CC BY
23
МЕТОДИ I МЕТОДИКИ
© niTbKO В. А., Лопнова О. О., Сшшо Н. М., Павлов I. В., Черкашина Я. О. УДК 618.177-089.888.11. 616.697-008.8-08 Штько В. А., Лопнова О. О., С'ш'то Н. М., Павлов I. В., Черкашина Я. О.
ВИКОРИСТАННЯ PVP У ПРОЦЕДУР1 ICSI ТА ЙОГО ВПЛИВ НА ЯК1СТЬ ЕМБР1ОН1В
ДЗ «УкраГнський медичний центр акушерства, пнекологи та репродуктологп мшютерства охорони здоров'я УкраГни» (м. Харкiв)
Вступ. Розвиток лабораторних метод1в л1куван-ня фактору чолов1чого безпл1ддя в циклах допом1ж-них репродуктивних технолопй (ДРТ) призвело до появи революцмно! технологи, а саме Ытрацито-плазматично! 1н'екцИ сперматозо1да в ооцит (ICSI) [6]. На сьогодншнм день частота виконання про-цедури ICSI в 6вроп1 становить 69% вщ загально! к1лькост1 вс1х циктв ДРТ [8]. При цьому багато клшк вибирають ICSI в якост1 стандартно! техн1ки заплщ-нення, нав1ть коли немае показань на !! проведення або в1дсутн1й чолов1чий фактор безпл1ддя [2]. Процедура ICSI вимагае забору окремих сперматозо!-д1в до ш'екцмно! п1петки для введення !х в ооцити. При цьому сперматозощи необх1дно ¡ммоб1л1зувати. Найб1льш поширеним методом ¡ммобкгмзаци, який не вимагае спец1ального обладнання, е метод при якому сперматозощи перем1щуються у в'язке се-редовище для зниження !х рухливост1, з подальшим перетином хвоста, так званий метод класичного ICSI [9]. У переважнм б1льшост1 клшк ДРТ для цих цтей використовуються середовища, до складу яких входить пол1в1н1лп1ролщон (PVP). П1д час проведення процедури IKCI разом ¡з сперматозощом всередину ооцита потрапляе незначна юльюсть PVP, i оск1льки PVP не може дифундувати назовы, i не розщеплю-еться лiзосомальними ферментами, вш залишаеть-ся в яйцеклггиы протягом тривалого перiоду часу [3], що може негативно позначитися на процес за-плiднення. Також е числены лтературы данi про те, що середовища, що мютять PVP, негативним чином впливають на сперматозощи, що знаходяться в них i ступiнь цього впливу залежить вщ часу експозицй' клiтин в таких середовищах [4,5,7].
Таким чином, необхщы новi пiдходи для змен-шення токсичного ефекту PVP при маыпулящях зi спермою, а також пщ час проведення процедури ICSI за допомогою зниження концентраци PVP, зменшення часу експозици спермив в PVP або ви-користання систем вщбору сперматозощв, що не мютять в своему складi PVP.
Мета роботи полягала в зменшенн негативного впливу PVP на статевi кттини i ембрiони людини при проведены процедури ICSI, шляхом зниження його концентраци в середовищi iммобiлiзацi!.
Об'ект i методи досл1дження. Було проведено 25 процедур ICSI. Середня юльюсть зртих ооцитiв, отриманих пiсля прицтьно! пункци фолiкулiв, склала 11,2 ооцита на жшку. Всього було отримано 280 зр^ лих ооцитiв, як були оцiненi i роздiленi на двi рiвно-значнi групи.
Сперматозо!ди були пiдготовленi шляхом цен-трифугування в градiентi густини з наступним фло-туваням методом Swim-UP [1].
Чашки для ICSI були пщготовлеы за методом, ре-комендованим виробником середовищ.
Для iммобiлiзацi! сперматозо!дiв використову-валося середовище, що мiстить PVP у таких концен-трацiях: для першо! групи 5%, для друго! групи 10%.
В роботi використовувалися середовища вироб-ництва Cook Medical (Australia).
Процедура ICSI проводилася за допомогою ш-вертованого мiкроскопа Olimpus ix-71 i мiкроманiпу-лятора Narishige (Japan).
Результати дослщжень та Ух обговорення. На сьогоднiшнiй день PVP широко застосовуеться в повсякденнм практик екстракорпорального за-плiднення при виконаны методики ICSI, а також при рiзних манiпуляцiях, що проводяться зi сперматозо-!дами.
Однак все частше з'являються свiдоцтва про токсичний вплив PVP, не ттьки на ооцити, а й на сперматозо!ди при проведеннi мантуляцм, якi по-трiбно провести перед процедурою ICSI [4,5,7]. Так, деякими авторами показано, що середовища на основi PVP призводять до значно! фрагментацп ДНК сперматозощв [7]. ^м того, PVP виявляеться в ембрюнах, пригнiчуючи !х розвиток, i скорочуючи юльюсть клггин на стад^ бластоцисти [4].
