CC BY
35
atment of
.V. Study ■ay drying
ilia D,G.
tractor
mis along
>va R.G.,
,A. Cold rvation of
extragent (ЭВР) on
lishapka
eutral fat
о Yu.N.,
laqueous
Control
teins
'acteristic
ko G.V.,
d in new
huk E.V. peroxides
A.P.,
dance to
lid phase o wastes
na N.V.
darfuring
ina V.A.
two-mass mt of the
eva L.N.
water of
ВОЗМОЖНОСТЬ ДОПОЛНИТЕЛЬНОГО СИНТЕЗА ЗАПАСНЫХ ЛИПИДОВ В СЕМЕНАХ ПОДСОЛНЕЧНИКА ПРИ ПОСЛЕУБОРОЧНОМ ДОЗРЕВАНИИ
С,Ю. КСАНДОПУЛО, В.Г. ЩЕРБАКОВ
Кубанский государственный технологический университет
Общелризнана возможность дополнительного синтеза запасных липидов для дозревающих семян подсолнечника, не потерявших связь с растением или его частями после уборки, например, сочной плодовой оболочкой или соцветием с частью стебля [1]. В то же время дополнительный синтез запасных липидов в свежеубранных (обмолоченных) семенах зачастую принимается очень скептически, а иногда отвергается полностью [2, 3].
Серьезным основанием для подобного скептицизма является в первую очередь недостаток в обмолоченных семенах субстратов, требующихся для синтеза липидов, а также необходимость более высокой, по сравнению с уборочной спелостью семян, обводненности их тканей, обязательной для течения синтетических процессов и работы ферментов — синтетаз [4]. Вместе с тем в ряде работ [5-7] отмечено снижение кислотного числа К.ч. масла в дозревающих после уборки свежеубранных семенах, что может быть следствием синтеза три-ацилглицеролов ТАГ, а также достоверное увеличение выхода масла из семян, перерабатываемых по завершении ими послеуборочного дозревания.
Следует подчеркнуть, что оба указанных фактора, объективно подтвержденные лабораторными исследованиями и производственной практикой, не могут расцениваться как однозначное свидетельство дополнительного синтеза ТАГ в свежеубранных семенах. Многообразие химического состава масличных семян, высокая реакционная способность жирных кислот ЖК, разнообразие форм связи их с нелипидной частью семян и, наконец, сложный состав соединений, объединяемых общим понятием липиды, — все это серьезно затрудняет достоверность объяснения снижения массовой доли свободных жирных кислот СЖК как результата участия их в синтезе ТАГ.
В 50-е годы авторами [8,9] для характеристики процессов в свежеубранных семенах, связанных с дополнительным накоплением в них масла, был предложен термин — ферментация масличных семян. К сожалению, сам метод ферментации — хранение семян после тепловой сушки без охлаждения — не сопровождается накоплением в них ТАГ, а увеличение выхода суммарных липидов при обезжиривании таких ферментированных семян не всегда подтверждается другими исследователями [10].
Позднее в работах [11, 12], посвященных выяснению характера взаимодействия липидов и белков семян под влиянием технологии обезжирива-
ния, объективно установивших возможность связывания и высвобождения липидов из белковолипидных комплексов в семенах и продуктах их переработки, утвердилось отрицательное мнение о возможности реального синтеза ТАГ в семенах после уборки. Снижение К.ч. масла в семенах после тепловой сушки [5, 13, 14] и хранения более убедительно объяснялось не дополнительным синтезом ТАГ, а связыванием СЖК в эфиронерастворимые комплексы с белками. Увеличение выхода масла из семян послеуборочного дозреваний '(от-лежки) можно объяснить разрушением белковолипидных соединений под действием тепловой обработки и послеуборочного хранения, а не синтезом ТАГ [ 10],тем более, что увеличение выхода липидов из семян в большей степени происходило за счет полярных липидов.
