Посилення ембріонально-маткового сигналу у телиць- реципієнтів з використанням бар Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

УДК 636.2.453.3

Шаран М. М., © кандидат бюлопчних наук, тт [email protected] 1нститут бюлогп тварин УААН, м. Львгв

ПОСИЛЕННЯ ЕМБРЮНАЛЬНО-МАТКОВОГО СИГНАЛУ У ТЕЛИЦЬ-РЕЦИШеНТШ З ВИКОРИСТАННЯМ БАР

Наведено результати дослгдження введення бластомер1в при пересадц деконсервованих ембрюшв на посилення ембрюнально-маткового сигналу. Встановлено, що введення бластомер1в при нех1рург1чшй трансплантацп деконсервованих ембрюшв посилюе ембрюнально-матковий сигнал, що тдтверджуеться збыьшенням ктькост\ б\лк\в стшки матки телиць-рецишент1в, вгроггдним зростанням концентрацп прогестерону в гх кровI та тдвищенням р1вня приживлення на 12,9 %.

Ключовi слова: телиця-рецитент, бластомер, трансплантащя, приживлення, прогестерон, бтки стшки матки.

У даний час загибель ембрюна тсля трансплантацп в матку рецитента найчастше ощнюють як результат невстановленого або перерваного бiохiмiчного Залогу» мiж ембрюном i маткою, розшифрувати який повшстю поки що не вдаеться [1]. Провщна роль в цьому <^алозЬ> належить трофобласту ембрюна та секреци ембрюном i маткою специфiчних бшюв ваптностг При вивченш структури специфiчних проте!шв вагiтностi корiв дослiдникам вдалося видiлити два рiзновиди бiлкiв, один з яких був щентичний а-фетопроте!ну (вiдомому в медициш як АФП) [2]. Хоч функщя АФП повнiстю не встановлена, проте вважають, що вiн виконуе осмотичну i транспортну роль, здатний зв'язувати естрогени i забезпечувати iмунологiчний захист плоду вщ материнського органiзму [3, 4].

Деяю вченi вважають, що штенсившсть сигналiв трофобласта, якi подае ембрюн реципiенту, залежить вiд кшькосп життездатних зародкових клiтин [5]. Очевидно, юнуе критична маса таких кл^ин, при зниженнi яко! ембрiон втрачае здатшсть подавати достатньо iнтенсивнi лютеотропш сигнали. Крiм того, вiдомо, що при крюконсервуванш i наступному розморожуванш частина клiтин трофобласту гине, а отже i зменшуеться !х маса.

У зв'язку з вищевказаним, метою наших дослщжень було дослiдити вплив введення бластомерiв дегенерованих зародкiв при трансплантацп деконсервованих ембрюшв на !х приживлення у телиць-рецишенив.

Матер1ал 1 методи. Для проведення експерименту в СТзОВ «Городище» Луцького району було ввдбрано 50 телиць украшсько! чорно-рябо! молочно! породи вiком 14-18 мкящв з живою масою 360-380 кг i сформовано за принципом груп-аналопв двi групи: контрольну i дослщну по 25 голiв у кожнш.

© Шаран М. М., 2009

247

Пщдослщним тваринам синхрошзували статеву охоту дворазовим введенням естрофану з штервалом 11 дшв в сумарнш дозi 1000 мкг клопростенолу.

На 7-й день статевого циклу у вЫх рецишенив провели ректальне дослiдження статевих органiв на наявшсть i стан жовтих тiл яечниюв. Якiсть жовтих тiл оцiнювали i класифiкували як вiдмiннi, добрi, задовшьш i слабо вираженi. За результатами дослщжень провели нехiрургiчну пересадку деконсервованих ембрюшв за загальноприйнятою методикою.

Крюконсервоваш ембрiони розморожували впродовж 8 секунд на повiтрi при кiмнатнiй температурi i витримували 2 хвилини у водянш банi при температурi +30°С. Для цього пайету з ембрюном занурювали пластмасовим корком у воду для лшвщацп повiтряних промiжкiв i змiшування розчинiв сахарози та глщерину. Розморожену таким чином пайету витримували ще 10 хвилин при юмнатнш температурi i впродовж 20 хвилин проводили пересадку рецитентам у просвгг рогу матки, на сторонi якого було вщмшне або добре виражене жовте тшо яечника. При трансплантаци ембрiонiв телицям-реципiентам дослщно! групи разом з ембрюном пересаджували бластомери дегенерованих ембрюшв.

Синхроншсть статевого циклу донора i реципiента витримували в межах ±12 годин. Результати приживлення оцшювали через 60 дшв шсля пересадки ембрюшв за даними ректального дослщження на тшьшсть.