Ми провели дослщження з оцЫки впливу пони-женого вмюту PVP в середовищi iммобiлiзацi! спер-матозо!дiв на подальше заплiднення i розвиток емб-рiонiв до переносу !х в порожнину матки (5 добу). З таблиц видно, що зниження концентраци PVP у 2 рази призводило до достовiрного пщвищення юль-кос^ заплiднених яйцеклiтин на 6,4%. Ктьюсть емб-рiонiв з вираженою фрагментащею (>10%) значно знижувалась в разi використання PVP у концентраци 5%. При цьому не вщбувалося пригычення розви-
тку ембрюыв, тобто ембрюыв, як досягли стадiI 8 бластомерiв було бiльше в rpyni, в якiй використовува-лось середовище 3i зменшеним вмiстом PVP. На 5-у добу роз-витку оцЫювали кть-кiсть ембрiонiв, якi досягли стадп блас-тоцисти. Як видно з таблицу пiдвищення
вмiсту PVP в середови!^ iммобiлiзацiI призводило до зменшення кiлькостi отриманих бластоцист.
Таким чином, можна зробити висновок, що на-явнiсть PVP в середови!^ iммобiлiзацiI спермато-зоIдiв призводить не ттьки до зменшення кiлькостi заплщнених ооцитiв, а й до зниження якост отриманих методом ICSI ембрюыв, порушення процесу дроблення i швидкостi нарощування клiтинноI маси ембрюнами.
Таблиця.
Вплив концентрацм PVP на розвиток ембрюшв
Концентра^я PVP у середовищi iммобiлiзацN, % Ктьюсть ооцилв, шт. Оцшка заплщнення через 16-20 годин Оцшка ембрюшв через 72 години тсля заплщнення Оцшка ембрюшв через 120 годин тсля заплщнення (ктьюсть бластоцист)
Ембрюни з фрагменташею >10% Ембрюни з юльюстю бластомерiв >8
5 140 108 (77,1%) 12 (11,1%) 70 (64,8%) 46 (42,6%)
10 140 99 (70,7%) 21 (21,2%) 62 (62,6%) 38 (38,4%)
Перспективи подальших дослiджень. Для
подальшого удосконалення процедури селекци та iммобiлiзацiI сперматозоIдiв в процес проведення ICSI необхiдно мiнiмiзувати або ж зовЫм виключити PVP з середовищ, в яких проводиться експози^я i вiдбiр сперматозоIдiв, таким чином, усунувши мож-ливiсть попадання PVP в ооцит i, вiдповiдно, в емб-рiон.
Л1тература
1. Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. ВОЗ: Медико-генетический научный центр РАМН (перевод на русский язык), 2012. - 291 с.
2. Dutch Society of Obstetrics and Gynaecology (NVOG). Guideline: Male Subfertility. The Netherlands: Utrecht, 2010.
3. Jean M. Intracytoplasmic sperm injection with polyvinylpyrrolidone: a potential risk / M. Jean, S. Mirallie, M. Bourdineau [et al.] // Fertil. Steril. - 2001. - Vol. 76. - P. 419-420.
4. Kato Y Effect of polyvinylpyrrolidone on sperm function and early embryonic development following intracytoplasmic sperm injection in human assisted reproduction / Y Kato, Y Nagao // Reprod. Med. Biol. - 2012. - № 11. - P. 165-176.
5. Kato Y Effect of PVP on sperm capacitation status and embryonic development in cattle / Y Kato, Y Nagao // Theriogenology. -2009. - Vol. 72. - P. 624-635.
6. Palermo G. Pregnancies after intracytoplasmic injection of single spermatozoon into an oocyte / G. Palermo, H. Joris, P. Devroey [et al.] // Lancet. - 1992. - Vol. 340. - P. 17-18.
7. Sujit Raj Salian B.Sc. Frozen-thawed spermatozoa from oligozoospermic ejaculates are susceptible to in situ DNA fragmentation in polyvinylpyrrolidone-based sperm-immobilization medium / B.Sc. Sujit Raj Salian, Ph.D. Guruprasad Kalthur, M.Sc. Shubhashree Uppangala [et al.] // Andrology. - 2012. - Vol. 98, № 2. - Р. 321-325.
8. The European IVF-Monitoring Consortium for the European Society of Human Reproduction and Embryology. Assisted reproductive technology in Europe: results generated from European registers by ESHRE, 2012 / Hum. Reprod., 2016. - P. 1638-1652.
9. Van Steirteghem A. High fertilization and implantation rates after intracytoplasmic sperm injection / A. Van Steirteghem, Z. Nagy, H. Joris [et al.] // Hum. Reprod. - 1993. - № 8. - P. 1061-1066.
УДК 618.177-089.888.11. 616.697-008.8-08
ВИКОРИСТАННЯ PVP У ПРОЦЕДУР1 ICSI ТА ЙОГО ВПЛИВ НА ЯК1СТЬ ЕМБР1ОН1В
niTbKO В. А., Лопнова О. О., Сшшо Н. М., Павлов I. В., Черкашина Я. О.