Широкое применение при исследовании липидов семян таких методов, как ТСХ. ГЖХ, во многом подтвердило эти представления, а развитие биохимии мембран позволило объяснить увеличение суммы извлекаемых липидов переходом их в легко извлекаемую форму липидов биомембран под влиянием разрушительных факторов, действующих на семена.
Однако результаты отдельных исследований в области синтеза и распада липидов в семенах растений не находят объяснения без допущения возможности синтеза ТАГ из диацилглицеролов ДАГ и СЖК. Несмотря на противоречивость этих данных, во многом обусловленных, по нашему мнению, отсутствием учета разнокачественности семян и различием условий их послеуборочной обработки, потенциальная возможность дополнительного синтеза запасных лйгшдов в семенах после уборки не может быть полностью отвергнута.
Наиболее серьезные возражения, исключающие такую возможность, основываются на представлении об отсутствии условий в семенах для действия ферментов класса синтетаз, в частности, трансфе-раз ацилов жирных кислот. В то же время бесспорна подтвержденная работами [4, 15, 16] высокая активность липолитических ферментов в свежеубранных дозревающих и хранящихся масличных семенах, в первую очередь липазы, фосфолипазы и лилооксигеназы даже при относительно низкой их влажности.
Выяснение разрушительных изменений в липидном комплексе дозревающих и хранящихся семян являлось целью многих исследователей. Активирование гидролитической функции липазы в свежеубранных семенах под влиянием начальных стадий тепловой сушки или активного вентилирования проявляется в росте К.ч. масла в семенах [3].
Гидролитическая деструкция фосфолипидов под действием фосфолипазы Д, показанная в [17, 18], также свидетельствует об активном состоянии ментов в семенах.
собый интерес представляет исследование каталитической функции фосфолипазы Д, выделенной из покоящихся и проросших семян хлопчатника [19]. Показано, что этот фермент способен катализировать не только гидролиз, но и синтез фосфатидилхолина, хотя гидролитическая и транс-ацилирующая функции фосфолипазы Д требуют для своего проявления различных внешних условий, включая присутствие воды, температуры и pH среды.
К аналогичным выводам приходят авторы [20], исследовавшие гидролиз ТАГ липазами. Согласно их данным, при недостатке воды технические препараты липазы катализировали не реакции гидролиза, а реакции синтеза ТАГ из глицерина и СЖК [21]; в системах с высоким содержанием воды те же препараты катализировали гидролиз ТАГ. Как и в случае с фосфолипазой Д, существенное влияние, наряду с обводненностью, оказывали pH и температура реакционной среды.
Можно предположить, что молекулы ферментов гидролаз при изменении внешних условий способны трансформироваться в синтетазы, хотя согласно существующей классификации эти ферменты принадлежат к различным классам и катализируй ют реакции различных типов.
Возможность подобной трансформации т -:дролаз подтверждена рядом работ. Технические препараты липаз растительного и микробного происхождения уже нашли применение в качестве биокатализаторов для синтеза липидов при промышленной переэтерификации жиров [21].
Все это свидетельствует о возможности течения в дозревающих семенах синтетических процессов, косвенным подтверждением чего является высокая активность липаз, обратимость их действия и присутствие в клетках семян исходных субстратов для сингетаз — СЖК и ДАГ.
Хотя практика подтверждает быстрое развитие в свежеубранных семенах процессов гидролиза липидов, перспективным является поиск условий, ведущих не к гидролизу, а к дополнительному синтезу в этих семенах запасных липидов — ТАГ.
Цель нашего исследования — изучение принципиальной возможности дополнительного синтеза ТАГ в масличных семенах при послеуборочном дозревании, а также выяснение влияния внешних условий на биохимические реакции при их послеуборочном дозревании и хранении.
