CC BY
34
© Р. В. Павлов1, С. А. Сельков2
1 Государственная медицинская академия: кафедра акушерства и гинекологии, Ставрополь:
2 НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН: лаборатория иммунологии, Санкт-Петербург
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ВНУТРИБРЮШНОГО ПРИМЕНЕНИЯ РОНКОЛЕЙКИНА ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ЭНДОМЕТРИОЗЕ У КРЫС
■ В статье представлены результаты внутрибрюшного введения рекомби-нантного человеческого интерлейкина 2 (ронколейкина) 20 крысам линии
с экспериментально моделированным эндометриозом. В качестве критериев эффективности использованного метода лечения оценивались наличие эктопического эндометрия в участках трансплантации маточного рога, пролиферативная активность эндометриоидных клеток, особенности васкуляризации и лейкоцитарной инфильтрации очаговэндометрио-за. Авторами показано, что при местном применении ронколейкина регресс эндометриоидных гетеротопий наблюдается в 60 % случаев. В случае сохранения эндо-метриоидного эпителия на фоне применения ронколейкина достоверно снижалась пролиферативная активность его клеток. Во всех трансплантатах у крыс, получавших ронколейкин, наблюдается снижение степени васкуляризации и увеличение лейкоцитарной инфильтрации за счет лимфоцитов, при одновременном снижение в составе лейкоцитарных инфильтратов количества макрофагов.
■ Ключевые слова: эндометриоз; ронколейкин
Несмотря на более чем столетний период с момента появления первых сообщений об эндометриозе, этиология и патогенез этого заболевания остается предметом споров и научных исследований. Именно недостаточное понимание основных механизмов развития эндометриоза не позволяет добиться высокой эффективности его лечения. Хирургическое лечение зачастую не способствует восстановлению специфических функций женского организма и не исключает рецидивов заболевания. При проведении гормональной терапии рецидивы заболевания, недостаточная эффективность лечения и персистенция заболевания наблюдаются почти в78% случаев [2,5, 13].
В настоящее время получено большое количество данных, указывающих на существенное значение нарушений локального иммунного ответа в возникновении и прогрессировании наружного генитального эндометриоза. В частности, установлено, что у больных наружным генитальным эндометриозом увеличивается количество и функциональная активность макрофагов перитонеальной жидкости, при одновременном снижении активности натуральных киллеров и цитотоксических Т-лимфо-цитов [4, 6, 7, 9, 10,12, 14,15]. Продемонстрированы изменения цитокинового профиля в зависимо сти от степени тяжести заболевания [3, 4, 6, 7]. В связи с этим, весьма актуальным представляется изучение возможностей селективной стимуляции защитных функций иммунокомпетентных клеток больных наружным генитальным эндометриозом с использованием активирующих цитокинов, в частности, интерлейкина-2.
Использование интерлейкина-2 для лечения эндометриоза применялось в ряде клинических исследований [3, 8, 11]. Однако до сих пор недостаточно изучена эффективность данного метода лечения и механизмы регрессии эндометриоидных гетеротопий при применении этого иммуномодулятора.
В связи с этим целью нашего исследования явилась оценка эффективности внутрибрюшного введения ронколейкина в лечении наружного генитального эндометриоза, моделированного в эксперименте на крысах, и изучение возможных механизмов регресса эндометриоидных гетеротопий при применении этого препарата.
Материалы и методы исследования
Модель наружного экспериментального эндометриоза была воспроизведена на 40 крысах-самках линии возрастом
6,0 ± 0,5 месяцев и массой 300,0 ± 25,0 г, содержащихся в условиях вивария Ставропольской государственной медицинской академии, путем аутотрансплантации фрагментов левого маточ-
жячшгь и;ушешвд Ii жеискихь бошней
ТОМ ВЫПУСК 3/2006
ISSN 1684-0461
ного рога на внутреннюю поверхность передней брюшной стенки таким образом, чтобы эндометрий был обращен в брюшную полость.
Все оперативные вмешательства проводились под наркозом этаминалом натрия в дозе 50 мг/кг. При хирургическом вмешательстве использовались рассасывающиеся нити Biosorb 6.0 («Alcon surgical», США). В течение 10 дней после трансплантации маточного рога крысы содержались в стандартных условиях и получали одинаковый корм. Через 10 дней после трансплантации маточного рога все животные были разделены на 2 группы.
I группу составили 20 животных, которым в асептических условиях в брюшную полость вводился рекомбинантный человеческий интер-лейкин-2 (ронколейкин) («Биотех», Россия), в дозировке 8 000 ЕД на 1 кг (из перерасчета средней дозировки на человека 500 000 ЕД), трехкратно, с интервалом через 24 часа.
II группу составили 20 животных, которым в асептических условиях в брюшную полость по аналогичной схеме вводился стерильный физиологический раствор.
