CC BY
35
Л. Я. Калимуллина, Н. И. Петухова, В. В. Зорин
Восстановление ацетофенона с помощью клеток гриба ОеоЬпсНиш Бр. 85-1 в биоэмульсиях
Уфимский государственный нефтяной технический университет 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 243-19-35; е-mail: bio@rusoil.net
Выявлена способность клеток гриба ОеоЬпсИиш зр. 85-1 стабилизировать эмульсии органических растворителей (и-углеводородов, изооктана, хлороформа, этилацетата) в воде. Показано, что биокаталитическое восстановление ацетофе-нона в 1-фенилэтанол с помощью данного микроорганизма протекает более эффективно в биоэмульсиях, чем в буферном растворе.
Ключевые слова: микроорганизмы, биовосстановление, ацетофенон, биоэмульсии.
Оптически чистые энантиомеры широко используются в современном стереонаправлен-ном синтезе. Я- и 5-энантиомеры 1-фенилэта-нола, а также их производные являются синто-нами лекарственных препаратов, обладающих антидиабетическим, антидепрессантным и ан-тирабическим действием 1, а также используются при создании жидких кристаллов 2 и получении оптически активных полимеров, применяемых для разделения рацемических смесей органических энантиомеров 3-5.
Для получения оптически чистых вторичных спиртов широко используется энантиосе-лективное восстановление прохиральных карбонилсодержащих предшественников.
Эффективное использование целых клеток микроорганизмов для восстановления аце-тофенона до 1-фенилэтанола ограничивается низкой растворимостью субстрата в водных средах (0.692% (об/об)) 6, а также его ингибирующим или токсичным действием по отношению к биокатализаторам 7.
Одним из подходов к повышению эффективности в биотрансформации таких соединений является использование эмульсий, стабилизированных ПАВ, синтезируемыми микроорганизмами 8-10.
В настоящей работе исследована возможность реализации процесса восстановления ацетофенона с помощью гриба ОеоЬт1сНиш зр. 85-1 в биоэмульсиях.
Ранее была показана способность этого микроорганизма осуществлять с высокой скоростью энантиоселективную трансформацию ацетофенона в (Я)-( + )-1-фенилэтанол в буферном растворе 11.
Дата поступления 18.12.07
Обнаружено, что биомасса исследуемого микроорганизма способна стабилизировать эмульсии различных органических растворителей (табл. 1).
Таблица 1
Эмульгирующие свойства биомассы гриба Оео&1оМит вр. 85-1. Условия эмульгирования: сырая биомасса - 300 мг;
0.1 М фосфатный буфер рН 7.0-1 мл; растворитель - 1 мл; встряхивание - 2 мин
Эмульгируемый субстрат Индекс эмульгирующей активности Е48, % Тип эмульсии
н-гексадекан 90 м/в
н-тетрадекан 92 м/в
н-декан 74 м/в
изооктан 85 м/в
хлороформ 75 м/в
этилацетат 78 м/в
метилэтилкетон 77 м/в
Исследование карбонилредуктазной активности гриба ОвоЬпекит $р. 85-1 в биоэмульсиях с углеводородами и хлороформом показало, что она снижается в ряду н-гексан (0.845) > изооктан (0.84) > н-октан (0.81) > н-декан (0.79) > н-тетрадекан (0.76) > хлороформ (0.05). При этом в ряду углеводородов карбонилредуктазная активность гриба изменялась незначительно.
В результате исследования кинетики трансформации ацетофенона клетками исследуемого гриба, иммобилизованными в эмульсии воды и изооктана, было обнаружено, что в течение 24 ч конвертируется около 80% субстрата, внесенного в реакционную смесь в концентрации
5 г/л (рис. 1). При этом выход 1-фенилэтанола достигает 65% (от теоретического).
Сравнение начальной скорости восстановления ацетофенона биомассой гриба ОвоЬпекит $р. 85-1 в биоэмульсии и в буферном растворе показало, что более активно трансформация протекает в буфере (рис. 2а).
Начальная скорость восстановления аце-тофенона в буферном растворе возрастает с увеличением концентрации субстрата, тогда как в биоэмульсиях она практически не меняется. Вероятно, в водной фазе биоэмульсии
Время, ч
Рис. 1. Трансформация ацетофенона биомассой гриба Geotrichum sp. 85-1 в биоэмульсии (вода-изооктан). Условия реакции: 30 оС; 0.1М фосфатный буфер рН 7.0; растворитель изооктан; 300 г сырой биомассы/л; 5 г/л ацетофенона
4
з
2
1
о
Концентрация субстрата, г/л П буфер □ эмульсия
Концентрация субстрата, г/л
буфер
б
Рис. 2. Зависимость начальной скорости восстановления ацетофенона (а) и выхода 1-фенилэтанола (б) от концентрации субстрата при трансформации ацетофенона биомассой гриба Geotrichum sp. 85-1
а
поддерживаются низкие концентрации ацето-фенона за счет его большей растворимости в органической фазе.
