CC BY
24
© Р.В. Павлов
Государственная медицинская академия: кафедра акушерства и гинекологии, Ставрополь
ОСОБЕННОСТИ КЛЕТОЧНОГО МИКРООКРУЖЕНИЯ И НЕОАНГИОГЕНЕЗА ГЕТЕРОТОПИЙ В ПРОГРЕССИРОВАНИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЭНДОМЕТРИОЗА У КРЫС
■ В статье представлены результаты морфологической оценки пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия, особенностей васкуляризации и лейкоцитарной инфильтрации очагов экспериментально моделированного эндометриоза на 20 крысах линии Wistar. Доказано, что клетки эктопического эндометрия в красных очагах эндометриоза обладают большей пролиферативной активностью, чем в очагах коричневого и черного цвета. Установлено, что увеличение степени васкуляризации и превалирование
в лейкоцитарных инфильтратах и перитонеальной жидкости макрофагов ведет к увеличению пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия.
■ Ключевые слова: эндометриоз; перитонеальная жидкость; ангиогенез
Многолетние исследования до настоящего времени не позволяют с уверенностью говорить о причинах, ведущих к возникновению и прогрессированию наружного генитального эндометриоза. Считается, что выживание и имплантация жизнеспособных фрагментов эндометрия в перитонеальной полости могут быть обусловлены нарушениями локального иммунного ответа и активацией ангиогенеза, создающего условия для активного функционирования «трансплантата» [2-4, 8-10, 12].
В то же время трансплантационная теория возникновения наружного генитального эндометриоза имеет свои недочеты, основным из которых является отсутствие доказательств жизнеспособности десквамированного менструального эндометрия и его способности к эктопической имплантации [3, 11, 13]. В контексте этого наиболее детальное изучение факторов, способствующих прогрессированию наружного генитального эндометриоза, возможно только в эксперименте: при моделировании заболевания на живых моделях с использованием заведомо жизнеспособных трансплантатов.
В настоящее время имеется большое количество литературных данных, посвященных моделированию эндометриоза в эксперименте [5-7, 14, 15], однако работ, позволяющих изучить влияние особенностей васкуляризации и клеточного микроокружения на пролиферативную активность клеток экспериментальных эндо-метриоидных гетеротопий, в доступной литературе нами обнаружено не было.
В связи с этим целью нашего исследования явилось изучение влияния особенностей васкуляризации и клеточного микроокружения на пролиферативную активность клеток эпителия эндомет-риоидных гетеротопий, смоделированных в эксперименте у крыс.
Материалы и методы исследования
Модель экспериментального эндометриоза (ЭЭ) была воспроизведена на 20 крысах-самках линии Wistar, возрастом 6,0 ± 0,5 месяцев и массой 300,0 ± 25,0 г, содержащихся в условиях вивария Ставропольской государственной медицинской академии, путем аутотрансплантации фрагментов левого маточного рога на внутреннюю поверхность передней брюшной стенки таким образом, чтобы эндометрий был обращен в брюшную полость (рис. 1).
Все оперативные вмешательства проводились под наркозом эта-миналом натрия в дозе 50 мг/кг. При хирургическом вмешательстве использовались рассасывающиеся нити Biosorb 6.0 ("Alcon surgical", США). Через 40 дней от начала эксперимента животные забивались, после чего оценивался клеточный состав перитонеаль-ной жидкости и гистологическое строение трансплантата.
Исследование перитонеальной жидкости выполнялось в два этапа. На первом этапе в камере Горяева подсчитывалось количество клеток в 1 мл перитонеальной жидкости. На втором этапе делались мазки перитонеальной жидкости, в которых после окраски по Ро-
Рис. 1. Этапы аутотрансплантации фрагментов левого маточного рога на внутреннюю поверхность передней брюшной стенки крыс: а — маточный рог выделен на лигатурах; б — маточный рог удален; в — интактная париентальная брюшина; г — фрагмент маточного рога подшит к передней брюшной стенки эндометрием в брюшную полость
мановскому-Гимзе подсчитывалось процентное содержание отдельных популяций клеток, а именно: лимфоцитов, перитонеальных макрофагов, ней-трофилов и тучных клеток.
