CC BY
100
УДК 632.2.082.591.15.16
Шаран М. М., доктор сшьськогосподарських наук, шш sharan@yahoo.com 1нститут бюлогИ тварин НААН Украгни, м. Львгв Шаловило С. Г., доктор сшьськогосподарських наук, професор
Гримак Х. М. ©
Льв1вський нацюнальний утверситет ветеринарног медицини та бютехнологт
¡мет С. З. Гжицького
ЖИТТеЗДАТШСТЬ ЕМБРЮШВ ЗАЛЕЖНО В1Д ЯКОСТ1 ТА СТАД11 IX РОЗВИТКУ ПРИ НАДШВИДКОМУ ЗАМОРОЖУВАНН1
Наведено дат про вплив якост1 та стадИ розвитку ембрюшв на гх життездатшсть тсля розморожування I приживлюватсть тсля трансплантацИ' телицям-рецитентам. Встановлено, що використання компактних морул та раннх бластоцист вгдмгнног I доброг якост1 забезпечуе найвищ1 показники життездатност1 (85,7-89,5 %) та приживлення у телиць-рецитент1в (55,5-80,0 %).
Ключовi слова: крюконсервування, ембрюн, л1нолеат, олеат, стеарату холестеролу, надшвидке заморожування, втрифшацшне середовище
Вступ. Для устшного крюконсервування ембрюшв та пересадки 1х рецитентам виршальне значення мае правильна ощнка якост i бюлопчно! повнощнност зародюв. Враховуючи особливост розвитку ембрiона i затрачений час на його формування, можна судити про придатшсть ембрiона до заморожування чи пересадки, а також встановити прискорений розвиток чи вщставання у ньому. На 6-7 день тсля овуляци i заплiднення ембрюни потрапляють у верхню третину ропв матки, розвиваючись до стади морули чи бластоцисти. При цьому спостер^аеться диференцiацiя клiтин ембрiона на кл^ини трофобласту i ендодерми, тривае подш клiтин ембрiона, який перебувае у прозорш оболонцi.
Життездатнiсть ембрiонiв, вимитих на 7-8 день тсля штучного оамешння вщ корiв з шдукованою полiовуляцiею не перевищуе 60 % [1]. Однак, серед ембрюшв, визнаних життездатними, спостер^аються значш якiснi вщмшноси, якi, очевидно, мають важливе значення у виживанш ембрiонiв пiсля глибокого заморожування та деконсервування.
Тому метою дослщжень було визначення впливу якост та стадп розвитку ембрiонiв на 1х життездатнiсть пiсля розморожування i приживлюванiсть пiсля трансплантацп телицям-реципiентам.
Матер1ал 1 методи. На першому етат експерименту ми провели ретельний вiдбiр ембрiонiв на рiзних стадiях розвитку перед заморожуванням. При селекцп ембрюни подшяли на «вщмшш», «добрЬ», «задовшьш» i «незадовшьш». Бiологiчно якiсними вважали ембрiони, якi мали правильну кулясту форму, гомогенну свiтлу цитоплазму, непошкоджену прозору
© Шаран М. М., Шаловило С. Г., Гримак Х. М., 2010
178
оболонку, однакового розмiру бластомери з щшьним мiжклiтинним сполученням.
Не заморожували ембрiони, якi мали деформовану прозору оболонку, значнi вщхилення у структурi бластомерiв, неоднорiдний колiр (некроз) i просвiтлення кл^инно! маси, порушення зв'язкiв мiж бiльшiстю бластомерiв, ущiльнення та зморщення бластомерiв, а також таю, у яких спостер^ався вихщ клiтин у перивiтелiновий просир.
Для крiоконсервування використали 104 ембрюни, з яких 22 раннi морули (шостий день статевого циклу), 21 компактна морула (сьомий день циклу), 19 раншх бластоцист (сьомий день циклу), 24 зрших бластоцисти (сьомий день циклу) i 18 експандованих бластоцист (восьмий день циклу).
Результати дослщження. Пiсля деконсервування 21 ембрюн мав ознаки дегенративних змiн, що становить 20,2 % вiд кшькосп заморожених. Решта 83 ембрiонiв (79,8 %) зберегли нормальну морфологiчну структуру, або мали незначш вiдхилення вщ норми (табл. 1).