Вместе с тем, увеличение концентрации субстрата до более, чем 5 г/л приводит к снижению выхода 1-фенилэтанола в буферном растворе, тогда как в эмульсии выход целевого продукта увеличивается и достигает максимального значения при 10—15 г/л ацетофено-на (рис. 2б).
Вероятно, при восстановлении в эмульсии буфер — изооктан создаются более мягкие условия по отношению к клеткам микроорганизмов, так как большая часть токсичного субстрата/продукта находится в органической фазе.
Экспериментальная часть
Грибы рода ОвоЬпеНит выращивали на комплексной среде следующего состава (г/л): глицерин — 30; дрожжевой экстракт — 10; пептон — 5; агар-агар микробиологический — 15; вода водопроводная — 1 л.
Питательные среды стерилизовали в автоклаве в течение 30 минут при 120 оС. Выращивание микроорганизмов осуществляли на чашках Петри при 30 оС в течение 72 ч.
Выращенную культуру собирали и отмывали от среды центрифугированием при 14000 об/мин в течение 15 мин, промывали трижды 0.1М фосфатным буфером рН 7.0, и использовали для трансформации рацемического 1-фенилэтанола.
Трансформацию ацетофенона в эмульсиях осуществляли в системе, содержащей 0.1М фосфатный буфер (рН 7.0) и изооктан в соотношении 1 : 1; биомассу микроорганизмов в количестве 300 г (сырой биомассы)/л; субстрат с исходной концентрацией 5.0 г/л. После внесения субстрата в реакционную смесь ее встряхивали до образования устойчивой эмульсии. Биовосстановление исследуемых соединений проводили в течение 24 ч при 30—32 оС и энергичном перемешивании на возвратно-поступательном шейкере.
Отбор проб производили после осаждения клеток центрифугированием в течение 10 мин при 5000 об/мин.
Изменение концентрации субстрата и образовавшегося в процессе трансформации продукта определяли в предварительно осветленных пробах. Концентрации веществ оценивали на хроматографе ЛХМ-8МД с пламенно-ионизационным детектором, на трехметровой колонке диаметром 3 мм с неподвижной фазой — полиэтиленгликольсебацинатом (5% от веса фазы), нанесенным на хроматон ^А'^
Выделение продуктов биотрансформации производили из осветленной центрифугированием реакционной смеси (15 мин при 5000 об/ мин). Целевые продукты трансформации высаливали №С1 и троекратно экстрагировали равным объемом диэтилового эфира. Экстракт сушили обезвоженным №2Б04, пробу концентрировали, отгоняя растворитель.
1-Фенилэтанол был идентифицирован методом ЯМР !Н и хроматографически по совпа-
дению времени удерживания с заведомо синтезированным образцом. Спектр ЯМР !Н 1-фе-
нилэтанола удовлетворительно совпадает
12
с описанным в литературе 12.
Литература
1. Hamada H., Miura T., Kumobayashi H., Matsuda T., Harada T., Nakamura K. // Biotechnol. Lett.- 2001.- V. 23.- P. 1603.
2. Nishimura T., Onoue T., Ohe K., Uemura S. // J. Org. Chem.- 1999.- V. 64.- p. 6750.
3. Raku T., Tokiwa Yu. // Biotechnol. Lett.-2004.- V. 26.- P. 665.
4. Krishnamurthy S., Chen S.H. // Macromole-
cules.- 1991.- V. 24.- P. 3484.
5. Mastrangelo J. C, Chen S. H. // Macromole-
cules.- 1991.- V. 24.- P. 3481.
6. Stephenson R. M. // J. Chem. Eng. Data.-1992.- V. 37.- P. 80.
7. Rogers R. S., Hackman J. R., Mercer V.,
DeLancey G. B. // J. Indust. Microbiol.
Biotechnol.- 1999.- V. 22.- P. 108.
8. Prichanout S., D. J. Leak, D. C. Stuckey. // Colloids and Surfaces. A: Physicochemical and Engineering Aspects.- 2000.- V. 166.- P. 177.
9. Smolders A. J. J., Pinheiro H. M., Noronha P.,
Cabral J. M. S. // Biotech. Bioeng.- 1991. — V. 38.- P. 1210.
10. Fadnavis N. W., Prabhakar Reddy N., Bhale-rao U. T. // J. Org. Chem.- 1978.- V. 43.-P. 3218.
11. Калимуллина Л. Я., Ханнанова Д. Г., Петухова Н. И., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2007. — Т. 14, № 1.- С. 148.
12. Nakamura K., Matsuda T. // J. Org. Chem.-1998.- V. 63.- P. 8957.
