. Львов, 79010, Украина
Сегодня отмечается значительное увеличение интереса к вспомогательным репродуктивным технологиям. Работа по совершенствованию процедур искусственного оплодотворения привела к созданию таких методов, как ICS' (Intracytoplasmic Sperm Injection - внутриклеточная инъекция спермия), IMSI (Morphologically Selected Intracytoplasmic Sperm Injection - внутриклеточная инъекция морфологически отобранного спермия) и генетических исследований на бластомерах, полученных при помощи биопсии эмбриона. В последнее время появилась новая технология, которая позволяет наблюдать за динамикой развития эмбрионов с использованием длительного мониторинга их развития (TLMED - Time Lapse Monitoring of Embryo Development). С ее помощью можно успешно установить правильные морфокинетические па-
Citation:
Sharan, M., Shalovylo, S., Grymak, C. (2016). Using time lapse monitoring of embryo development (TLMED) in reproductive biotechnology. Scientific Messenger LNUVMBT named after S.Z. Gzhytskyj, 18, 2(67), 274-280.
раметры эмбриона и с большей точностью следить за его развитием. Сегодня на рынке широко используют четыре системы: Primo Vision (Vitrolife, Швеция), EEVA (Auxogyn, США), Embryoscope (Vitrolife, Швеция), MIRI (Esco, Дания), которые проводят морфокинетический анализ эмбрионов, что обеспечивает отбор лучших эмбрионов и повышает результативность экстракорпорального оплодотворения. Первые положительные результаты использования системы TLMED в сельскохозяйственной биотехнологии на примере Центра медико-биологических исследований Варшавского сельскохозяйственного университета позволяют прогнозировать внедрение ее в повседневную практику ветеринарных клиник.
Ключевые слова: длительный мониторинг развития эмбриона, морфокинетика, развитие эмбриона, вспомогательные репродуктивные технологии, биотехнология размножения животных.
Using time lapse monitoring of embryo development (TLMED) in reproductive biotechnology
M. Sharan1, S. Shalovylo2, C. Grymak1 m_sharan@ukr.net
'Institute of Animal Biology NAAS, V. Stus Str., 38, Lviv, 79034, Ukraine;
2Lviv National University of Veterinary Medicine and Biotechnologies named after S.Z. Gzhytskyi,
Pekarska Str., 50, Lviv, 79010, Ukraine
An increasing interest in assisted reproductive technologies and their applications in biotechnology of animal reproduction is currently observed. The development of in vitro fertilization (IVF) has led to the emergence of new techniques as ICSI (Intracyto-plasmic Sperm Iniection), 'MSI (Morphologically Selected Intracytoplasmic Sperm Iniection) and PGS (Pre-Implantation Genetic Screening). Recently a new technology TLMED (Time Lapse Monitoring of Embryo Development), which allows to observe dynamics of embryo development is being introduced to practice. The application of this technique allows to determine the morphokinetics parameters of normal embryos and to observe its development more accurately. Currently, there are four systems in the market based on this technique: Primo Vision (Vitrolife, Sweden), EEVA (Auxogyn, USA), Embryoscope (Vitrolife, Sweden), MIRI (Esco, Denmark), which conducting the morphokinetics analysis of embryos, which ensures selection of the best embryos and increases the effectiveness of in vitro fertilization. The first positive results of the use of system TLMED in agriculture biotechnology on the example of the Biomedical Research Center of the Warsaw University of Life Sciences predicts its introduction into the everyday practice of veterinary clinics. The aim of this paper is to present each system and review the existing information about the possible application of TLMED and the usefulness in animal reproductive biotechnology.
Key words: Time-Lapse, embryo, morphokinetics, assisted reproductive techniques, reproductive biotechnology.
Вступ
Прорив в ембрюлогп ввдбувся 25 липня 1978 року, коли народилася Лу!за Браун - перша дитина, отри-мана за допомогою процедури екстракорпорального заплщнення (IVF - in vitro fertilization, заплщнення поза оргашзмом). Ця дата стала проривом в лшуванш безплщдя i призвела до появи нового вщдшу медици-ни - клшчно! ембрюлогп. З цього моменту почалося бурхливе зростання штересу до методiв штучного заплщнення та 1х застосування в репродуктивнш медицин^ головним чином в л^ванш безплщдя. Вна-слщок цього вщбувся швидкий розвиток техшки отримання ембрюшв in vitro, в результат чого створено багато спецiалiзованиx поживних середовищ, розроблено оптимальш умови для культивування ембрюшв i впроваджено новi методи штучного запль днення, так як ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection -внутршньоклггинна ш'екщя спермiя), IMSI (Morphologically Selected Intracytoplasmic Sperm Injection - внутршньоклтганна ш'екщя морфолопчно вщбраного спермiя) i генетичш дослщження на блас-томерах, отриманих за допомогою бюпсп ембрюна.
