CC BY
28
УДК 636.2:612.621.9
Шаран М. М., © кандидат бюлопчних наук, mm sharan@yahoo.com
1нститут бюлогп тварин УААН, м. Львгв Гузеватий О. С., кандидат бюлопчних наук, oleg guzevatiy@ukr.net Укратська академ1я аграрних наук, м. Кигв
Шаловило С. Г., доктор сшьськогосподарських наук, професор, skotarstvo@gmail.com Льв1вський нацюнальний утверситет ветеринарног медицини та бютехнологт
iм. С. З. Гжицького
П1ДВИЩЕННЯ ПРИЖИВЛЕНОСТ1 ЕМБР1ОН1В, ОДЕРЖАНИХ IN VITRO, ЗАСТОСУВАННЯМ Б1ОЛОГ1ЧНО АКТИВНИХ РЕЧОВИН
Наведено результати вивчення впливу бiологiчно активних речовин (БАР) на приживлення ембрютв, отриманих in vitro. Встановлено, що застосування БАР (т'екщя сурфагону, тсолвту, iмукору, димексиду; згодовування втамтно-мтерального премжсу; трансплантащя бластомерiв дегенерованих ембрютв) тдвищило приживлетсть ембрютв, одержаних in vitro, на 9,1-18,9 %.
Ключовi слова: телиця-рецитент, in vitro заплiднення, трансплантащя, бiологiчно активт речовини, приживлення
Вступ. Трансплантащя i крюконсервування ембрюшв дае можливкть збер^ати генетичш ресурси i за необхщност швидко вщновити поголiв'я. Але трансплантащя ембрюшв, як один i3 способiв розмноження племшних тварин, трудомктка i дорога. Гормональш обробки, не зважаючи на розроблеш в останш роки новi схеми полювуляци, суттево не тдвищили загального рiвня одержання якiсних ембрiонiв [1, 2].
Розроблений у 80-ri роки ХХ стол^тя спосiб одержання поза оргашзмом придатних до трансплантаци ембрiонiв значно знизив ïx вартiсть, порiвняно з неxiрургiчно вимитими ембрiонами вiд корiв-донорiв. Такi сучаснi бiотеxнологiï як in vitro заплщнення яйцеклiтин, капацитацiя спермив та in vitro культивування зигот дозволяють повнiше реалiзувати фiзiологiчнi можливост вiдтворення цiнниx високопродуктивних тварин. Проте, тсля неxiрургiчноï трансплантацiï ембрiонiв, отриманих in vitro, рiвень приживлення не перевищуе 40 % [3]. Факторiв, якi впливають на приживлення ембрюшв, багато i вони дослщжувалися вченими впродовж декшькох десяткiв рокiв. Нашими попередшми дослiдженнями вивчалася приживленiсть трансплантованих ембрiонiв пiд впливом бiологiчно активних речовин (аналог ганадолiберину, iнсолвiт, iмукор, диметилсульфоксид) i встановлено значне зростання рiвня приживлення нативних i деконсервованих ембрюшв [4, 5]. Також дослщжено вплив в^амшно-мшерального живлення на приживлешсть ембрiонiв [6].
© Шаран М. М., Гузеватий О. £., Шаловило С. Г., 2009
327
У зв'язку з цим метою наших дослщжень було дослщити вплив окремих бюлопчно активних речовин (БАР) на приживлення ембрюшв, одержаних in vitro.
Матер1ал i методи. Першим етапом дослiджень був вiдбiр ооцитiв з яeчникiв корiв. Яечники доставляли в лабораторiю з Ки!вського м'ясокомбiнату не пiзнiше як через 1,5-2 години тсля забою тварин у термосi Í3 стерильним фiзiологiчним розчином (0,9 % NaCl) та антибiотиками (100 од/мл пенщилшу i 100 мкг/мл стрептомiцину) при температурi +32 - +38°С. У лаборатори яечники двiчi промивали свiжоприготовленим фiзiологiчним розчином. Ооцити отримували надрiзаючи лезом видимi антральнi фолiкули, вимивали середовищем Дюльбекко ("Serva") з 1 од/мл гепарину ("Biochemi") i 40 од/мл гентамщину ("Reanal"), виловлюючи пастерiвською пiпеткою та оцiнювали за морфолопчними ознаками пiд контролем мiкроскопа МБС-9.