На 7, 13, i 17-й днi синхрошзованого статевого циклу у пiддослiдних телиць вщбирали проби кровi для визначення концентраци прогестерону i естрадiолу-17ß. У щ ж днi проводили прижиттеву трансцервжальну бiопсiю ендометрiю у 3 телиць з кожно! групи за допомогою металевого розширювача власно! конструкций Процедуру виконували пiд сакральною етдуральною анестезiею, за потреби вводили препарат ксилазину (седазин). У зiскобах ендометрш визначали вмiст бiлкових фракцiй шляхом електрофорезу у 7,5 % та 12,5 % полiакриламiдному гелi за присутност додецилсульфату натрiю (ДСН).

Для проведення електрофорезу у 12,5 % ДСН-ПААГ до супернатанту з дослщжуваних тканин (0,1 мл) додавали ДСН i 2-меркаптоетанол, вiдповiдно, 0,1 мл 10 % i 0,01мл, шкубували 10 хв. при t 100° С, охолоджували та додавали 0,1 мл 40 % розчину сахарози. У лунки концентруючого гелю вносили 0,07 мл зразки i маркерний барвник — 0,01 % розчин бромфенолового синього. ¡дентифжували окремi бшки за допомогою стандартного набору бшюв-маркерiв з молекулярними масами (кДа): 94,6 (Cellulase); 66,2 (BSA); 45,0 (Ovalbumin); 31,0 (Carbonic anhydrase); 21,5 (Trypsin inhibitor); 14,4 (Lysozime). Шсля завершення електрофорезу зони бiлкiв проявляли за допомогою барвника [32]. Вщсотковий вмкт бiлкових фракцiй визначали за допомогою аналiзатора фореграм АФ-1.

Отримаш цифровi данi опрацьовували статистично за допомогою програми Microsoft Office Excel.

Результати дослщжень. Шсля тдготовки телиць-рецишенив до трансплантаци ембрiонiв кiлькiсть тварин з функцюнально активними жовтими тшами яечникiв у контрольнiй i дослщнш групах було приблизно однаковим i

248

становило вщповщно 76,0 % i 80,0 % (табл. 1). Шсля нехiрурriчноl пересадки деконсервованих ембрюшв приживлешсть у телиць дослщно! групи була на 12,9 % бшьшою, порiвняно з контрольними тваринами i становила 55,0 %.

Очевидно, пересадка ембрюшв з бластомерами збшьшуе масу ембрюшв, а вщповщно i лютеотропний сигнал.

Таблиця 1

Функцшнальннй стан статевих оргашв 1 приживлення трансплантованих

Показники Групи тварин

контрольна дослщна

Кшьшсть тварин, п 25 25

Кшьшсть телиць з жовтим тшом, п-% 19-76,0 20-80,0

Пересаджено ембрюшв, п 19 20

Кшьшсть тшьних рецишенпв, п 8 11

Приживлешсть, % 42,1 55,0

Концентрацiя стерощних гормонiв у кровi пiддослiдних тварин суттево змшювалася в динамiцi з 7 по 17 днi синхрошзованого статевого циклу (табл. 2). Так, якщо на 7-й день статевого циклу тобто в день трансплантацп ембрюшв рiвень прогестерону в кровi контрольних i дослiдних тварин був майже однаковим, то на 13-й день циклу концентращя гормону у дослщних рецишенив була вищою на 25,3 % (р<0,05), нiж у контрольних телиць.

Таблиця 2

Концентращя стеро'щних гормошв у кров1 телиць-рецишен^в (п=5, М±т)

Гормон 7 день циклу 13 день циклу 17 день циклу

Групи тварин

контрольна дослщна контрольна дослщна контрольна дослшна

Прогестерон, нмоль/л 6,28± 0,62 6,42± 0,44 8,73± 0,65 10,94± 0,68* 14,26± 1,24 18,45± 1,18*

Естрадюл, пмоль/л 38,54± 2,72 35,87± 3,04 32,34± 1,72 27,52± 1,16* 24,17± 1,22 21,87± 1,04

Примтка: * — р<0,05 — в1рог1днар1зниця м1ж контрольною I дослгдними групами

Така ж тенденщя збереглася i на 17-й день статевого циклу — концентращя прогестерону в кровi дослщних тварин була вищою на 28,3 % (р<0,05) порiвняно з контрольними рецитентами. Збiльшення критично! маси ембрюна за рахунок введення бластомерiв посилюе лютеотропний сигнал в ендометри, який стимулюе видiлення жовтим тшом яечника прогестерону. При цьому концентращя естрадюлу знижуеться: на 13-й день статевого циклу на 14,9 % (р<0,05), а на 17-й день — на 9,5 %.