Протягом декшькох рошв на ринку з'явилася нова технолопя, яка дозволяе спостертати динашку розви-тку ембрюшв з використанням тривалого мониторингу 1х розвитку (TLMED - Time Lapse Monitoring of Embryo Development). Фотографування розвитку ембрюшв з певною частотою, використовуючи вбудова-
ний в СО2-шкубатор мжроскоп дозволяе отримувати зображення ембрюна in vitro. Основною перевагою цього способу е його нешвазившсть, оскшьки ембрюн протягом усього розвитку залишаеться в незмшних умовах шкубатора. До сих шр для того, щоб ощнити морфологш ембрюна треба було витягнути його з шкубатора, що наражало його на змши атмосфери i могло чинити ютотний вплив на морфокшетичш па-раметри.
Першi лiтературнi данi щодо морфокiнетичного аналiзу з використанням «покадрово! кшематографп» виникла понад 15 рошв тому (Payne et al., 1997), але пльки в останнi роки розвиток цифрових технологш дав можливiсть розробити ряд систем, яш все частiше використовуються в клшжах з лiкування безплвддя для морфошнетичного аналiзу ембрiонiв людини. Сьогоднi появляються лише окремi лггературш данi про використання цього методу в репродуктивнш бютехнологп тварин.
Метою ще! роботи е аналiз лггературних джерел, що охоплюе поточний стан використання ще! техно-логii i ii потенцiйне використання в бютехнологп розмноження тварин.
Системи. Тривалий монiторинг розвитку ембрюна використовувався ще в 90-х роках минулого столiття для того, щоб спостертати за процесом заплiднення i кiнетики ембрiонiв людини (Payne et al., 1997). Споча-тку цей метод базувався на зйомщ заплщнених ооци-тiв щохвилини впродовж чотирьох годин за допомо-
гою фотокамери в шкубацшнш камерi на швертова-ному мжроскош. Удосконалення технологй' i ство-рення iнтегрованиx систем дозволило вiзуалiзувати весь розвиток ембрюшв без необxiдностi виймати !х з iнкубатора i тдтримувати стабiльнi умови культиву-вання з моменту заплщнення яйцеклiтини до трансп-лантацй' або заморожування (вприфшаци) ембрюшв. На в1дм1ну вiд традицiйниx методiв оцiнки морфош-нетичного розвитку ембрюна щоденним спостере-женням, метод TLMED дозволяе виконувати сотнi фотографiй, як дають можливiсть побачити ключовi змши в розвитку ембрiона.
Значна шльшсть фотографiй дозволяе створювати динамiчний фшьм, який вiдображае весь розвиток
Рис. 1. Система тривалого
ембрiона. Найбшьший iнтерес у широкому впрова-дженш ще! технологй' з'явився в 2010 рощ шсля наро-дження першо! дитини, зачато! пiсля екстракорпора-льного заплщнення i культивування ембрiонiв в однш ¡з систем монiторингу передiмплантацiйного розвитку.
З того часу розроблено калька систем з викорис-танням цiе! технологи. 1х основними компонентами е: камери з високою роздшьною здатшстю, вбудованi в шкубатор, що проводять зйомку, спецiальна чашка для культивування, яка запобиае перемщенню ембрь онiв i програмне забезпечення, яке дозволяе провести аналiз i обробку даних (рис. 1)
розвитку ембрюшв
Серед доступних систем на ринку е деяк вщмш-носп, але !х спiльною рисою е ручна або нашвавтома-тична реестращя подiй, що вщбуваються в процес передiмплантацiйного розвитку ембрiонiв. Системи i програмне забезпечення розробленi таким чином, щоб вони могли адаптуватися до потреб користувачiв. Вони можуть бути запрограмоваш розпiзнавати певнi поди, наприклад, подiл ембрiонiв або поява специфiч-них структур. Сьогоднi на ринку найпопуляршшими е 4 конкуруючих системи.