Ооцит-кумулюснi комплекси корiв культивували в чотирилункових планшетах ("Costar") протягом 27 год при температурi 38,5°С та 5 %-ному вмiстi СО2 в повг^ у краплях середовища 199 з 10 %-ною попередньо шактивованою (+56°С, 30 хв) фетальною сироваткою корiв, 2,5 мкг/мл ФСГ ("Schering corporation"), 1,0 мкг/мл естрадюлу ("Serva"), 2,5 МО/мл люте!шзуючого гормону ("Serva"), 2,0 мМ натрiю пiрувату ("Sigma"), 2,92 мМ кальцiю лактату ("Sigma"), 40 мкг/мл гентамщину.
Шсля дозрiвання поза органiзмом яйцеклiтини пiдлягали заплщненню in vitro. Для заплiднення in vitro яйцекл^ин корiв використовували заморожену сперму бугая «Матадор-109» iз спермобанку 1нституту розведення i генетики тварин УААН. Капацитацiю сперматозовдв здiйснювали гепарином (100 од/мл) за методикою Parrish J.J.et al. (1988). Спiльне шкубування яйцеклiтин i сперматозовдв проводили в термостаи при температурi 38,5°С та 5 %-ному вмкт СО2 в повггр^ у краплях середовища Fert.-TALP. Пiсля 12-18-годинного спiльного iнкубування яйцекл^ини i зиготи вiдмивали 3-5 разiв культуральним середовищем для розвитку ембрюшв та переносили в краплi цього ж середовища для подальшого культивування.
Для проведення другого етапу експерименту у СТзОВ «Городище» Луцького району Волинсько! област вiдiбрали 73 телищ укра1нсько1 чорно-рябо! молочно! породи вiком 14-18 мiсяцiв з живою масою 360-380 кг i сформували за принципом груп-аналогiв чотири групи: контрольну i три дослщних. Пщдослщним тваринам синхронiзували статеву охоту дворазовим введенням естрофану з штервалом 11 дшв в сумарнiй дозi 1000 мкг клопростенолу.
Телицям 1 дослщно! групи в 0-й день синхрошзованого статевого циклу iн'ектували БАР (сурфагон, iнсолвiт, iмукор, диметилсульфоксид), дози яких визначенi у попереднiх дослiдженнях (табл. 1) [5]. Тваринам 2 дослщно! групи впродовж одного мкяця згодовували премжс, у склад якого входили в^амши А, D, E та мкроелементи мiдь, цинк, кобальт, йод. Склад i дози премксу визначили за результатами дослщжень грунту, кормiв i води у господарствг Телицям 3 дослщно! групи трансплантували ембрюни, одержанi in vitro, разом з бластомерами дегенерованих ембрюшв.
328
На 7-й день статевого циклу у Bcix рецишенив проводили ректальне дослщження статевих оргашв на наявшсть i стан жовтого Tina яечниюв. Якiсть жовтого тша оцiнювaли i клaсифiкувaли як вщмшне, добре, зaдовiльне i слабо виражене. За результатами дослщжень провели нехiрургiчну пересадку in vitro одержаних ембрюшв за загальноприйнятою методикою.
Таблиця 1
Схема шдготовки телиць-рецишен^в_
Групи тварин Застосування бюлопчно активних речовин
Контрольна, n=18 Загальна схема шдготовки
1 дослщна, n=20 В 0-й день циклу ш'екщя БАР (сурфагон, шсолит, 1мукор, диметилсульфоксид)
2 дослщна, n=18 Згодовування премжсу протягом мюяця до трансплантаци ембрюшв
3 дослщна, n=17 Трансплантащя бластомер1в з бластоцист разом з in vitro отриманим ембрюном
Синхроншсть статевого циклу донора i рецишента витримували в межах ±12 годин. Результати приживлення оцшювали через 60 дшв тсля пересадки ембрюшв за даними ректального дослщження на тшьшсть.
На 7-й день синхрошзованого статевого циклу у пщдослщних телиць вщбирали проби кровi для визначення прогестерону i естрадюлу-17р. Концентрaцiю прогестерону та естрадюлу визначали на iмуноферментному aнaлiзaторi з використанням нaборiв ИммуноФА-Ш (для прогестерону, росшського виробництва) i ELISA (для естрадюлу, виробництва США).
