Внутрибрюшинное и подкожное моделирование эндометриоза у крыс Текст научной статьи по специальности «Ветеринарные науки»

внутрибрюшинное и подкожное моделирование эндометриоза у крыс

© М.А. Петросян, н.н. Балашова, л.с. Полянских, A.A. Егорова, А.в. киселев, М.И. ярмолинская, А.с. Молотков, т.г. траль, г.Х. толибова

ФГБНУ «НИИ АГиР им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург

Актуальность

В основе экспериментальных моделей эндометриоза лежит либо аутотрансплантация фрагментов матки в перитонеальную полость грызунов или не человекообразных обезьян, а также гетеротрансплантация тканей эндометрия человека иммунодефицитным мышам или на хо-риоаллантоисную оболочку куриного эмбриона. Каждая модель имеет определенные преимущества и ограничения. Модель спонтанного эндоме-триоза у приматов считается наилучшей для изучения данного заболевания в разных аспектах, однако высокие затраты на работу с такими видами животных ограничивают их использование в качестве экспериментальной модели. Работа с иммунодефицитными мышами не дает адекватной оценки иммунным изменениям, происходящим в организме человека при эндометриозе, а их короткое время жизни ограничивает длительность эксперимента. Те же недостатки имеет и модель хориоаллантоисной оболочки куриного эмбриона, хотя обе модели хорошо подходят для изучения механизмов, участвующих в инвазии и ангиогенезе начальных стадий формирования очага эндометриоза. Учитывая упомянутые причины, в последние годы значительно расширились исследования эндометриоза на мелких лабораторных животных с нормально функционирующей иммунной системой при хирургическом индуцировании заболевания путем аутотрансплантации фрагментов эндометрия в эктопические участки [1-4]. Такие модели позволяют изучать механизмы прикрепления клеток эндометрия в брюшной полости, исследовать терапевтические эффекты разных групп лекарственных препаратов, включая иммуномодуляторы, противовоспалительные, гормональные, антиангиогенные и другие средства, включая инновационные генотерапевти-ческие препараты, оценивать количество и размеры эктопических очагов в разные временные интервалы, а также разрабатывать новые не-инвазивные подходы к диагностике заболевания.

Несмотря на то что подходы к методологии моделирования эндометриоза хорошо известны, большое количество экспериментальных методик различается даже в рамках одной модели. Важную роль играет выбор вида и линии экспериментальных животных, их возраст, индивидуальный гормональный фон, проведение овариэктомии, пространственная ориентация трансплантата, техника

и место трансплантации, тип шовного материала, реабилитация и наличие заместительной гормональной терапии в послеоперационный период, а также индивидуальные особенности животных. Вариабельность условий и техники моделирования делают сравнение результатов, полученных в разных лабораториях, довольно сложным. За последние годы множество новых фармпрепаратов проходили доклинические испытания на моделях животных и лишь несколько из них были допущены до клинических испытаний, при этом ни один новый препарат так и не был внедрен в клиническую практику. По мнению экспертов, анализирующих систематические обзоры, основные проблемы возникают в результате использования неадекватных моделей животных, а также отсутствия стандартизации в дизайне и интерпретации результатов, полученных в доклинических испытаниях [5, 6]. Поэтому для проведения дальнейших поисковых и прикладных исследований создание оптимальной модели эндометриоза на базе представленных в литературе данных с учетом собственного опыта и наработок крайне актуально и необходимо.

Целью работы явилась оценка формирования эндометриоидных гетеротопий при хирургически индуцированном внутрибрюшинном и подкожном моделировании эндометриоза у крыс.

Материалы и методы

Экспериментальное моделирование эндометриоза проводили на 13 белых крысах линии Вистар в возрасте 3-5 месяцев путем аутотран-сплантации тканей матки в эктопические участки брюшной полости и подкожно. Для эксперимента отбирали животных с регулярным эстраль-ным циклом. Все операции выполняли в стадии эструс. Перед операцией проводили общую анестезию с помощью препарата Золетил 100. После фиксации животного в положении лежа на спине и подготовки места хирургического доступа выполняли вертикальный срединный разрез на коже около 2 см, а затем послойно на подкожной жировой клетчатке и брюшине, через который извлекали правый рог матки. Перевязку рога осуществляли в области маточно-трубного перехода и на 1 см выше маточно-цервикального перехода. Проводили двухстороннюю овариэктомию животных. Фрагмент рога матки между лигатурами около 0,5-1 см иссекали, вскрывали по стороне прикрепления брыжейки матки и рассекали на

ЖУРНАЛЪ АКУШЕРСТВА и ЖЕНСКИХЪ БОЛЪЗНЕЙ ТОМ LXV СПЕЦВЫПУСК 2016 ISSN 1684-0461 ■

8-й Международный научный конгресс «Оперативная гинекология — новые технологии» 8-th International Scientific Congress "Operative Gynecology-Advanced Technologies" 20-22 October 2016, Saint Petersburg