Primo Vision (Vitrolife, Швецiя). Система склада-еться з камер з високою роздшьною здатшстю всере-диш класичного iнкубатора для заплiднення in vitro, яш пiдключенi до зовшшнього комп'ютера. Для кожного пащента е один мiкроскоп. Залежно вщ розмiрiв iнкубатора, вiн може помютити певну к1льк1сть мiк-роскопiв. Блок Primo Vision Evo - це цифровий ком-пактний швертований мшроскоп з модуляцiйним контрастом Хоффмана (НМС) з зеленим свилом (550 нм), який може збирати зображення в 3-11 фокальних площинах. Повна система дозволяе тдключати до 6 камер, що дае змогу досл1джувати 96 ембрюшв (Prib-enszky et al., 2010).
П1д час культивування чашка з матерiалом розта-шована статично шд мiкроскопом. Чашка виготовлена вщповщно до вимог £С щодо безпеки, охорони здо-
ров'я та навколишнього середовища. Для культивування використовують два типи чашок: 9 лунок (3 ряди по 3 лунки) i 16 лунок (4 ряди по 4 лунки). Така конструкщя чашки дозволяе проводити спiльне культивування ембрюшв i одночасно полегшуе !х iденти-фiкацiю, а доступ свила в1дбуваеться на поверхнi розмiром 2,5 х 2,5 мм. Конструш^ чашки дозволяе оцiнювати ембрiони на нормальному або швертова-ному стереоскопiчному мiкроскопi.
Програмне забезпечення Primo Vision дозволяе за-писувати зображення, аналiз яких потiм виконуеться вручну. Виробник дозволяе налаштувати програмне забезпечення до вимог користувача введенням вiдпо-вщних функцiй, щоб забезпечити аналiз таких подш, як виштовхування полярного тша, формування про-нуклеусiв або визначення тривалостi iнтервалiв часу, що вщбуваються мiж посл1довними дiленнями клiтин. Можливють конфiгурацii модулiв з рiзними типами iнкубаторiв забезпечуе вибiр оптимальних умов для вирощування та полiпшення юнуючих протоколiв культивування ембрiонiв.
EEVA (Auxogyn, США). Система EEVA (Early Embryo Viability Assesment - рання оцшка життездат-ностi ембрiонiв) також побудована з модулiв у виглядi камер, яш можуть бути помiщенi в уже юнуючий в лабораторii шкубатор. На вщмшу вiд Primo Vision,
яка використовуе зелений фшьтр i модуляцшний контраст Хоффмана HMC, Система EEVA для отримання зображення використовуе «темне поле» (DF - dark field). Цi двi системи вiдрiзняе також застосовування в EEVA едино! фокально! площини i автоматичного вiдстеження подiлу ембрiона, яку Primo Vision проводить вручну. Програмне забезпечення, що входить в комплект, дозволяе проводити аналiз раннього розвитку ембрюшв i надае данi про потенцiал розвитку ембрютв до стади бластоцисти, як! розроблеш на основi дослiджень, проведених виробником (Wong et al., 2010).
Потенщал ембрiона визначаеться за допомогою програмного забезпечення на основ! аналiзу його розвитку протягом двох дшв тсля заплiднення. На-лаштування системи дозволяе спостертати за ембрю-ном без учасп ембрiолога i впливу додаткового опро-мiнення. Отримання к!льшсних даних, як! корелюють з! стандартною класифкащею морфологй' ембр!он!в, дозволяе проводити точшшу !х селекц!ю вже на дру-гий день розвитку. Таке виршення, яке базуеться на автоматичн!й морфолопчнш i морфок!нетичн!й оцш-ц!, е набагато об'ективн!шим, н!ж мануальна оцшка ембр!олога. Програмне забезпечення анал!зуе поди (час i м!сце), характерн! для раннього ембрюнального розвитку, воно включае:
• тривал!сть першого циток!незу (час в!д початку першого под!лу до його завершення);
• штервал часу м!ж першим i другим цитокинезом (час переходу в!д дво- до три-кл!тинно! стади);
• штервал м!ж другим i трепм циток!незом (час переходу в!д трьох- до чотирьох-кл!тинно! стад!!).
Завдяки використанню зазначених вище парамет-р!в можна провести селекц!ю ембр!он!в для транспла-нтаци чи заморожування (вирифжацп) вже на 3-ш день п!сля зашлднення без тривалого культивування, яке п!двищуе ризик виникнення еп!генетичних факто-р!в, як! негативно впливають на як!сть ембр!она (Shu-faro and Laufer, 2013).
