CC BY
26
УДК 579.66:547.94
Л. Я. Калимуллина, Д. Г. Ханнанова, Н. И. Петухова, В. В. Зорин
Скрининг биокатализаторов для энантиоселективной трансформации ацетофенона
Уфимский государственный нефтяной технический университет 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел.: (347) 243-19-35; е-mail: bio@rusoil.net
С целью создания эффективных энантиоселек-тивных биокатализаторов для восстановления ацетофенона осуществлен скрининг микроорганизмов. Найдено четыре перспективных штамма, трансформирующие ацетофенон в концентрации 5 г/л с выходами 76—88 %.
Ключевые слова: биотрансформация, микроорганизмы, 1-фенилэтанол.
Оптически активный 1-фенилэтанол и его производные являются важнейшими синтона-ми при получении биологически активных молекул, используемых для создания ряда лекарственных средств, обладающих тромболи-тическим, противоастматическим 1, антидиабетическим, антидепрессантным действием, а также используемых в качестве средств против бешенства 2, вазодилататоров и бронхоли-даторов 1. Синтетические полимеры, содержащие асимметричную молекулу 1-фенилэтано-ла, используются для разделения рацемических смесей и в жидких кристаллах 3.
Перспективным подходом к получению оптически чистых энантиомеров 1-фенилэта-нола является биовосстанавление ацетофенона с помощью клеток дрожжей (Saccharomyces, Hansenula, Pichia, Candida, Rhodotorula) и грибов (Trichothecium, Rhizopus, Geotrichum и др.) 4. Однако в предложенных в настоящее время методах получения оптически активного 1-фенилэтанола с помощью биокатализаторов используются низкие концентрации ацетофе-нона, поскольку как субстрат, так и продукт трансформации ингибируют ферментативные системы микроорганизмов 5 6.
В связи с этим нами был осуществлен поиск более эффективных биокатализаторов.
Оценивалась способность всех исследуемых штаммов конвертировать ацетофенон в следующих (стандартных) условиях реакции: 0.1 М фосфатный буфер, рН 7.0; субстрат — 5 г/л; биомасса — 300 г (сырой биомас-сы)/л; аэробные условия, температура реакции 30—32 оС, время реакции — 24 ч.
Таблица 1
Конверсия ацетофенона покоящимися клетками микроорганизмов
Условия: 0.1 М фосфатный буфер, рН 7.0; субстрат - 5 г/л; биомасса - 300 г (сырой биомассы)/л; аэробные условия, температура реакции 30 оС, время реакции - 24 ч
Микроорганизмы Конвер-сия,% Удельная активность, г/(л*ч)
Geotrichum sp. M 98.6 1.79
Geotrichum sp. D 77.0 0.13
Geotrichum sp. P 50.8 0.22
Candida sake 777 89.6 0.73
Candida sp. 81-12 98.6 0.91
Candida guillermondii 49.6 0.21
Metschnikowia sp. 84-13 91.6 0.97
Анализ продуктов трансформации методами ГЖХ и ЯМР показал, что в реакционных смесях всех штаммов обнаруживается 1-фенилэтанол.
В результате исследования было обнаружено, что из 11 исследуемых штаммов 7 могут трансформировать ацетофенон с конверсией более 25% (табл. 1).
Наиболее активно конвертировали ацето-фенон штаммы Geotrichum sp. M, Candida sake 777, Candida sp. 81-12 и Metschnikowia sp. 84-13.
Исследование кинетики синтеза 1-фенил-этанола в стандартных условиях показало, что при восстановлении ацетофенона штаммами Geotrichum sp. M, Candida sp. 81-12, Candida sake 777 и Metschnikowia sp. 84-13 кривая накопления продукта выходит на плато через 9—11 ч трансформации и остается на том же уровне (рис. 1).
Для штаммов, трансформирующих в использованных условиях ацетофенон с выходом 1-фенилэтанола свыше 50%, исследованы оптические свойства полученных продуктов (табл. 2). Обнаружено, что штамм Geotrichum sp. M конвертирует субстрат с образованием преимущественно правовращающего энантио-мера 1-фенилэтанола, в то время, как остальные
Дата поступления 21.03.07 148 Башкирский химический журнал. 2007. Том 14. №1
штаммы трансформируют ацетофенон с превалирующим образованием левовращающих продуктов.
O
3
н =
=
о
12
Время, ч
18
24
- Geotrichum sp. M Geotrichum sp. D
- Candida guilIermondii
- Metschnikowia sp. 84-13
Geotrichum sp. P
- Candida sake 777
- Candida sp. 81-12
Условия реакции: 0.1М фосфатный буфер рН 7.0; 300 г сырой биомассы/л; 5 г/л ацетофенона; 30 оС;
Рис. 1. Кинетика накопления 1-фенилэтанола при трансформации ацетофенона микроорганизмами
Таблица 2
Удельная величина вращения, конфигурация
и оптическая чистота 1-фенилэтанола, полученного восстановлением ацетофенона с помощью различных микроорганизмов
Условия: 24 ч при 30 оС; 0.1М фосфатный буфер рН 7.0; 300 г сырой биомассы/л; 5 г/л ацетофенона
Микроорганизмы Md (Конфигурация) Оптическая чистота, % ее
Geotrichum sp. M + 17.5 (R) 29.8
Candida sake 777 -42.4 (S) 74.4
Candida sp. 81-12 -41.3 (S) 72.5
Metschnikowia sp. 84-13 -38.0 (S) 66.7
(R)-(+)-1-фенилэтанола CHCl3) 8.