равные части размером 3 х 3 мм. Затем проводили аутотрансплантацию фрагментов ткани матки в брюшную полость и подкожно согласно следующей схеме. Одну часть имплантировали на брыжейку тонкой кишки к месту бифуркации сосудов на расстоянии 2-4 сосудов друг от друга, используя нити VICRYL*Plus АшйЬаС;епа1Л^огЬеегЬааг (4-0). Имплантированные ткани в окружении брыжейки аккуратно помещали в брюшную полость. Затем два фрагмента ткани матки имплантировали на брюшину передней брюшной стенки с правой и левой стороны на расстоянии 1 см от края операционной раны к месту бифуркации сосудов, используя те же нити. Еще два фрагмента подшивали подкожно к наружной части брюшины с двух сторон от операционной раны аналогично предыдущему варианту. Перед закрытием брюшной раны проверяли гемостаз, в случае необходимости лигировали сосуды, затем накладывали сплошной шов. Для ушивания кожной раны накладывали прерывистый шов по донати, используя нити VICRYL*Plus АпйЬаС;епа1/ашгаогЬеегЬааг (2-0). С целью профилактики послеоперационных осложнений в день операции животные получали антибактериальную терапию и обезболивающие препараты. В послеоперационный период кожный шов ежедневно обрабатывали антисептическими препаратами до момента заживления раны.

Со следующего дня после операции дважды в неделю в течение 1 месяца экспериментальные животные получали внутримышечно этинилэстра-диол в дозе 50 мкг/кг для создания эстрогеннасы-щенного гормонального фона.

Через месяц после операции экспериментальных животных выводили из опыта. После вскрытия проводили визуальную оценку формирования эндометриоидных гетеротопий в местах имплантации. имплантированные ткани замеряли в двух плоскостях, иссекали из окружающих тканей и фиксировали в нейтральном 10 % формалине для последующего гистологического исследования.

Результаты исследования

Проведенные нами ранее исследования показали, что при моделировании хирургически индуцированного эндометриоза на естественном эстрогенном фоне формирование и разрастание имплантированной ткани эндометрия в нехарактерном для нее месте происходит не более чем у 30 % (3 из 11) животных. Создание эстроген-насыщенного гормонального фона способствует формированию эндометриоидных образований более чем у 70 % (5 из 7) животных, а проведение овариэктомии с последующим назначением эстрогенов значительно повышает эффективность моделирования эндометриоза до 90 % (13 из 15) жи-

вотных [7]. Исследуемые образцы ткани в случае развития эндометриоидной болезни гистологически напоминали эндометриоидные разрастания у женщин и содержали железы в окружении стро-мы. Учитывая полученные результаты, в данном эксперименте все животные были подвергнуты двухсторонней овариэктомии и эстрогенизирова-ны в течение всего послеоперационного периода.

Основываясь на данных литературы, а также собственных предварительно проведенных исследований, было установлено, что формирование эндометриоидных гетеротопий зависит от пространственной ориентации трансплантируемого фрагмента матки по отношению к поверхности эктопического участка [8]. Успешное развитие имплантов было отмечено в случае прямого контакта эндометрия и выбранной для трансплантации поверхности (брыжейка, брюшина и др.), что объясняет выбор нашего подхода.

Через две недели после трансплантации тканей для оценки формирования эндометриоидных гетеротопий у отдельных животных был применен лапароскопический метод исследования брюшной полости. В отличие от лапаротомии оперативный лапароскопический доступ минимизировал кровопотери, снижал травматизацию животных и, что важно, позволял четко визуализировать импланты на экране монитора с возможностью многократного увеличения и фотодокументирования исследуемого объекта. Внедрение данного метода исследования брюшной полости модельных животных позволит проводить замеры, биопсию и/или иссечение эндометриоидных гетеротопий в динамике до, во время и после проводимой терапии для подтверждения диагноза, выполнения гистологических и иммуногистохи-мических исследований.

Интересные данные были получены в результате подкожного моделирования эндометриоза. Такой подход крайне редко используется в экспериментах на животных и ранее не применялся на крысах. Нами было показано успешное развитие трансплантатов с увеличением их размеров и образованием кист у 11 из 13 животных через две недели после выполнения операции. Высокая эффективность такого подхода, удобство наблюдения за имплантом и его доступность позволяет использовать подкожное моделирование эндометриоза для изучения прежде всего препаратов местного воздействия, а также на начальных этапах тестирования генотерапевтических средств [9].