Чашки системи EEVA оснащен! мжролунками, як i в Primo Vision i завдяки цьому можна !дентиф!кува-ти i оцнювати окрем! ембр!они, а пер!од шкубаци ембрюни перебувають в умовах сп!вкультивування. На однш чашц! можна максимально розмютити 9 ембр!он!в.
Embryoscope (Vitrolife, Швешя). На в!дм!ну в!д вище наведених, Embryoscope е штегрованою системою, що складаеться з !нкубатора, в який можна вмю-тити максимум 6 пащенпв (6 чашок). Це непгроста-тичний !нкубатор, оснащений НЕРА фшьтрами i системою фшьтраци летких орган!чних сполук, пов!тря всередиш стерил!зують ультраф!олетовим випромь нюванням. Культивування в таких умовах зводить до мшмуму ризик розвитку гриб!в i бактер!й. В шкуба-тор вбудована система камер з червоними свгглодюд-ними лампами (635 нм), як! дозволяють нагр!вати до 9 р!вновщдалених фокальних площин.
Чашка в шкубатор! складаеться з 12 лунок, у як! можна розмютити по одному ембрюну. Це дае мож-лив!сть одночасно анал!зувати розвиток 72 ембр!он!в. Чашка сконструйована так, щоб !деально ввдповщала
робочому в!дд!лу i забезпечувала оптимальну передачу тепла в культуральне середовище.
Програмне забезпечення, що постачаеться виробником, дозволяе в!дбирати ембрюни на основ! ретроспективного анал!зу. Записи можуть бути виконан! одночасно в дек!лькох !нкубаторах ! з!бран! в одн!й центральн!й станц!!.
MIRI (Esco, Дан!я). Система MIRI аналог!чно Embryoscope - це спец!ал!зований шкубатор, який складаеться з шести окремих камер, у кожн!й з яких можна одночасно культивувати до 14 ембрюшв, по-м!щених в спец!ально п!дготовлених чашках. Розм!р камер ! !х безпосередн!й нагр!в дозволяе п!сля в!дк-риття дуже швидко стаб!л!зувати температуру (менше 1 хвилини) Ця конструкц!я також дозволяе дуже шви-дко стабшзувати концентрац!ю газу, що займае бли-зько 3 хвилин. Кожна камера обладнана в стандартн!й комплектац!! окремим датчиком температури ! рН. Розвиток ембр!он!в контролюеться в багатьох оптич-них площинах з 5-хвилинними !нтервалами. Програ-мне забезпечення дозволяе анал!зувати ембр!ональ-ний розвиток як в реальному час!, так ! в ретроспектив!.
КлШчт аспекти.
Сьогодн!, щоб встановити !мплантац!йний потен-ц!ал ембрюна, отриманий запл!дненням in vitro, вико-ристовують морфок!нетичну оц!нку, яка досить добре задокументована ! корелюе з потенц!алом розвитку ембрюна. Ця оцшка зазвичай проводиться щодня протягом оч!кувано! под!! (наприклад, поява пронук-леуса, перший под!л тощо) протягом 6 - 8 дн!в ембр!-онального розвитку до моменту досягнення стад!! бластоцисти, або нав!ть до вилуплення бластоцисти.
На сьогодн!шн!й день б!льш!сть досл!джень про-водять на людських ембр!онах. На п!дстав! визначен-ня к!лькост! кл!тин, !х форми ! зовн!шнього вигляду кожного дня, фрагментац!! ! наявност! мультинуклеа-ц!! в бластомерах створено к!лька систем оц!нки роз-витку ембр!она, наприклад, система оц!нки, запропо-нована British Fertility Society ! Association of Clinical Embryologists, як! використовуються у Великобритан!! (Cutting et al., 2008). G також б!льш розширен! систе-ми, як! беруть до уваги додатков! чинники, напри-клад, оц!нку к!лькост! ! розпод!л ядерець в пронукле-ус! (Fisch et al., 2010).
Нов!тньою та найб!льш поширеною системою оц!-нки ембрюшв, що дозволяе ïï стандартизац!ю, е «Стамбульський консенсус» розроблений Gвропeйсь-ким товариством рeпродукц!ï людини ! ембр!олог!! (ESHRE - European Society of Human Reproduction and Embryology) ! ALPHA - Scientists in Reproductive Medicine, в якому представлен! морфолог!чн! критер!!, на п!дстав! яких можна оц!нити як!сть ооцит!в ! емб-р!он!в. Виб!р ембр!она з кращими морфолог!чними параметрами мае вир!шальне значення, оск!льки, як показують досл!дження, досягнення певно! стад!! в час! корелюе з життездатн!стю ембр!она ! його потен-ц!алом для розвитку та !мплантац!!.