Таблиця 1
Морфолопчна якчсть 1 приживлення деконсервованих ембршшв залежно
вiд стадi'l' розвитку перед крiоконсервацicю
Показники Всього з них на стад1ях розвитку
мо рула бластоциста
рання компактна рання зрша експан-дована
Розморожено ембрюшв, п 104 22 21 19 24 18
Життездатних ембрюшв, п 83 17 18 17 20 11
% морфолопчно як1сних 79,8± 8,92 77,3± 10,26 85,7± 7,40 89,5± 9,15 83,3± 6,80 61,1± 6,65
Пересаджено ембрюшв, п 83 17 18 17 20 11
Тшьних рецишенлв, п 41 7 10 10 11 3
Р1вень приживлення, % 49,4± 7,32 41,2± 5,24 55,5± 5,81 58,8± 6,13 55,0± 8,35 27,3± 5,72
Високу життeздатнiсть тсля розморожування зберегли ембрiони практично на вах стадiях розвитку за винятком експандованих бластоцист (61,1±6,65 %). У раншх морул спостер^алося незначне зниження життездатност (77,3±10,26 %), порiвняно з компактними морулами (85,7±7,40 %), а також раншми i зрiлими бластоцистами (89,5±9,15 i 83,3±6,80 %).
Спостер^аеться тенденцiя до пiдвищення життездатностi раншх бластоцист (89,5±9,15 %), порiвняно з шшими стадiями розвитку ембрiонiв. Очевидно, це пов'язано з неоднаковою дегщратащею клiтин ембрiонiв у процесi заморожування та вiдтавання, або з шшими субоптимальними умовами, якi можуть викликати осмотичний шок чи мiжклiтиннi утворення льоду [2, 3].
179
Даш морфолопчно! оцшки якост ембрюшв пщтвердилися результатами !х трансплантаци. Зокрема, вiдзначаeться невелике зниження приживлюваност раннiх морул (41,2±5,24 %). Це, очевидно, пов'язано з тим, що рант морули i3 сво!м клiтинним комплексом менш придатнi до крюконсервування, нiж ембрiони на шзшших стадiях розвитку. Причиною цього е пiдвищена чутливiсть клiтин трофобласту, розмщених по периферп ембрiона, до процесу глибокого охолодження.
Найнижчi результати приживлюваност одержали при трансплантаци деконсервованих експандованих бластоцист (27,3±5,72 %).
Отже, стадiя розвитку ембрiона вiдiграе важливу роль в збереженш життедiяльностi пiд час заморожування i деконсервацп. Ембрiони на стади експандовано! бластоцисти дуже чутливi до охолодження, пiсля розморожування у них рiзко знижуеться виживання i здатнiсть до розвитку при трансплантаци рецитентам. Це, очевидно, обумовлено морфолопчними змiнами, якi непомiтнi при мжроскотчнш оцiнцi, або збiльшеними розмiрами бластоцел^ яка може впливати на осмотичш умови i утворення льоду всередиш ембрiона.
Нашими дослiдженнями встановлено, що найбшьш допустимим вiком ембрiонiв для заморожування надшвидким методом е морули, ранш та зрш бластоцисти. До аналопчних висновкiв прийшли у сво!х дослiдженнях P. Liehman et al. (1990), L. Ferry et al. (1994), M. A. Shehab-El-Deen et al. (2009), J. J. Stachecki et al. (2008) [4-7].
У наших дослщженнях спостер^алась вщмшшсть у життездатност ембрюшв тсля розморожування, як при морфолопчнш оцiнцi перед крюконсервуванням були «вщмшно!», «добро!», та «задовшьно!» якостi (рис. 3. Для дослщження розмороженi ембрiони помiщали в культуральне середовище при кiмнатнiй температурi. Використовуючи рiзнi збiльшення мiкроскопа (х 80120), обертали ембрiони у рiзнi сторони за допомогою мiкрокапiляра, особливу увагу звертаючи на прозору оболонку та перив^елшовий простiр.
Вiдбирали окремо вс ембрiони, якi мали ознаки нормальних та дегенерованих. Вiдiбранi «сумшвш» ембрiони переносили в окремi чашки Петрi i культивували при температурi 37°С у термостатi протягом чотирьох годин. Пiсля цього поновлювали спостереження за морфолопчними змшами в ембрюнах. Всього використано 127 ембрiонiв, з них 58 морул i 69 бластоцист.