Отримаш цифровi дaнi опрацьовували статистично за допомогою програми Microsoft Office Excel.
Результати дослщження. В результат шкубаци 336 ооцитiв i зaплiднення !х in vitro отримали 54 морули i 7 бластоцист (що становить 18,2 %), яю використали у другш сери дослiдiв з трансплантаци ембрiонiв. Для чистоти експерименту для пересадки телицям-рецитентам використали 52 морули. Решта ембрiонiв слугували мaтерiaлом блaстомерiв для 3 дослщно! групи. Бластомери вщдшяли мiкропiпеткою i трансплантували разом з in vitro отриманими ембрюнами.
Шсля обробки телиць-реципieнтiв встановлено, що пщ впливом БАР жовте тшо яечника сформувалося у 80,0 % тварин 1 дослщно! групи, що на 18,9 % бшьше, шж у контрольних тварин (табл. 2).
Зростання кшькост тварин з жовтим тшом головним чином пов'язано з ш'екщею сурфагону, який викликае додаткове видшення люте!нiзуючого гормону, що забезпечуе формування жовтого тiлa в яечнику.
При згодовувaннi премiксу телицям жовт тiлa в яечниках утворилися у 72,2 % з них, що на 11,1 % бшьше, шж у контрольних тварин. У 3 дослщнш груш кшьккть телиць з жовтим тшом яечника майже така сама, як у контрольних тварин, що цшком лопчно, оскшьки у цих групах тваринам проводили аналопчну обробку до пересадки ембрюшв.
329
Таблиця 2
Функцшнальннй стан статевих оргашв i приживлення _трансплантованих ембршшв_
Показники Групи тварин
контрольна 1 дослщна 2 дослщна 3 дослщна
Вщбрано телиць, n 18 20 18 17
Виявлено тварин з жовтим тшом, n-% 11-61,1 16-80,0 13-72,2 11-64,7
Трансплантовано ембрюшв, n 11 16 13 11
Тшьних рецишенпв, n-% 4-36,4 8-50,0 7-53,8 5-45,5
Пiсля Hexipypri4Hoi' трансплантаци ембрюшв, отриманих in vitro, з окремими бластомерами приживлешсть у рецишенив становила 45,5 %, що на 9,1 % бшьше, нiж у контрольних телиць.
Очевидно, пересадка ембрюшв з бластомерами збшьшуе масу ембрiонiв, а вiдповiдно i лютеотропний сигнал. Це опосередковано тдтверджуе данi S.Iwasaki et al. (1990), О.В.Щербака (2001) про достовiрно меншу питому масу ембрiонiв, одержаних поза оргашзмом [7, 8].
Концентрацiя стерощних гормонiв у кровi телиць-реципiентiв на 7-й день синхрошзованого статевого циклу тдтверджуе позитивну дiю дослiджуваних БАР на органи розмноження, що виражаеться у пщвищенш приживлення ембрюшв, отриманих in vitro. Так, рiвень прогестерону у кровi телиць 1 i 2 дослщних груп вищий вщповщно на 54,9 % (p<0,01) та 29,9 % (p<0,05), нiж у контрольних тварин (табл. 3).
Таблиця 3
Концентращя стероУдних гормон1в у кров1 телиць-рецип1снт1в перед
трансплантац1сю ембршшв
Гормони Одинищ вим1ру Групи тва рин, n=5
контрольна 1 дослщна 2 дослщна 3 дослщна
Прогестерон нмоль/л 6,02±0,56 9,33±0,91** 7,82±0,54* 6,14±0,72
Естрадюл-17р пмоль/л 35,64±2,52 28,42±2,14* 31,40±3,72 33,28±3,96
Примггка: * — p<0,05, ** — p<0,01 — в1роцдна р1зниця мiж контрольною i дослвдними группами
У 1 дослiднiй групi тдвищення концентраци прогестерону викликаеться введенням аналога гонадотропiн-рилiзiнг гормону, який стимулюе видшення люте!шзуючого гормону, котрий у свою чергу посилюе секрецш прогестерону i знижуе рiвень естрадiолу на 20,3 % (p<0,05). Зростання рiвня прогестерону у 2 дослщнш групi, мабуть, пов'язано з додатковим синтезом стерощних гормошв тд впливом вiтамiнiв та мжроелеменив, що поступали в оргашзм реципiентiв з премiксом.