Слабким м!сцем !снуючих систем оц!нки е прове-дення щоденного анал!зу, що вимагае п!ддавання ембр!она впливу умов навколишнього середовища п!д час в!дкривання !нкубатора. Кр!м того, в результат!
одного спостереження отримуеться обмежена шфор-мацiя про розвиток ембрюна. Сьогодш все бiльшу увагу придiляють оцiнцi морфок1нетичного розвитку ембрiона (динамжа морфологiчного розвитку).
Такi спостереження можливi завдяки впроваджен-ню технологii покадрово1 вiзуалiзацii. Значне зрос-тання ввдсотка вагiтностi (на 20%) пiсля застосування методики TLMED отримано за використання системи Embryo Scope M. Meseguer'a (Meseguer et al., 2012). Так1 результата зумовлеш перебуванням ембрiонiв впродовж усього перiоду культивування в стабшьних умовах в iнкубаторi, а також можливiстю детального аналiзу !х морфошнетики. Прикладом можуть служи-ти типовi порушення в подiлi з дво- до триклгшнно! стадii. У ембрюшв, в яких спостерiгали, що перехвд вiд стадii двох до трьох бластомерiв вiдбуваеться менш нiж за 5 годин, виявився менший iмплантацiй-ний потенцiал. Для нормальних ембрюшв клгганний цикл становить 10 - 12 годин (Rubio et al., 2012). Це доводить, що за «класичного» методу оцшки ембрюшв таких спостережень неможливо було б здшснити.
У клiнiчнiй практицi юнуе безлiч варiантiв застосування системи TLMED, починаючи з перевiрки звичайного «статичного» аналiзу розвитку. Ця техно-логiя також дозволяе прогнозувати життездатшсть ембрiонiв, щоб порiвняти вплив таких факторiв, як культуральне середовище або добавки до нього. За-лежно вiд характеру добавки або дози, отримаш результата розвитку ембрюшв вiдрiзняються один ввд одного, а система TLMED дозволяе точно встановити цi вiдмiнностi.
Селекщя морфошнетичних маркер1в.
Тривалий монiторинг динамiки розвитку ембрюна в поеднанш з використанням класичного морфолопч-ного спостереження дозволяе отримати детальнi мор-фокiнетичнi даш Отримання iнформацii можливе завдяки ретроспективному аналiзу подiй в певний час, яш потiм можна скорелювати з процесом бластуляцii, вiдсотком iмплантацii, ступенем плоiдностi, ваптшс-тю i родами. Спостереження за розвитком ембрюна дозволяе вибрати оптимальш морфошнетичш марке-ри для конкретного виду, а також отримання найкра-щих результата завдяки селекцii нормальних ембрюшв.
Перша модель оцшки ембрюшв на основi !х морфошнетики була створена в 2010 рощ (Wong et al., 2010). До тих пр процес оцшки бластуляцп вважався маркером якосл i життездатносп ембрiонiв. З впрова-дженням технологи TLMED вона була поширена також як маркер, що дозволяе передбачити стушнь пловдносп, потенцiал для iмплантацii або збiльшити вiдсоток вагiтностей (Herrero et al., 2010; Cruz et al., 2011; Meseguer et al., 2011; Leibenthron et al., 2012; Chamayou et al., 2013; Campbell et al., 2013).
Дослвдженнями, яш базуються на ретроспективному аналiзi, виявлено 6 морфошнетичних маркерiв, яш корелюють з iмплантацiйним потенцiалом (Meseguer et al., 2011). Найважлившим визнано час дося-гнення п'ятиклгшнно!' стадii (t5) i тривалiсть другого циклу (cc2). Авторами представленi критерп, як1 чи-нять негативний вплив на iмплантацiю. До них ввдно-
сяться: безпосереднiй подiл вiд одно- до триклгтанно! стади, нерiвнi бластомери i мультинуклеацiя на стадй' чотирьох бластомерiв. Порiвняно недавно встановле-но взаемозв'язок м1ж морфок1нетичними параметрами i ступенем пло!дностi ембрiона. З щею метою проведено бiопсiю бластомерiв ембрiонiв i !х передiмплан-тацшш генетичнi дослiдження, а потiм результата порiвнювали з даними, отриманими з використанням методу TLMED. Виявилося, що единими маркерами ступеня пло!дностi е час початку бластуляци (tSB) i час досягнення стади зрiло! бластоцисти (tB). На цiй пiдставi визначено ризик анеупловдп (Campbell et al., 2013). 1нша група вчених на основi аналогiчниx при-пущень розробила метод селекцп еупло!дних ембрюшв (з повним набором хромосом). Вони ввдзначили, що морфокiнетична характеристика ембрюшв з повним набором хромосом, в^^зняетьсяч ввд тих, у яких порушена шльшсть хромосом. Спостериалися ютотш вiдмiнностi м1ж стадiями t5- t2 i у третьому кштин-ному циклi (cc3 = t5-t3) (Basile, 2014).