Как известно, биохимические процессы в семенах определяются последовательным течением реакций, которые согласно основным представлением биохимии могут быть сведены к комбинации нескольких типов реакций, а именно: обратимых и последовательных. Рассмотрение последовательности сложных реакций упрощается, если последние протекают в стационарных или квззнстацио-
на^зных условиях и имеют лимитирующую стадию
Биосинтез ТАГ в семенах может быть отнесен к реакциям с лимитирующей стадией процесса за счет исчерпывания субстратов реакции в период созревания семян на материнском растении при полном прохождении генетического кода, а также при полном прекращении поступления субстратов к семенам при их послеуборочном дозревании после отделения от материнского растения. Это позволяет п'рименить методы формальной кинетики при описании данных процессов. Учитывая, что рассматриваемые реакции являются ферментативными, за основу выбрали теорию Михаэлиса— Ментен, как простейший случай описания подобных реакций, когда субстрат необратимо превращается в продукт одним ферментом:
Я + Е - ЭЕ - Р + Е, (1)
где 5, Е, БЕ, Р — соответственно субстрат, фермент, фермент-субстратный комплекс, продукт соответствующей реакции.
Действие липазы-гидролазы ЛГ на ТАГ может быть описано следующей реакцией:
ТАГ + Н20 + ЛГ -* ФСК ТАГ -*
- СЖК + ДАГ +ЛГ. (2)
Образовавшийся фермент-субстратный комплекс ФСК ТАГ распадается на первоначальные компоненты. С учетом возможности трансформации ЛГ в трансферазу-синтетазу ТС [21 ] запишем:
ЛГ - ГС. (3)
Действие ТС описывается уравнением:
ДАГ + ТС+ ЖК - ФСК ДАГ -*
ТАГ + Н20 + ТС. (4)
Для получения зависимостей для (2), (3), (4) использовали построение дифференциальных уравнений по закону действия масс, которое привело к следующей системе дифференциальных уравнений:
(1у\/(1х = -*1 г/1 г/2 г/3 + *2 г/4 + к8 г/8 ■ёуч/ёх = -*1 ух г/2 уз + Н ув 4уз/йх = -к\ у\ г/2 г/3 + {Н + кз) у\ -- Н уз + кь г/7 йу\/йх = к 1 у\ г/2 г/3 - (&2 +кз) г/4 , (5)
йуъ/(1т = кз у4 ~ кь г/7 г/5 г/б + г/8 кг ёуь/ёх = &з г/4 ~ кб у7 уе+к7 у& йут/йх - &4 уз ~ кь у7 + к2 уя ~ кь г/7 У5 У6 йуъ/(1т = Н г/7 уъ г/6 ~ (ку + къ) г/8 при следующих начальных условиях: г/1 (0) = уш ~ ТАГ
г/2 (0) = г/20 - НгО
уз (0) = г/зо ~ Л Г
г/4 (0) = г/40 ~ ФСК ТАГ (6)
г/5 (0) = г/50 ~ ЖК г/6 (0) = г/60 - ДАГ г/7 (0) = г/70 - ТС г/8 (0) = ото - ФСК ДАГ
Система (5) с начальными условиями (6) образует корректно поставленную математическую за-
дачу, т. тывая, неодно| ко числ чи испо та—Фе, [23]. 01 считать времен] нетичес
ТОВ, М01
стант, е
вестньи
Мида д
качеств
ров) бы
акций (
концен!
Началы
определ
поиске
пользов
СЖК,1
В кач
МЄНЄНИ!
квадраті ний кш показан та иного решенш определ: ров.