Аналiзуючи результати електрофорезу бiлкiв ендометрiю телиць-реципiентiв, слiд вiдзначити, мiж контрольною i дослiдною групами встановлено певш розбiжностi (рис. 1). Зокрема, як у контрольних, так i дослщних тварин на 13-й i 17-й дш синхронiзованого статевого циклу виявлено

249

бшки з молекулярною масою 45-50 кДа, що приблизно вщповщае маркеру Ovalbumin, та 66-70 кДа, що вщповщае маркеру BSA.

13-й день 17-й день

Рис. 1. Електрофореграма бшюв ендометрп телиць-рецишен™ на 13-й i

17-й дш синхронiзованого статевого циклу

1, 2, 3 - контрольш тварини; 11, 21, 31 - дослщш тварини

Наявшсть вказаних бшкш свщчить про характерш змши в ендометрп при шдацп ембрюна та початку його шплантаци, що вщповщае вказанш стадп розвитку зародка i узгоджуеться з даними Дж. Батлера i спшавторш (1982) [2].

Кр1м того, на електрофореграмах видно значно бшьш1 юлькосл вказаних бшкш у дослщних тварин. Це, очевидно, пов'язано з тим, тд впливом збтьшення критично'1 маси ембрюна через посилення лютеотропного сигналу матки зростае концентрац1я прогестерону, який стимулюе прол1феративш процеси в ендометрп з видшенням бшкш 1з вказаною молекулярною масою. Роль цих бшкш до кшця не з'ясована, але юнують гшотези про ïx 1мунодепресивн1 властивост1 [6, 7].

Висновки.

При нех1рурпчнш трансплантацп деконсервованих ембрюнш з додатковим введенням бластомерш дегенерованих зародкш посилюеться ембрюнально-матковий сигнал, що тдтверджуеться збшьшенням кшькост1 бшкш ендометрш з молекулярною масою 45-50 кДа та 66-70 кДа, в1ропдним зростанням концентрацп прогестерону в кров1 (p<0,05) та тдвищенням ршня приживлення у телиць-рецитентш на 12,9 %.

250

Л^ература

1. Мадисон В. В. Трансплантация эмбрионов в практике разведения молочного скота. [Текст]: /Мадисон В. В., Мадисон В. Л./ — М.: Агропромиздат — 1988. — 128 с.

2. Butler J. E. Detection and partial characterization of two bovine pregnancy-specific proteins. [Text]: /Butler J. E., Hamilton W. C., Sasser R. G., Ruder C. A., Hass

G. M., Williams R. J./ Biol Reprod. 1982 Jun;26(5):925-33.

3. Smith K. M. Distribution of alpha 1-fetoprotein in fetal plasma, allantoic fluid, amniotic fluid and maternal plasma of cows. [Text]: /Smith K. M., Lai P. C., Robertson

H. A., Church R. B., Lorscheider F. L./ J Reprod Fertil. 1979 Sep;57(1):235-8.

4. Pospisil M. Effect of immunosuppressive agents on the blastogenic response of mouse spleen T and B lymphocytes. I. Culture conditions and the evaluation system. [Text]: /Pospisil M., Draber P., Hofman J., Nouza K., Klapacova J./ Folia Biol (Praha). 1978;24(3):185-98.

5. Blomberg А. Blastocyst elongation, trophoblastic differentiation, and embryonic pattern formation. [Text]: /Blomberg А., Hashizume К., Viebahn С./ Reproduction — 2008— 135 181-195

6. Yuan J.X. Increased expression of heat shock protein 105 in rat uterus of early pregnancy and its significance in embryo implantation. [Text]: /Yuan J.X., Xiao L.J., Lu C.L., Zhang X.S., Liu T., Chen M., Hu Z.Y., Gao F., Liu Y.X./ Reprod Biol Endocrinol. 2009 Mar 13;7:23.

7. Hashizume K. Analysis of uteroplacental-specific molecules and their functions during implantation and placentation in the bovine. [Text]: /Hashizume K./ J Reprod Dev. 2007 Feb;53(1): 1-11.

Summary M. Sharan

STRENGTHENING OF EMBRYO-UTERINE SIGNAL IN HEIFERS-RECIPIENTS WITH USE OF BIOLOGICALLY ACTIVE MATTERS

The study results on influence of introduction of blastomeres along with transplantation of thawed embryos on strengthening of embryo-uterine signal are shown. It is set, that at unsurgical transplantation of thawed embryos the embryo-uterine signal increases with use of blastomeres, resulted in increasing of uterine wall proteins quantity in heifers-recipients, significant rise of progesterone concentration in their blood and rise of implantation rate by 12,9 %.

Стаття надшшла до редакцИ 30.04.2009

251