Таким чином, приживлешсть трансплантованих ембрюшв, одержаних in vitro, при застосуванш комплексу БАР, згодовуванш вггамшно-мшерального премiксу, введеннi бластомерiв дегенерованих ембрiонiв значно пiдвищуеться.
Висновки.
1. Застосування БАР (iн'екцiя сурфагону, iнсолвiту, iмукору, димексиду; згодовування вггамшно-мшерального премiксу; трансплантацiя додаткових бластомерiв) пщвищуе приживленiсть ембрiонiв, одержаних in vitro, на 9,1-18,9 %.
330
2. Пщ впливом БАР Bipor^HO пщвищуеться концентращя прогестерону (p<0,05-0,01), що вказуе на посилення лютеотропно! ди та приживлення ембрюшв, отриманих поза оргашзмом.
Л1тература
1. Довгдник з репродуктивно! бютехнологи велико! рогато! худоби. [Текст]: За редакщею проф. Шаловила С.Г. — Львiв, 2004, 150 с.
2. Шаран М.М. Ефектившсть застосування комплексу лшосома-ФСГ для iндукцi! множинно! oвуляцi! у кopiв-дoнopiв. [Текст]: /Шаран М.М., Шаловило С.Г./ Сiльський господар,- 2008 -№ 7-8. — С.7-8
3. Мадгч А.В. Раннш ембpioнальний розвиток тварин in vivo i in vitro та бютехнолопчш фактори його регуляци. [Текст]: Автореф. дис... д-ра с.-г. наук: 03.00.20 /; Бшоцерк. держ. аграр. ун-т. — Бша-Церква, 2004. — 35 с. — укр.
4. Шаран М.М. Вплив бюлопчно активних речовин на функцюнальний стан репродуктивних оргашв i приживлення ембрюшв у рецишенпв [Текст]: /Шаран М.М., Шаловило С.Г. Пасщький М.Д./ Наук.тех.бюл.ГБТ УААН, Львiв - 2004. - випуск 5, № 3, С.218-222
5. Шаран М.М. Застосування комплексу бюлопчно активних речовин для тдвищення приживлення ембрюшв у телиць-рецишенив. [Текст]: /Шаран М.М./ Наук.-тех.бюл. 1нституту бioлoгi! тварин УААН i ДНК1 ветпpепаpатiв та кормових добавок. Львiв. - 2008. - Випуск 9. - №4. - С.202-208
6. Шаловило С.Г. Вплив бюлопчно активних речовин у рацюнах рецишенпв на приживлення ембрюшв. [Текст]: /Шаловило С.Г., Шаран М.М./ Матеpiали доповщей наук.-вир. конф. "Теоретичш i пpак-тичнi аспекти породо-утворювального процесу у молочному та м'ясному скотарствг" Ки!в —1995 — С. 317
7. Щербак О.В. Пopiвняльний аналiз ooцитiв, яйцеклiтин та ембрюшв велико! рогато! худоби i свиш, що були oтpиманi в умовах in vivo та in vitro [Текст]: Автореф. дис... канд. с.-г. наук: 03.00.20 /; УААН. 1н-т тваринництва. — Х., 2001. — 19 с.
8. Iwasaki S. Incidence of embryos with chromosomal anomalies in the inner cell mass among bovine blastocysts fertilized in vitro. [Text]: /Iwasaki S, Nakahara T./ Theriogenology. 1990 0ct;34(4):683-90.
Summary M. Sharan, O. Guzevatiy, S. Shalowylo THE INCREASE OF IMPLANTATION RATE OF EMBRYOS OBTAINED IN VITRO BY USE OF BIOLOGICALLY OF ACTIVE MATTERS The study results on influence of biologically active matters (BAM) upon embryo implantation rate obtained in vitro are shown. Revealed, that application of BAM (injection of surfagon, insolvit, imucor, DMSO, feeding of vitamin-mineral premix, transplantations of additional embryo blastomeres) increased implantation rate of embryos obtained in vitro by 9,1-18,9 %.
Стаття надшшла до редакцИ 14.04.2009
331