У результат проведено! морфолопчно! оцшки культивованих ембрiонiв визначали !х придатнiсть до пересадки. Так, iз 16 морул вiдмiнно! якостi тсля розморожування не виявлено незадовiльних ембрюшв. Ембрюни з пошкодженою прозорою оболонкою, порушенням зв'язку мiж бластомерами класифжували як задовiльнi. Вiд загально! кшькост розморожених морул цей показник становив 25,0 %. Аналопчну кiлькiсть (25,0 %) становили вщмш морули, а найбшьше було добрих морул — 50,0 % (табл. 2).
Морули з оцшкою "добрГ' до крюконсервування, тсля розморожування були оцшеш таким чином: добро! якост — 41,6 %, задовшьно! — 45,8 % i незадовшьно! — 12,5 %. Найбшьшу кiлькiсть незадовiльних морул
180
— 33,3 % було отримано при заморожуванш задовшьних ембрюшв вщповщно! стадп.
Таблиця 2
Вплив якост ембршшв до заморожування на Тх життездатшсть шсля __ розморожування_
Стад1я розвитку та яшсть ембрюшв до заморожування п Яшсть ембрюшв шсля розморожування
вщмшш добр1 задовшьш незадовшьш
Морули, всього 58
з них: вщмшш, п-% 16 4-41,7 8-50,0 4-25,0
добр1, п-% 24 - 10-41,6 11-45,8 3-12,5
задовшьш, п-% 18 - - 12-66,7 6-33,3
Бластоцисти, всього 69
з них: вщмшш, п-% 22 6-27,2 12-54,5 4-18,1 -
добр1, п-% 27 - 12-44,4 12-44,4 3-11,1
задовшьш, п-% 20 - - 13-65,0 7-35,0
Аналогiчнi результати отримаш при крiоконсервуваннi бластоцист рiзно! якостi. Пiсля розморожування 22 вщмшних бластоцист 6 iз них (27,2 %), були оцшеш як ембрюни вщмшно! якостi, 54,5 % були добро! якост i 18,1 % задовшьних. Бластоцисти з морфолопчною ощнкою "добрГ' також успiшно перенесли процес крiоконсервування i пiсля розморожування зберегли досить високий рiвень життeздатностi (рис. 1).
0
• * ' * А»
V1 %
0
тт
□
2
5
Рис 1. Морули i бластоцисти пiсля деконсервування (х 96)
1 - рання морула; 2 - компактна морула; 3 - тзня морула; 4 - дегенерована морула (спостер1гаеться л1зис клтин); 5 - рання бластоциста; 6 - зрыа бластоциста; 7 - дегенерована бластоциста (некроз окремих бластомер1в).
Майже половина таких ембрюшв (44,4 %) були добро! якоси, така ж кшьюсть задовшьних i лише 11,1 % оцшеш як незадовшьш, мали значш дефекти прозоро! оболонки, рихле з'еднання мiж бластомерами.
Шсля розморожування задовшьних бластоцист було виявлено 65,0 % ембрюшв задовшьно! якоси, а 35,0 % були з ознаками некрозу та значних
181
пошкоджень, яю тсля культивування не розвивалися. Отриманi результати свщчать про недоцiльнiсть заморожування ембрюшв задовшьно! якостi.
Ретельна морфологiчна ощнка ембрiонiв перед заморожуванням мае суттевий вплив на !х життездатнiсть тсля розморожування. У ембрiонiв високо! якост пiсля розморожування вiдмiчався вищий !х рiвень приживлення.
Так, у морул вщмшно! якостi одержано 75,0 % тшьност реципiентiв, добро! — 55,5 % i задовiльно! — лише 29,6 % (табл. 3.30).
Таблиця 3
Прнжнвлювашсть деконсервованих ембршшв залежно ввд якост ембршшв
до заморожування
Стад1я розвитку та яшсть ембр1он1в до заморожування п Яшсть ембрюшв тсля розморожування
в1дмшш добр1 задовшьш
Трансплантовано морул, п 49 4 18 27
Т1льних рецип1ент1в, п 21 3 10 8
Приживлення ембрюшв, % 42,8 75,0 55,5 29,6
Трансплантовано бластоцист, шт. 59 6 24 29
Тшьних рецишенлв, п 27 5 14 8
Приживлення ембрюшв, % 45,7 83,3 58,3 27,5
Всього трансплантовано ембрюшв, п 108 10 42 57
Тшьних рецишенлв, п 48 8 24 17
Приживлення ембрюшв, % 44,4 80,0 57,1 29,8
Дещо вищi результати отриманi при трансплантацп бластоцист рiзно! якостi. Встановлена тшьшсть реципiентiв 83,3 % вщ пересадки вiдмiнних i, вiдповiдно, 58,3 % i 27,5 % при використанш добрих i задовiльних бластоцист.