При внутрибрюшинном моделировании эндо-метриоза успешное разрастание гетеротопии и образование разного размера кист как на брыжейке, так и на брюшине передней брюшной стенки было выявлено у 9 из 13 животных. Формирование эндометриом чаще наблюдалось на брыжейке

■ ЖУРНАЛЪ АКУШЕРСТВА11ЖЕНСКИХЪ БОЛЪЗНЕЙ ТО М LX V С П Е Ц В Ы П УС К 2016 ISSN 1684-0461

(5 из 13), чем на брюшине (2 из 13). Кисты достигали размеров 6,0 х 4,5 х 4,0 мм, двукратно превышая исходные размеры. Четко визуализировалась густая сосудистая сеть. Также встречались кисты меньших размеров — 2,0 х 2,0 х 2,0. В случае резорбции импланта его размеры не превышали 1,5 х 1,5 х 1,0 мм, имели плохое кровоснабжение, порой слабо контактировали с поверхностью или отсутствовали вовсе.

выводы

Аутотрансплантация фрагментов ткани матки крысы в эктопические участки брюшной полости и подкожно с учетом проведения двухсторонней овариэктомии и эстрогенизации животных в течение 1 месяца после операции позволяет создавать модель эндометриоза у значительного числа экспериментальных животных (до 90 %). Имплантированные ткани вполне успешно развиваются на брюшине, брыжейке тонкой кишки, а также подкожно, представляют собой кисты или увеличенные в размерах опухолеподобные образования и имеют обильную сеть сосудов. Подкожное моделирование эндометриоза представляет особый интерес в связи с высокой эффективностью модели, удобством доступа к импланту, а также практически отсутствием подобных исследований в мире. Очевидно, что разработка новых подходов и совершенствование имеющихся моделей эндометриоза вносит фундаментальный вклад в понимание, диагностику и лечение одного из самых загадочных заболеваний ХХ века.

Благодарности

Исследование проведено при частичной поддержке гранта РФФИ № 15-04-00591-a.

А.А. Егорова является получателем стипендии Президента РФ (СП-2162.2015.4).

литература

1. Pelch K.E., Sharpe-Timms K.L., Nagel S.C. Mouse Model of Surgically-induced Endometriosis by Auto-transplantation of Uterine Tissue. J. Vis. Exp. 2012,(59):e3396. doi: 10.3791/3396.

2. Hirata T., Osuga Y., Yoshino O., et al. Development of an experimental model of endometriosis using mice that ubiquitously express green fluorescent protein. Human Reproduction. 2005. Vol. 20(8). P. 2092-2096. doi: 10.1093/humrep/dei012.

3. Edwards A.K., Nakamura D.S., Virani S., et al. Animal models for anti-angiogenic therapy in endometriosis. J Reprod Immunol. 2013. Vol. 97(1). P. 85-94. doi: 10.1016/j.jri.2012.10.012.

4. Monckedieck V., Sannecke C., Husen B., et al. Progestins inhibit expression of MMPs and of angiogenic factors in human ectopic endometrial lesions in a mouse model. Mol. Hum. Reprod. 2009. Vol. 15(10). P. 633-643. doi: 10.1093/molehr/gap063.

5. Pullen N., Birch C., Douglas G., et al. The translational challenge in the development of new and effective therapies for endome-triosis: A review of confidence from published preclinical efficacy studies. Human Reproduction Update. 2011. Vol. 17(6). P. 791-802.

6. Vanhie A., Tomassetti C., Peeraer K., et al. Challenges in the development of novel therapeutic strategies for treatment of endometriosis (Review) Expert Opinion on Therapeutic Targets. 2016. Vol. 20(5). P. 593-600. doi:10.1517/14728222.20 16.1118461.

7. Петросян М.А., Балашова Н.Н., Полянских Л.С., и др. Хирургическое моделирование эндометриоза на крысах. «Биология и фундаментальная медицина в Санкт-Петербурге»: материалы совещания. СПб.: СПбНЦ РАН: Изд-во «Арт-Экспресс», 2016. С. 240-243.

8. Ko rbel Ch., Menger M., Laschke M. Size and spatial orientation of uterine tissue transplants on the peritoneum crucially determine the growth and cyst formation of endometriosis-like lesions in mice. Hum. Reprod. 2010. Vol. 25(10). P. 25512558. doi: 10.1093/humrep/deq201.

9. Shubina A.N., Egorova A.A, Baranov V.S., Kiselev A.V. Recent Advances in Gene Therapy of Endometriosis. Recent Pat. DNA Gene Seq. 2013. Vol. 7. P. 169-17.

ЖУРНАЛЪ АКУШЕРСТВА » ЖЕНСКИХЪ БОЛЪЗНЕЙ

ТОМ LXVСПЕЦВЫПУСК 2016

ISSN 1684-0461 ■