Такой констан получит веществ нашем < описать
г
1994
1ДИЮ
:ен к а за риод при 1кже атов
1НИИ
Это 1ети-, что
1ТИВ-
са—
юдо-
:вра-
(1)
фер-т со-
)жет
(2)
омп-
>ные
рма-
ием:
(3)
(4)
(4)
'НЫХ
пря-
мых
(5)
№
i6pa-э за-
ИЗВЕСТИЯ ВУЗОВ. ПИЩЕВАЯ ТЕХНОЛОГИЯ, № 3-4, 1994
дачу, т.е. имеющую единственное решение. Учитывая, что система (5) является нелинейной и неоднородной, интегрирование ее возможно только численными методами. Для решения этой задачи использовался одношаговый метод Рунге—Кун-та—Фельберга с автоматическим выбором шага [23]. Он позволяет с заданной погрешностью рассчитать изменение концентраций реагентов во времени. Очевидно, имея экспериментальную кинетическую кривую одного или нескольких реагентов, можно рассчитать значение неизвестных констант, входящих в систему (5). Для расчета неизвестных переменных применяли метод Нелдера— Мида для функции’от п переменных (л = 12). В качестве оптимизируемых переменных (параметров) были использованы константы скоростей реакций (&1 - к&), а также неизвестные начальные концентрации ЛГ, ФСК ТАГ, ТС, ФСК ДАГ, Начальное содержание ТАГ, влажность, ЖК, ДАГ определяли экспериментально. Кроме того, при поиске оптимальных значений 12 параметров использовалась экспериментальная кинетика ТАГ, СЖК, ДАГ (рис. 1, кривая о—о).
0,5
0,4
0,3
о,г сд
■ Й-И50
. .. s' _
а гее гоэ та
о loo гоэ эм
Рис. 1
В качестве оптимизируемой функции для применения метода Нелдера—Мида выбрана сумма квадратов отклонений экспериментальных значений кинетики ТАГ, СЖК, ДАГ от аналогичного показателя для того же момента времени, рассчитанного методом Рунге—Кунта—Фельберга при решении системы (5). Минимум этой функции определяет наилучший набор значений параметров.
Такой подход позволил не только рассчитать константы скоростей элементарных реакций, но и получить динамику изменений концентраций всех веществ, участвующих в приведенной модели. В нашем случае появилась возможность адекватно описать экспериментальные кривые с уровнем до-
стоверности 95%, а также получить динамику изменения концентрации ферментов липаз-гидро-лаз и липаз-трансфераз, фермент-субсгратных комплексов ТАГ и ДАГ. Основной анализ кинетики проводили по активным концентрациям и по их изменению (скорости) в процессе всего хранения. Это дало возможность предположить механизм формирования качества липидов при послеуборочном дозревании и хранении.
Рис. 2
Анализ по константам скоростей элементарных реакций оказался нецелесообразным, так как константы связаны друг с другом, но постоянны во всем рассматриваемом периоде.
Экспериментальные и расчетные данные показывают, что послеуборочное дозревание сопровождается не только отмеченным ранее снижением СЖК, но и изменением группового состава липидов семян — увеличением содержания ТАГ и снижением ДАГ{рис. 1).
Рис. 3
На рис. 2 показаны изменения относительных концентраций ферментов ЛГ, ЛС, ФСК ТАГ, ФСК ДАГ (соответственно 1,2,3, 4), рассчитанные по формулам (2), (3), (4). Происходит увеличение относительных концентраций фермента липазы-трансферазы ЛТ и уменьшение ЛГ, что может свидетельствовать о сдвиге реакции (кривая 3) в сторону образования ЛТ, причем по мере завершения дозревания концентрация липазы-трансфера-зы снижается. Относительная концентрация ФСК ДАГ (кривая 4) резко снижается и к концу периода исчерпывается полностью.
Эти результаты дают основание предположить течение остаточных синтетических процессов при послеуборочном дозревании. Концентрация ФСК
ТАГ (кривая 3), образующаяся при действии липазы на ТАГ, имеет тенденцию к росту на протяжении всего периода хранения семян.
Выявленное снижение содержания свободных СЖК обусловлено разностью концентраций ферментов ЛГ и ЛТ, одновременно действующих в семенах (рис. 3). Изменение концентраций ЛГ имеет четко выраженный максимум, в то время как концентрация ЛГ резко снижается в этот период. Можно предположить, что разности концентраций вносят вклад в формирование величины К.ч. масла в семенах, коррелирующих с концентрацией ЛТ. Экспериментальные данные по активностям липазы, полученные для этих же образцов, показали аналогичный характер зависимости. Отсюда экспериментальное определение активности липазы в семенах при послеуборочном дозревании по накоплению в липидах СЖК является результирующей действия двух ферментов — 4а 9,06
Ы
ill J
!КО у ° *
ill -0,03
V г -
f\JL
:оо
гос
зэс
«л
Рис. 4
ЛГ и ЛТ и обусловлено разностью их активностей (концентраций).