Перед проведением гистологического исследования участки трансплантации маточного рога фотографировались на цифровую камеру для дальнейшего макроскопического описания и измерения. Учитывался цвет трансплантата, его площадь, наличие на поверхности кистозных образований.
Для оценки пролиферативной активности клеток эпителия эндометриоидных желез и эндотелия сосудов трансплантата использовались критерии, рекомендованные Г.Г. Автандиловым, 1996: площадь ядер, плоидность клеток и активность областей организаторов ядрышек (ОЯОР) [1]. Степень васкуляризации трансплантата оценивалась по суммарной площади сосудов и среднему просвету капилляров, а активность ангиогенеза на основании морфологических критериев пролиферации эндотелиальных клеток капилляров.
Для проведения гистологического и гистохимического исследования кусочки трансплантата фиксировались в 10 % нейтральном формалине и 96 % охлажденном до 2 0С этаноле. На ротационном микротоме «МПС-2» после парафиновой заливки получали срезы толщиной 5-7 мкм.
Для обзорных целей, оценки степени васкуля-ризации трансплантатов, проведения кариомет-рии, подсчета основных популяций иммуноком-петентных клеток и оценки активности ОЯОР срезы, полученные из препаратов, фиксированных в 10 % нейтральном формалине, окрашивали гематоксилином — эозином, по Романовскому-
Гимзе и импрегнировали азотнокислым серебром. Для цитофотометрического изучения закономерностей распределения ДНК в ядрах клеток срезы, полученные из препаратов, фиксированных в 96 % охлажденном этаноле, окрашивали акридиновым оранжевым при рН = 2,0.
Системный морфометрический анализ удаленных трансплантатов выполняли в нашей модификации с помощью микротелефотометричес-кого анализатора изображения, состоящего из видеокамеры «ВКМ 380», полифункционального микроскопа «ЛЮМАМ Р-8», блока оцифровки изображения и компьютера PENTIUM III, с использованием программы «ВидеоТест-Морфо» производства ООО «Истра-ВидеоТест» (Россия).
Статистическую обработку полученных данных проводили на компьютере с использованием программы «Primer Biostatistic 4.03 for Windows». Для всех показателей, полученных у животных основной и контрольной групп, определяли средние значения (М), а также стандартную ошибку среднего арифметического (m). Для оценки степени достоверности различий между значениями использовался простой критерий Стьюдента (t). Различия между показателями считали достоверными при р < 0,05.
Результаты исследования
В зависимости от макроскопической характеристики все участки ЭЭ можно было разделить на красные (8), коричневые (10) и черные (2), кроме того, на поверхности 11 из них (55,0 ± 11,1 %) наблюдались кисты с прозрачным серозным содержимым, средний диаметр которых составлял 3,74 ± 0,22 мм (рис. 2).
При обзорной микроскопии у всех животных в
Рис. 2. Макроскопические особенности участков экспериментального эндометриоза: а — красный очаг эн-дометриоза; б — коричневый очаг эндометриоза; в — черный очаг эндометриоза; г — киста на поверхности эндометриоидного очага
Рис. 3. Микроскопические особенности участков экспериментального эндометриоза: а — объем трансплантата и площадь эндометриоидной железы в красном очаге; б — уменьшение объема трансплантата и площади эндометриоидной железы в коричневом очаге; в — уменьшение объема трансплантата и площади эндометриоидной железы в черном очаге; г — эндо-метриоидная киста. Окраска гематоксилином и эозином, х40
участках ЭЭ были выявлены очаги типичного эн-дометриоидного эпителия (рис. 3), что позволило нам сделать вывод о развитии экспериментального эндометриоза в 100 % случаев. В процессе мор-фометрической оценки нами было установлено, что площадь эндометриоидных желез и объем ЭЭ в очагах красного цвета, были достоверно выше, чем в очагах коричневого и черного (табл. 1).
При оценке площади ядер, высоты эпителия, плоидности клеток ЭЭ и активности в их ядрах ОЯОР (рис. 4) нами было установлено достоверное уменьшение всех параметров, отражающих пролиферативную активность эпителиальных клеток в очагах коричневого и черного цвета, по сравнению с красными (см. табл. 1).