Резюме. На сьогодышнм день PVP широко застосовуеться в повсякденнм практик екстракорпорального заплщнення при виконанн методики ICSI, а також при рiзних маыпулящях, що проводяться зi сперматозо'дами. Однак все частше з'являються свщоцтва про токсичний вплив PVP, не ттьки на сперматозощи, а й на ооцити при проведены мантуляцм, як потрiбно провести перед процедурою ICSI. Ми провели доогмдження з оцЫки впливу пониженого вмюту PVP в середовищi iммобiлiзацiI сперматозощв на подальше заплщнення i розвиток ембрюыв до переносу ix в порожнину матки. Показано, що наявнють PVP в середовищi iммобiлiзацii сперматозощв призводить не ттьки до зменшення ктькост заплщнених ооци^в, а й до зниження якост отриманих методом ICSI ембрюыв, порушення процесу дроблення i швидкост нарощування ктмтинно''' маси ембрюнами.
Ключовi слова: ооцити, сперматозощи, ICSI, ембрюни, PVP.
УДК 618.177-089.888.11. 616.697-008.8-08
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ PVP В ПРОЦЕДУРЕ ICSI И ЕГО ВЛИЯНИЕ НА КАЧЕСТВО ЭМБРИОНОВ
Питько В. А., Логинова О. А., Синило Н. Н., Павлов И. В., Черкашина Я. О.
Резюме. На сегодняшний день PVP широко применяется в повседневной практике экстракорпорального оплодотворения при выполнении методики ICSI, а также при различных манипуляциях, проводимых со сперматозоидами. Однако все чаще появляются свидетельства о токсическом влиянии PVP, не только на
сперматозоиды, но и на ооциты при проведении манипуляций предшествующих процедуре ICSI. Мы провели исследования по оценке влияния пониженного содержания PVP в среде иммобилизации сперматозоидов на последующее оплодотворение и развитие эмбрионов до переноса их в полость матки. Показано, что наличие PVP в среде иммобилизации сперматозоидов приводит не только к уменьшению количества оплодотворенных ооцитов, но и к снижению качества полученных методом ИКСИ эмбрионов, нарушению процесса дробления и скорости наращивания клеточной массы эмбрионами.
Ключевые слова: ооциты, сперматозоиды, ICSI, эмбрионы, PVP.
UDC 618.177-089.888.11. 616.697-008.8-08
THE USE OF PVP IN ICSI PROCEDURE AND ITS INFLUENCE ON EMBRYO QUALITY
Pitko V. A., Loginova O. O., Sinilo N. M., Pavlov I. V., Cherkashyna Ya. O.
Abstract. At present the frequency of ICSI procedure performing in Europe amounts to 69% of the total number of ART cycles. Polyvinylpyrrolidone (PVP) is widely used in the daily practice of in vitro fertilization with ICSI techniques implementation, as well as for various spermatozoa manipulations.
Literature data indicate that the media containing PVP have the negative influence on spermatozoa within them and the extent of this effect depends on the time exposure of cells in such environments.
However, the data regarding the toxic effects of PVP not only on spermatozoa, but also on oocytes are stated more often because during ICSI procedure the small amount of PVP gets inside the oocyte with spermatozoon, and since PVP can not diffuse out, and is not splitted by lysosomal enzymes, it stays in the oocyte for an extended period of time, which can adversely affect the process of fertilization.
The aim of the study was to reduce the negative PVP influence on germ cells and human embryos during ICSI procedure by decreasing its concentration in the immobilization environment.
The assessment of influence of the low PVP content in the environment of spermatozoa immobilization for the further fertilization and embryos development before transferring them into the uterine cavity was performed. It was determined that the presence of PVP in the environment of spermatozoa immobilization caused not only reduction of the number of fertilized oocytes, but also impaired the quality of embryos obtained by ICSI, affected the process of fragmentation and the rate of cell mass increasing in embryos.
It was conducted 25 ICSI procedures with 280 mature oocytes that were evaluated and divided into two equal groups. The medium containing PVP was used for spermatozoa immobilization in following concentrations: 5% in the first group, 10% in the second one.
The cups for ICSI were prepared according to the method recommended by the media manufacturer.
The environments produced by Cook Medical (Australia) were used in research.
The study regarding evaluation of the influence of low PVP content in the environment of spermatozoa immobilization for the further fertilization and development of embryos before transferring them into the uterine cavity (day 5) was carried out. The decrease of PVP concentration in 2 times caused significant increase in the number of fertilized oocytes by 6.4%. The number of embryos with marked fragmentation (>10%) significantly decreased to 11.1% in comparison with 21.1% in the case of PVP usage in 5% concentration. In the process the inhibition of embryos development was absent, namely the embryos that reached the stage of 8 blastomeres were presented more in group where environment with reduced PVP content was used. On 5 day of development the number of embryos that reached the blastocyst stage was evaluated. The increase of PVP content in the immobilization environment caused the decrease in the number of obtained blastocysts 42.6% compared to 38.4%.
In prospect a more detailed study based on wider sampling should be carried out to provide the better results while reducing PVP concentration.
Keywords: oocytes, spermatozoa, ICSI, embryos, PVP.
Рецензент — проф. Громова А. М.
Стаття надшшла 08.12.2016 року