На додаток до перерахованих вище факторiв, шн-цевий результат процедури заплвднення in vitro, тобто народження здорово! дитини залежить вщ багатьох чинник1в. Таким чином, вважаеться, що найкращим е той ембрюн, пiсля трансплантацп якого отримано ваптшсть i народилася дитина. Ще й доа мало експе-риментiв зосереджеш на такому пiдxодi, i тому це вимагае додаткових дослвджень. В одному з експери-ментiв порiвнювали морфокiнетичнi параметри емб-рiонiв, шсля трансплантацй яких отримали потомство ембрюшв, аборти або вщсутшсть вагiтностi. Прове-дене дослiдження показало, що отримання ваптносп i народження дитини тюно пов'язане з часом появи першого подшу i тривалiстю раннього клгганного циклу. Проте, проводиться мало дослвджень цього параметра, i це питання в перспективi необxiдно роз-робити (Campbell et al., 2013).
^¡м вищевказаних морфошнетичних маркерiв ¡с-нуе ряд ¡нших параметрiв, як1 можна спостерпати в xодi розвитку ембрюна за допомогою техшки TLMED (табл.).
Незважаючи на iснування численних моделей, заснованих на покадровому аналiзi розвитку ембрюна необхвдно пам'ятати, що багато з них не можуть бути безпосередньо впроваджеш в будь-якiй лабораторп через iншi чинники, якi впливають на морфок1нетику. До таких чиннишв можуть належати, зокрема, тиск ^¡в в iнкубаторi або тип культураль-ного середовища. Встановлено, що умови культивування ембрюшв мають подiбний вплив на !х морфокi-нетику, як вiк i вага пащентки (Ciray et al., 2012; Leibenthron et al., 2012; Bellver et al., 2013; D^browski et al., 2015). ^¡м того, бтшють попередшх дослi-джень зосереджено на аналiзi морфокiнетики ембрiо-нiв i !! впливi на бластуляцiю, пло!днiсть, ваптшсть i роди. Багато з них також аналiзували под^, що ввдбу-ваються п1д час розвитку до стадп 5 бластомерiв. Знання морфошнетики ембрюшв шсля п'ятиклгшнно! стад^! вимагають подальших дослiджень i аналiзу.
Таблиця
Морфокметичм параметри розвитку eM6pioHa_
Символ параметра Опис параметра
Час настання параметра to Час заплiднення яйцеклiтини
tPB2 Час повного виходу другого полярного тшьця з ооплазми
tnPN Час появи двох пронуклеус1в - пiдтвердження заптднення
(tPNla) Час появи першого пронуклеуса
(tPN2a) Час появи другого пронуклеуса
tPNf Час злиття двох пронуклеус1в
t2-t9 Час досягнення стадп вiд двох до дев'яти клiтин
tsc Час шщтавання компактизаци (ущiльнення)
tMx/w Час формування морули або зупинки ущшьнення: «x» - вдаоввдае повному ущшьненню, «w» - вдаоввдае частковому ущшьненню
tSB Час появи порожнини - початок бластуляцп
tByz Час досягнення стадп зршо' бластоцисти. «у» - вдаоввдае морфологи клiтин зародкового вузла, «z» - вдаовадае морфологи клгтин трофоектодерми
tEyz Час шщшцц вилуплення бластоцисти - прозора оболонка стае щораз тонша
tHNyz Час виходу клгтин за межi прозоро' оболонки
tHDyz Час досягнення стадп вилуплено' бластоцисти
Розраховаш параметри VP = tPNf-tPNia Перюд, в якому видно пронуклеус
CCl = t2-tPB2 Триватсть першого клiтинного циклу: перiод вщ кшця другого мейотичного подшу до досягнення двоклгтинно! стадп
CC2 Тривалють другого клiтинного циклу: час мiж дво- i чотириклiтинними стад1ями, час утворення двох наступних бластомер1в можна розглядати окремо вадповадно до формули: CC2a = t3 -12 CC2b = tq -12
CC3 Тривалiстъ третього клiтинного циклу: час мiж чотири- i восьмиклiтинними стад1ями, час утворення чотирьох наступних бластомер1в можна розглядати окремо вщповщно до формули: CC3a = ts - tq CC3b = t6 -14 CC3C = t7-14CC3d = t8 -14
S2 = t4 -13 Час переходу двох сестринських клiтин, тд час якого о6идвГ подшяються до чотириклгтинно! стади.