Скорость изменения концентрации ЛГ и ЛС (рис. 4, кривые / и 2 соответственно), свидетельствующая об интенсивном изменении активной составляющей каждого фермента, может служить для определения продолжительности полного завершения послеуборочного дозревания семян. Причем данная продолжительность, определенная по интенсивности тепловыделений и скорости изменения концентраций ферментов, составляет для семян подсолнечника 30 дней. Это служит еще одним доказательством правомерности предложенного механизма действия ферментов при послеуборочном дозревании масличных семян.
О продолжении процессов, аналогичных созреванию при послеуборочном дозревании семян, свидетельствует и идентичность последовательности превращения ЖК в составе ТАГ — олеиновой и линолевой, установленная для семян подсолнечника сортов Передовик и Первенец (таблица).
Изучая влияние факторов, под действием которых семена проходят послеуборочное дозревание и затем выходят из состояния покоя, можно найти условия, необходимые для оптимального действия в них липолитических ферментов. Это послужит основанием для поиска более эффективных способов послеуборочной обработки и хранения свеже-убранных семян.
Можно полагать, что активизация ферментативных процессов в семенах при послеуборочном дозревании обусловлена хранением семян с влаж*^ ностью, несколько превышающей критическую величину. В то же время послеуборочное дозревание свежеубранных семян невозможно при очень высоком уровне влажности из-за высокой активности в них процессов гидролиза. Нереально также послеуборочное дозревание сухих семян, в которых отсутствует свободная вода, необходимая для течения ферментативных реакций.
Таблица
Продолжительность хранения, сут Насыщенные ЖК, % от веса
Передовик Первенец
с18:1 с18:2 с18:1 с18:2
0 34,7 53,2 74,3 15.2
22 32.3 55.0 79.3 14.1
68 31,2 55,1 78,3 14,1
120 31.9 55.0 79,0 14,5
225 32.3 54,2 81,4 13,1
Как показали исследования в лабораторных и производственных условиях, для синтеза ТАГ в свежеубранных семенах при послеуборочном дозревании оптимальной является влажность, превышающая на 1,0-1,5% критическую. При такой относительно невысокой влажности послеуборочное дозревание семян сопровождается положительными изменениями их качества — дополнительным синтезом ТАГ за счет использования потенциальных возможностей приспособительных функций, заложенных в жизнеспособных масличных семенах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Подсолнечник / Под общ. ред. B.C. Пустовойта. — М.: Колос, 1975. — 591 с.
2. Дублянская Н.Ф., Попов П.С., Панфилова В.М. Биохимическая характеристика высокомасличных сортов подсолнечника селекции ВНИИМКа // Масло-жир. пром-сть.
— 1977. — № 3. — С. 8-11. .
3. Костенко В.К. Исследование в области сушки высокомасличных семян подсолнечника: Автореф. дис. ... канд. техн. наук. — Краснодар, 1962. — 25 с.
4. Кретович В.Л. Биохимия растений. — 5-е изд., испр. и доп. — М.: Высшая школа, 1980. — 445 с.
5. Заводцова Л.М. Пути повышения технологической ценности семян сои: Автореф. дис. ... канд. техн. наук. — Л., 1972. — 28 с.
6. Послеуборочное дозревание и хранение высокомасличного подсолнечника / Ксандопуло С.Ю., Ключкин В.В., Арутюнян Н.С. и др. // Масло-жир. пром-сть. — 1980. — № 12.