Таким образом, в очагах ЭЭ красного цвета наблюдается более активная пролиферация клеток
Рис. 4. Показатели пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия: а — площадь ядер и высота клеток эктопического эндометрия в красном очаге; б — уменьшение площади ядер и высоты клеток эктопического эндометрия в черном очаге, окраска гематоксилином и эозином, *600; в — активность ОЯОР в ядрах клеток эктопического эндометрия в красном очаге; г — уменьшение активности ОЯОР в ядрах клеток эктопического эндометрия в черном очаге, окраска азотнокислым серебром, *1000
эктопического эндометрия, что позволяет расценивать их как прогрессирующую форму эндомет-риоза.
При анализе степени васкуляризации очагов ЭЭ с различной пролиферативной активностью эктопического эндометрия (рис. 5) нами было установлено достоверное снижение суммарной площади сосудистого русла, средней площади просвета капилляров, площади ядер эндотелиаль-ных клеток, их плоидности и активности ОЯОР в ядрах эндотелиальных клеток эндометриоидных гетеротопиях с низкой пролиферативной активностью. В то же время высокая пролиферативная активность совпадала с увеличением суммарной площади сосудистого русла (табл. 2).
Таким образом, увеличение степени васкуля-
Таблица 1
Микроскопическая характеристика экспериментальных эндометриоидных гетеротопий
Показатели Высокая пролиферативная активность (п = 8) Низкая пролиферативная активность (п = 12)
Объем трансплантата, (мм3) 140,10 ± 3,74 120,40 ± 3,46 **
Площадь желез, (%) 13,56 ± 1,45 9,02 ± 1,26 *
Высота эпителия, (мкм) 16,87 ± 0,71 14,35 ± 0,64 **
Площадь ядер эпителия, (мкм2) 20,21 ± 0,66 18,45 ± 0,48 *
Плоидность эпителия, (с.) 3,54 ± 0,25 2,95 ± 0,15 *
Количество ОЯОР в ядре, (шт.) 2,86 ± 0,15 2,36 ± 0,14 *
Средняя площадь ОЯОР, (мкм2) 1,72 ± 0,09 1,44 ± 0,07 *
Суммарная площадь ОЯОР в ядре, (мкм2) 3,72 ± 0,31 2,85 ± 0,25 *
Примечание. Достоверность различий между группами с высокой и низкой пролиферативной активностью клеток эктопического эндометрия: * — р < 0,05; ** — р < 0,01
Таблица 2
Особенности васкуляризации эндометриоидных гетеротопий
Показатели Высокая пролифератив-ная активность (п = 8) Низкая пролиферативная активность (п = 12)
Площадь просвета сосудов от площади трансплантата, (%) 11,83 ± 0,70 8,33 ± 0,67 **
Средний просвет капилляра, (мкм2) 123,70 ± 9,73 82,19 ± 6,57 **
Площадь ядер эпителия, (мкм2) 11,33 ± 0,54 9,08 ± 0,39 **
Плоидность эпителия, (с.) 2,31 ± 0,08 2,05 ± 0,06 *
Количество ОЯОР в ядре, (шт.) 2,01 ± 0,11 1,80 ± 0,09
Средняя площадь ОЯОР, (мкм2) 0,74 ± 0,09 0,53 ± 0,05 *
Суммарная площадь ОЯОР в ядре, (мкм2) 1,35 ± 0,08 1,08 ± 0,06 **
Примечание. Достоверность различий между группами с высокой и низкой пролиферативной активностью клеток эктопического эндометрия: * — р < 0,05; ** — р < 0,01
Таблица 3
Клеточный состав лейкоцитарных инфильтратов эндометриоидных гетеротопий и перитонеальной жидкости
Показатели Высокая пролиферативная активность (п = 8) Низкая пролиферативная активность (п = 12)
Лейкоцитарные инфильтраты
Лейкоциты, в 1 мм2 1744,00 ± 359,00 3378,00 ± 424,70 **
Нейтрофилы (%) 5,01 ± 0,92 2,68 ± 0,38 *
Тучные клетки (%) 3,01 ± 0,58 1,54 ± 0,18 *
Макрофаги (%) 2,25 ± 0,25 1,23 ± 0,24 **
Лимфоциты (%) 89,73 ± 3,95 94,55 ± 1,50
Перитонеальная жидкость
Лейкоциты, в 1 мл 184,23 ± 13,75 141,70 ± 9,32 *
Нейтрофилы (%) 14,42 ± 0,67 12,10 ± 0,50 **
Тучные клетки (%) 7,08 ± 0,56 4,46 ± 0,36 **
Макрофаги (%) 38,54 ± 1,16 33,90 ± 1,12 **
Лимфоциты (%) 39,96 ± 1,21 49,54 ± 1,17 ***
Примечание. Достоверность различий между группами с высокой и низкой пролиферативной активностью: * — р < 0,05; ** — р < 0,01; *** — р < 0,001
ризации и активности ангиогенеза в ЭЭ совпадает с усилением пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия, что убедительно подтверждает значение неоангиогенеза в прогресси-ровании эндометриоза.