S3 = tS-t5 Час переходу чотирьох сестринських клгтин, тд час якого вс подшяються до восьмиклгтинно' стади
tMx - tSC Час досягнення повно' компактизаци
tMy - tSC Час досягнення частково' компактизаци
tHN-tSB Тривалiсть бластуляцп
Перспектива використання методу ТЬМЕБ у ве-теринарнш практицi.
Технолопя TLMED все частiше використовуеться в клiнiчнiй ембрюлоги людини. Численними працями були документально щдтверджено, що його впрова-дження сприяе тдвищенню вiдсотка вагiтностей i дозволяе стандартизувати оцiнку морфок1нетичного розвитку ембрiона. Iснуючi системи дозволяють виб-рати оптимальну конфiгурацiю апаратних засобiв для цшей, вiдповiдних конкретним лабораторним умовам.
До сих шр тривалий монiторинг розвитку ембрю-шв використовувався в основному у людей i тшьки незначш роботи проводяться на тваринах. Впрова-дження технологи TLMED у ветеринарних клшжах, що займаються репродуктивною бютехнолопею як малих, так i великих тварин дозволило б полшшити результати. З шшого боку, впровадження ще1 технологи i И застосування в бютехнологи племiнних тварин вимагае багато роботи через необхвдтсть розроб-ки моделей морфок1нетичного розвитку ембрюшв для кожного виду. Проте, задокументована ефективнiсть технологи TLMED людей сприятиме в найближчому майбутньому тдвищенню штересу фахiвцiв з репро-дуктивно1 бютехнологи у використаннi цього методу на тваринах. Створюеться враження, що впроваджен-
ня цього методу у практику ветеринарних клшк може бути тшьки питанням часу.
Щдтвердженням цього е вадкриття у Варшавському природничому ушверситет! Центру медико-бюлопчних дослвджень, у склад1 якого запрацювала лаборатор1я бютехнологи, де активно розпочали досль дження i3 заплтднення ооципв in vitro використанням внутр1шньокл1тинно! ш'екци морфолопчно вщбраного спермiя (IMSI) та тривалого монiторингу розвитку ембрiонiв (TLMED) рiзних видiв тварин (мишей, кро-лiв, собак, овець; рис. 2) (Dqbrowski et al., 2015).
Рис. 2. Тривалий мошторинг розвитку ембрюшв (TLMED) мишей
Отримаш позитивнi результати вселяють надiю на широке використання у провщних наукових центрах аграрного профшю методу тривалого монiторингу розвитку ембрюшв, що дозволить пвдвищити резуль-татившсть in vitro заплiднення ооцитiв i впровадити у практику тваринництва.
Висновки
Розвиток цифрових та бютехнологш дав можли-вють розробити системи тривалого монiторингу розвитку ембрюшв (TLMED), яш широко використову-ються в клiнiках з лшування безплвддя людей. Сього-дш на ринку найширше використовують чотири системи: Primo Vision (Vitrolife, Швецiя), EEVA (Auxogyn, США), Embryoscope (Vitrolife, Швецiя), MIRI (Esco, Дашя), як1 проводять морфок1нетичний аналiз ембрюшв, що забезпечуе вiдбiр кращих ембрь онiв i пiдвищуе результативнiсть екстракорпорально-го заплiднення. Першi позитивнi результати використання системи TLMED у сшьськогосподарсьшй бюте-хнологii дозволяють прогнозувати впровадження ii у повсякденну практику ветеринарних клшк.
Перспективи подальших досл1джень. Дослщження з використання системи TLMED у сшьськогосподарсьшй бютехнологп дозволять розробити моделi мор-фокiнетичного розвитку ембрюшв для кожного виду тварин, що дасть можливють впровадити метод тривалого мониторингу розвитку ембрюшв у бютехнологш вщтворення племшних тварин.