[a]D + 58.7 (с=1.03,
штаммы 5^-типа
штаммы Л-типа
ацетофенон
OH
OH
(5)-1 -фенилэтанол
Экспериментальная часть
(Л)-1 -фенилэтанол
* Стандартная величина удельного вращения (S)-(-)-1-фенилэтанола [a]D —57 (с=5.12, CHCI3) 7
Таким образом, выявлены четыре перспективных штамма, энантиоселективно восстанавливающих ацетофенон: один R-типа (Geotrichum sp. M), и три штамма S-типа (Candida sp. 81-12, Candida sake 777, Metschnikowia sp. 84-13).
Дрожжи выращивали на агаризованной картофельно-сахарозной среде следующего состава (г/л): картофель — 90; сахароза — 10; агар-агар микробиологический — 15; вода водопроводная до 1 л. Грибы рода ОвоМеНит выращивали на комплексной среде следующего состава (г/л): глицерин — 30; дрожжевой экстракт — 10; пептон — 5; агар-агар микробиологический — 15; вода водопроводная — до 1 л.
Питательные среды стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при температуре 120 оС. Выращивание микроорганизмов осуществляли на чашках Петри при температуре 30 оС в течение 72 ч.
Выращенную биомассу собирали и отмывали от среды 0.1М фосфатным буфером рН 7.0, после чего использовали для трансформации ацетофенона.
Трансформацию ацетофенона покоящимися клетками осуществляли в 0.1М фосфатном буфере (рН 7.0), содержащем биомассу дрожжей в количестве 300 г (сырой биомас-сы)/л; субстрат с исходной концентрацией 5.0 г/л. Биовосстановление проводили в течение 2 сут при 30—32 оС при энергичном перемешивании на возвратно-поступательном шейкере.
Отбор проб производили после осаждения клеток центрифугированием в течение 10 мин при 5000 об/мин.
Изменение концентрации субстрата и образовавшегося в процессе трансформации продукта определяли в предварительно осветленных пробах. Концентрации веществ оценивали на хроматографе ЛХМ-8МД с плазменно-иони-зационным детектором на колонке 3000 х 3 мм с 5% полиэтиленгликольсабацината, нанесенного на хроматон N-AW.
5
4
3
2
1
0
0
6
Башкирский химический журнал. 2007. Том 14. №1
149
Выделение (R)- или (5)-1-фенилэтанола производили из осветленной центрифугированием реакционной смеси (15 мин при 5000 об/мин). Целевые продукты трансформации высаливали NaCl и троекратно экстрагировали равным объемом диэтилового эфира. Экстракт осушали над обезвоженным сульфатом натрия и концентрировали, отгоняя растворитель.
Образовавшийся продукт биотрансформации отделяли от непрореагировавшего субстрата хроматографированием на силикагеле Merk 60 (поры 0.063—0.200 мм), элюент — гек-сан — этилацетат, 8:1 7.
1-Фенилэтанол был идентифицирован методом ЯМР *Н и хроматографически по совпадению времени удерживания с заведомо синтезированным образцом. Спектр ЯМР 1-фенилэ-
танола удовлетворительно совпадает с описано
ным в литературе .
Оптическую чистоту полученного продукта
определяли с помощью автоматического поляриметра «Perkin Elmer» Model 341 при X = 589 нм.
Литература
1. Patent US 20050148801A1.
2. Hamada H., Miura T., Kumobayashi H., Matsu-da T., Harada T., Nakamura K. // Biotechnol. Lett.- 2001.- V. 23.- Р. 1603.
3. Raku T., Tokiwa Yu. // Biotechnol. Lett.-2004.- V. 26.- Р. 665.
4. Зорин В. В., Петухова Н. И. Панорама современной химии России. Современный органический синтез: Сб. обз. Статей.- М.: Химия.-2003.- 439 с.
5. Brzezinska-Rodak M., Zymanczyk-Duda E., Klimek-Ochab M., Kafarski P., Lejczak B. // Biotechnol. Lett.- 2006.- V. 28.- Р. 511.
6. Mandal D., Ahmad A., Khan M. I., Kumar R. // J. Mol. Catal. B.- 2004.- V. 27.- Р. 61.
7. Nakamura K., Fujii M., Ida Y. // Tetrahedron: Asymmetry.- 2001.- V. 12.-Р. 3147.
8. Nakamura K., Matsuda T. // J. Org. Chem.-1998.- V. 63.- Р. 8957.
150
Башкирский химический журнал. 2007. Том 14. J№1