При изучении особенностей лейкоцитарной инфильтрации ЭЭ с различной пролиферативной активностью клеток эктопического эндометрия (табл. 3) нами было установлено, что для трансплантатов с более выраженной лейкоцитарной инфильтрацией была характерна низкая пролифе-ративная активность эпителиальных клеток. При этом в процессе снижения их пролиферативной активности в очаге ЭЭ не только возрастала интенсивность лейкоцитарной инфильтрации, но и менялся ее качественный состав, в сторону увеличения количества лимфоцитов и снижения количества макрофагов, тучных клеток и нейтрофилов.
При изучении перитонеальной жидкости нами было установлено снижение ее клеточности при низкой пролиферативной активности клеток ЭЭ.
Рис. 5. Степень васкуляризации очагов эндометриоза и активность ОЯОР в ядрах эндотелиальных клеток: а — диаметр капилляров и площадь ядер эндотелиальных клеток в красном очаге; б — уменьшение диаметра капилляров и площади ядер эндотелиальных клеток в черном очаге, окраска гематоксилином и эозином, *600; в — активность ОЯОР в ядрах клеток эндотелия в красном очаге; г—уменьшение активности ОЯОР в ядрах клеток эндотелия в черном очаге, окраска азотнокислым серебром, *1000
При этом в ней уменьшалось не только абсолютное количество лейкоцитов, но и процентное содержание тучных клеток, макрофагов и ней-трофилов и возрастало процентное содержание лимфоцитов (см. табл. 3).
Таким образом, на фоне снижения пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия наблюдается снижение количества клеток в перитонеальной жидкости, и увеличивается интенсивность лейкоцитарной инфильтрации очагов ЭЭ. При этом в перитонеальной жидкости и в лейкоцитарных инфильтратах возрастает процент клеток лимфоидного ряда при одновременном снижении доли макрофагов и полиморфоядерных лейкоцитов.
Заключение
Анализируя представленные данные можно констатировать, что при аутотрансплантации фрагмента левого маточного рога крыс на внутреннюю поверхность передней брюшной стенки ЭЭ развивается в месте трансплантации в 100 % случаев. При этом клетки эктопического эндометрия очагов ЭЭ красного цвета обладают большей пролиферативной активностью, чем очагов коричневого и черного, что позволяет расценивать их как прогрессирующую форму эндометриоза. Обращает на себя внимание, что с увеличением степени васкуляризации, а также количества макрофагов в лейкоцитарных инфильтратах очагов ЭЭ и перитонеальной жидкости экспериментальных животных наблюдается увеличение проли-феративной активности клеток эктопического эндометрия, что указывает на роль этих факторов в прогрессировании эндометриоза. Напротив, увеличение лейкоцитарной инфильтрации очагов ЭЭ и клеточности перитонеальной жидкости за счет лимфоцитов, а также уменьшение васкуляризации гетеротопий ведет к снижению пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия и, как следствие, к регрессу эндометриоза.
Литература
1. Автандилов Г.Г. Компьютерная микротелефотометрия в диагностической гистоцитопатологии / Автандилов Г.Г. — М.: РМАПО, 1996. — 256 с.