7. Опыт приемки семян подсолнечника по ГОСТ 22391-71 / Ксандопуло С.Ю., Данильчук С.И.. Белохвостиков И.И. и др. / / Масло-жир. пром-сть. — 1982. — № 3.
8. Колпакова И.П. Изучение и разработка методов по улучшению переработки подсолнечных семян: Автореф. дис. ... канд. техн. наук. — Краснодар, 1954.
татив-ючном влаж^ ую ве-вание нь вы-шости ке по-
1Т0РЫХ
1 тече-
'аблица
ец
-18:2
15,2
14.1
14.1 14,5
13.1
9. Голдовский А.М. Теоретические основы производства растительных масел. — М.: Пищепромиздат, 1958. — С. 114-116.
10. Иваницкий С.Б. Исследование комплекса связанных липидов высокомасличного подсолнечника при послеуборочной обработке и хранении в связи с условиями их технологической переработки: Автореф. дис. ... канд. техн. наук.
— Краснодар, 1972. — 24 с.
11. Ржехин В.П. Изменение белковых веществ масличных семян при действии на них тепла / / Тр. ВНИИЖ. — 1959.
— Вып. 19. — С. 311-328.',
12. Ржехин В.П., Красильников В.Н. К изучению превращений белковых веществ при действии на них тепла и других агентов / / Тр. ВНИИЖ. — 1963. — Вып. 23. —
13. Дублянская Н.Ф. Влияние условий уборки подсолнечника на состав масла // Масло-жир. пром-сть. — 1964. — № 11. — С. 10-12.
14. 5!п£1ег 01ва1еп ап(1 БсЬгоНадегипд ш то(1егиеп 0!тиЫеп. — Бе^еп—РеИе—БесЬве. — 1970. — 96. — № 4. — Б. 81-83.
15. Кретович В.А., Флоренская Т.Г, Влияние нагревания на белки и ферменты пшеничного зерна. — М.: АН'СССР. — 1958. — № 4. — С. 56-85.
16. Кретович В.А. Проблемы биохимии в пищевой промышленности // Журн. Всесоюз. хим. общ-ва им. Д.И. Менделеева. — 1965. — 10. — № I. — С. 257-265,
17. Романова Л.В., Сазы кина Н.А. Действие тепловой сушки на качество семян подсолнечника // Тр. ВНИИЖ. — 1961. — Вып. 22. — С. 26-51.
18. Рахимов М.М., Мадьяров Ш.Р., Зиявиддинов Ш.С. и др. Обнаружение и свойства двух форм фосфолипазы Д растений / / Биохимия. — 1977. — 42. — Вып. 5. —
С. 788-798.
19. Рахимов М.М., Мадьяров Ш.Р., Абдумаликов А.Х. Некоторые свойства фосфолипазы Л из семян хлопчатника // Биохимия. — 19/6. — 41. — Вып. 3. — С. 454-457.
20. Абдурахманов А., Рахимов М.М., Кадирова З.Х., Дав-рихов К. Ферментативный синтез глицеридов / / Узбекский биолог, журн. — 1983. — № 1. — С. 46.
21. Кадырова З.Х. Совершенствование технологии переэте-рификации липидов с применением биокатализаторов: Автореф. дис. ... канд. техн. наук. — Ташкент, 1984. — 18 с.
22. Березин И.В., Колесов А.А. Практический курс ферментативной кинетики. — М.: Изд-во МГУ, 1976. — 320 с.
23. Дьяконов В.П. Справочник по алгоритмии и программам на языке бейсик для персональных ЭВМ. — М.: Наука, 1987. — 239 с.
Кафедра технологии жиров
Кафедра биохимии и технической микробиологии
Поступила 15.02.94
ных и ТАГ в зм до-, пре-такой Зороч-ложи-юлни-ля по-льных )СЛИЧ-
М.:
Л. Био-ов под-юм-сть.
зкомас-I. техн.
яспр. и
эй цен-
- Л.,
Э80. — -71 /
И.И. и
о улуч-дис....