Бiблiографiчнi посилання
Payne, D., Flaherty, S.P., Barry, M.F., Matthews C.D. (1997). Preliminary observations on polar body extrusion and pronuclear formation in human oocytes using time-lapse video cinematography. Hum. Reprod. 12,
532-541.
Pribenszky, C., Matyas, S., Kovacs, P. (2010). Pregnancy achieved by transfer of a single blastocyst selected by time-lapse monitoring. Reprod. Biomed Online. 21,
533-536.
Wong, C.C., Loewke, K.E., Bossert, N.L. (2010). Noninvasive imaging of human embryos before embryonic genome activation predicts development to the blastocyst stage. Nat. Biotechnol. 28(10), 1115-1121. Shufaro, Y., Laufer, N. (2013). Epigenetic concerns in assisted reproduction: update and critical review of the current literature. Fertil. Steril. 99(3), 605-606. Cutting, R., Morroll, D., Roberts, S.A. (2008). Elective single embryo transfer for practice. British Fertility Society and Association of Clinical Embryolo-gists.Hum. Fertil. 11(3), 131-146. Fisch, J., Rodriguez, H., Ross, R. (2001). The graduated embryo score predicts blastocyst formation and pregnancy rate from cleavage stage embryos. Hum. Re-prod. 16, 1970-1975. Meseguer, M., Rubio, I., Cruz, C. (2012). Embryo incubation and selection in a time-lapse monitoring system
improves pregnancy outcome compared with a standard incubator: a retrospective cohort study. Fertil. Steril. 98(6), 1481-1489.
Rubio, I., Kuhlmann, R., Agerholm, I. (2012). Limited implantation success of direct-cleaved human zygotes: a time-lapse study. Fertil. Steril. 98(6), 14581463.
Wong, C.C., Loewke, K.E., Bossert, N.L. (2010). Non-invasive imaging of human embryos before embryonic genome activation predicts development to the blasto-cyst stage. Nat. Biotechnol. 28(10), 1115-1121.
Meseguer, M., Herrero, J., Tejera, A. (2011). The use of morphokinetics as a predictor of embryo implantation. Hum. Reprod. 26(10), 2658-2671.
Campbell, A., Fishel, S., Bowman, N. (2013). Modelling a risk classification of aneuploidy in human embryos using non-invasive morphokinetics. Reprod. BioMed Online. 26(5), 477-485.
Campbell, A., Fishel, S., Bowman, N. (2013). Retrospective analysis of outcome after using an aneuploidy risk model derived from time-lapse imaging without PCS. Reprod. Biomed. Online. 27(10), 140-146.
Herrero, J., Alberto, T., Ramsing, N.B. (2010). Unking successful implantation with the exact timing of cell division events obtained by time-lapse system in the EmbryoScope. Fertil. Steril. 94(4), 149.
Cruz, M., Perez-Cano, I., Cadea, B. (2011). Time-lapse video analysis provides a correlation between early embryo division kinetics and subsequent blastocyst formation and quality. Hum. Reprod. 26, 115.
Chamayou, S., Patrizio, P., Storaci, C. (2013). The use of morphokinetic parameters to select all embryos with full capacity to implant. J. Assist. Reprod. Genet. 30, 703-710.
Campbell, A., Fishel, S., Duffy, S. (2013). Embryo selection model defined using morphokinetic data from human embryos to predict implantation and live birth. ASRM. 24, 1228.
Basile, N. (2014). Increasing the probability of selecting chromosomally normal embryos by time-lapse mor-phokinetics analysis. Fertil. Steril. 101(3), 699-704.
Leibenthron, J., Montag, M., Koster, M. (2012). Influence of age and AMH on early embryo development realised by time-lapse imaging. Hum. Reprod. 27, 135.
Bellver, J., Mifsud, A., Crau, N. (2013). Similar morpho-kinetic patterns in embryos derived from obese and normoweight infertile women: a time-lapse study. Hum Reprod. 28(3), 794-800.
Ciray, H.N., Aksoy, T., Coktas, C. (2012). Time-lapse evaluation of human embryo development in single versus sequential culture media - a sibling oocyte study. J. Assist. Reprod. Genet. 29(9), 891-900.
D^browski, S., Faundez, R., Petrajtis-Golobus, M., Gajewski, Z. (2015). Poklatkowa analiza rozwoju zarodka; zastosowanie w biotechnologii rozrodu. Rozrod i mastitis u bydla. Warszawa, 6-13.
Cmammn nadiumm do peda^ii 28.09.2016