2. Бурлев В.А. Ангиогенез в развитии перитонеального эндометриоза / Бурлев В.А., Павлович С.В. // Проблемы репродукции. — 2003. — № 2. — С. 42-47.
3. Бурлев В.А. Ангиогенез эктопического эндометрия у больных с перитонеальной формой эндометриоза (обзор литературы) / Бурлев В.А., Ильясова Н.А., Дубинская Е.Д // Проблемы репродукции. — 2005. — № 1. — С. 7-13.
4. МахмудоваГ.М. Роль некоторых факторов перитонеальной
жидкости в патогенезе эндометриоза / Махмудова Г.М., Попов А.В. // Российский вестник акушера-гинеколога. — 2004. — № 2. — С. 27-30.
5. НазароваА.О. Состояние клеточных компонентов перитонеального микроокружения у крыс с экспериментальным эн-дометриозом и эффективность хирургического лечения / Назарова А.О., Валькова А.В., Шарабанов И.Ю. [и др.] // Проблемы репродукции. — 2004. — № 3. — С. 12-15.
6. Назарова А.О. Функциональная активность перитонеаль-ных макрофагов при различных способах лечения экспериментального эндометриоза у крыс / Назарова А.О., Алексинская Е.С., Шарабанова И.Ю. [и др.] // Проблемы репродукции. — 2003. — № 2. — С. 19-21.
7. Посисеева Л.В. Эндометриоз: клинико-экспериментальные сопоставления / Посисеева Л.В., Назарова А.О., Шараба-нова И.Ю. [и др.] // Проблемы репродукции. — 2001. — № 4. — С. 27-31.
8. Савицкий Г.А. Перитонеальный эндометриоз и бесплодие (клинико-морфологические исследования) // Савицкий Г. А., Горбушин С.М. — СПб.: «ЭЛБИ-СПб», 2002. — 170 с.
9. Сельков С.А. Локальная продукция цитокинов у пациенток с наружным генитальным эндометриозом / Сельков С. А., Крамарева Н.Л., Павлов О.В., Ярмолинская М. И. // Ж. акуш. жен. болезн. — 2002. — Т. LI, Вып. 3. — С. 57-62.
10. Berkkanoglu M. Immunology and endometriosis / Berkkanoglu M., Arici A. // Am. J. Reprod. Immunol. — 2003. — Vol. 50, N 1. — P. 48-59.
11. Nap A.W. Pathogenesis of endometriosis / Nap A.W., Groothuis P.G., Demir A.Y. [et al.] // Best. Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol. — 2004. — Vol. 18, N 2. — P. 233-244.
12. Paul Dmowski W. Immunology of endometriosis / Paul Dmowski W., Braun D.P. // Best. Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol. — 2004. — Vol. 18, N 2. — P. 245-263.
13. SeliE. Pathogenesis of endometriosis / Seli E., Berkkanoglu M., Arici A. // Obstet. Gynecol. Clin. North. Am. — 2003. — Vol. 30, N 1. — P. 41-61.
14. Sharpe-TimmsK.L. Using rats as a research model for the study of endometriosis / Sharpe-Timms K.L. // Ann. N. Y. Acad. Sci. — 2002. — N 955. - P. 318-327.
15. Uchiide I. Pathological evaluation of the rat endometriosis model / Uchiide I., Ihara T., Sugamata M. // Fertil. Steril. — 2002. — Vol. 78, N 4. — P. 782-786.
ROLE OF VASCULARIZATION AND CELL ENVIRONMENT FEATURES OF HETEROTOPIC TISSUE IN RAT MODELS' ENDOMETRIOSIS PROGRESS
Pavlov R.V.
■ Summary: The article represents the results of morphological evaluation of proliferative activity of ectopic endometrium cells, vascularization and leucocytic infiltration features in endometriosis focuses in 20 rat models (Wistar line rats) of endometriosis. It has been proved that ectopic endometrium cells from red focuses of endometriosis demonstrate stronger proliferative activity, than those from brown and black focuses. It was also fixed that the increased vascularization degree and macrophagal predominance in leucocytic infiltration and peritoneal fluid promote proliferative activity of ectopic endometrium cells.
■ Key words: endometriosis; peritoneal fluid; vascularization