Одержат результати свщчать про рацюнальшсть використання вщмшних та добрих ембрюшв для крюконсервування та пiдтверджують необхщшсть у ретельнiй селекцi! ембрiонiв перед !х глибоким заморожуванням, що узгоджуеться з дослiдженнями ряду авторiв [8, 9]. Ембрюни з морфологiчною ощнкою "задовшьш" недоцiльно крiоконсервувати, оскiльки тсля розморожування бшьша половина з них виявляються непридатними для пересадки. Таю ембрюни економiчно вигiдно вiдразу тсля вимивання пересаджувати реципiентам.
Висновки.
1. Ретельна селекщя ембрiонiв перед надшвидким заморожуванням рацiоналiзуе ефективнiсть !х трансплантацп, що тдтверджуеться високими показниками життездатноси та приживлення ембрiонiв.
2. Найвищу життездатнiсть пiсля розморожування проявили тзш (компактнi) морули — 85,7 % та рант бластоцисти — 89,5 %. Приживлення ембрюшв у цих групах теж було найвищим — вщповщно, 55,5 % i 58,8 %.
3. Трансплантащя ембрiонiв вщмшно! i добро! якостi забезпечила !х високий рiвень приживлення — вщповщно, 80,0 % i 57,1 %.
182
Л1тература
1. Сергеев Н. И. Руководство по трансплантации эмбрионов крупного рогатого скота /Н. И. Сергеев, Н. М. Решетникова, А. И. Абилов и др. // Дубровицы, 2008. — 115 с.
2. Ishimori H. Factors affecting survival of mouse blastocysts vitrified by a mixture of ethylene glycol and dimethyl sulfoxide / H. Ishimori, Y. Takahashi, H. Kanagawa // Theriogenology. — 1992. — V. 38(6). — P. 1175-1185.
3. Осташко Ф. И. Биотехнология воспроизведения крупного рогатого скота / Ф. И. Осташко // К.: Аграрна наука, 1995. — 180 с.
4. Liehman P. Vitrification of mouse 8-cell embryos with glycerol as a cryoporotectant / P. Liehman, O. Tepla, J. Fulka // Folia Biol. — Praha, 1990. — V. 36(5). — P. 240-251.
5. Ferry L. Bovine embryos cultured in serum-poor oviduct-conditioned medium need cooperation to reach the blastocyst stage / L. Ferry, P. Mermillod, A. Massip, F. Dessy // Theriogenology. — 1994. — V. 42(3). — P. 445-453.
6. Shehab-El-Deen M.A. Cryotolerance of bovine blastocysts is affected by oocyte maturation in media containing palmitic or stearic acid / M. A. Shehab-El-Deen, J. L. Leroy, D. Maes, A. Van Soom // Reprod. Domest. Anim. — 2009. № 44(1). — P. 140-142.
7. Stachecki J. J. A new safe, simple and successful vitrification method for bovine and human blastocysts / J. J. Stachecki, J. Garrisi, S. Sabino, J. P. Caetano, K. E. Wiemer, J. Cohen // Reprod. Biomed. Online. — 2008. — N 17(3). — P. 360-367.
8. Yokota Y. Birth of a healthy baby following vitrification of human blastocysts / Y. Yokota, S. Sato, M. Yokota, H. Yokota, Y. Araki // Fertil Steril. -2001. — V. 75(5). — Р. 1027-1029.
9. Петрушко М. П. Использование криоконсервированых эмбрионов человека во вспомогательных репродуктивных технологиях / М. П. Петрушко // Проблемы криобиологии. — 2000. — № 1. — С. 71-75.
Summary M. Sharan, S. Shalowylo, H. Grymak EMBRYO VIABILITY DEPENDING ON THE QUALITY AND STAGE OF
THEIR DEVELOPMENT AT THE SUPERFAST TO FREEZING
The data on the impact of quality and stage of embryos on their viability after thawing and implantation after transplantation heifer-recipients. Established that the use of compact morula and early blastocyst of excellent and good quality ensures the highest rates of viability (85,7-89,5%) and implantation in heifers-recipients (55,580,0%).
Стаття надшшла доредакцИ 17.09.2010
183