Через 40 дней от начала эксперимента все животные забивались, оценивалась макроскопическая картина гетеротопий и участков их резорбции, клеточный состав перитонеальной жидкости и гистологическое строение очагов эндометриоид-ного эпителия (ЭЭ).
Исследование перитонеальной жидкости выполнялось в два этапа. На первом этапе в камере Горяева подсчитывалось количество клеток в 1 мл перитонеальной жидкости. На втором этапе делались мазки перитонеальной жидкости, в которых после окраски по Романовскому-Гимзе подсчитывалось процентное содержание отдельных популяций клеток, а именно: лимфоцитов, перитонеальных макрофагов, нейтрофилов и тучных клеток.
Перед проведением гистологического исследования участки ЭЭ фотографировались на цифровую камеру для дальнейшего макроскопического описания и измерения. Учитывались цвет очагов, площадь, наличие на поверхности кистозных образований.
Для оценки пролиферативной активности клеток эпителия эндометриоидных желез и эндотелия сосудов очагов ЭЭ использовались критерии, рекомендованные Г. Г. Автандиловым (1996): площадь ядер, плоидность клеток и активность областей организаторов ядрышек (ОЯОР) [1]. Степень васкуляризации очагов ЭЭ оценивалась по суммарной площади сосудов и среднему просвету капилляров, а активность ангиогенеза на основании морфологических критериев пролиферации эндотелиальных клеток капилляров.
Для проведения гистологического и гистохимического исследования кусочки ЭЭ фиксировались в 10%-м нейтральном формалине и 96%-м, охлажденном до 2 °С этаноле. На ротационном микротоме «МПС-2» после парафиновой заливки получали срезы толщиной 5-7 мкм.
Для обзорных целей, оценки степени васкуляризации очагов ЭЭ, проведения кариометрии, подсчета основных популяций иммунокомпетен-тных клеток и оценки активности ОЯОР срезы, полученные из препаратов, фиксированных в 10%-м нейтральном формалине, окрашивали гематоксилином — эозином по Романовскому-Гимзе и импрегнировали азотнокислым серебром. Для цитофотометрического изучения закономерностей распределения ДНК в ядрах клеток срезы, полученные из препаратов, фиксированных в 96%-м охлажденном этаноле, окрашивали акридиновым оранжевым при pH = 2,0.
Системный морфометрический анализ удаленных очагов ЭЭ выполняли с помощью микроте-лефотометрического анализатора изображения нашей модификации, состоящего из видеокамеры «ВКМ 380», полифункционального микроскопа «ЛЮМАМ Р-8», блока оцифровки изображения и компьютера PENTIUM III, с использованием программы ВидеоТест-Морфо производства «Истра-ВидеоТест» (Россия).
Статистическую обработку полученных данных проводили на компьютере PENTIUM III с использованием программы Primer Biostatistic 4.03 for Windows. Для всех показателей, полученных у животных основной и контрольной группы, определяли средние значения (M), а также стандартную ошибку среднего (m). Для оценки степени достоверности различий между значениями использовался простой критерий Стьюдента (t). Различия между показателями считали достоверными при р < 0,05 и абсолютно достоверными при р < 0,01.
Результаты исследования
При сравнении макроскопической картины участков ЭЭ (рис. 1) обращают на себя внимание большая частота выявления участков белого цвета и снижение частоты выявления красных очагов у животных, пролеченных ронколейкином. Частота выявления коричневых и черных очагов была одинакова в обеих группах животных, однако их размеры были значительно меньше у животных, получавших ронколейкин. Обращает на себя внимание, что, несмотря на одинаковую частоту выявления кист на поверхности очагов ЭЭ, у животных основной и контрольной группы, в группе крыс, получавших ронколейкин, средний диаметр кист был достоверно меньше.
ЮУРШЪ АКУШЕРОМ" ЖЕНСКИХ!. БОЛЪЗНЕЯ ТО M LV В Ы ПУСК 3/2006 ISSN 1684-0461 ■
Рис. 2. Варианты регресса очагов эндометриоза в зависимости от используемого препарата: А — мультикистозная дегенерация очага эндометриоза (группа, получавшая а-интерферон); Б — замещение очага эндометриоза грануляционной тканью (группа, получавшая интерлейкин-2), окраска гематоксилином и эозином, *40
Рис. 1. Макроскопические особенности участков ЭЭ в зависимости от применяемого препарата: А — красные очаг эндометриоза (контрольная группа); Б — киста на поверхности трансплантата (контрольная группа); В — белый очаг эндометриоза (группа, получавшая интерлейкин-2)
При обзорной микроскопии у всех животных, не получавших лечение в области ЭЭ (рис. 2), были выявлены очаги типичного эндометри-оидного эпителия, что позволило нам сделать вывод о развитии экспериментального эндометриоза вЮО % случаев. На фоне лечения ронко-лейкином у 12 крыс (60,0 ± 11,0 %) в области ЭЭ эутопический эндометрий отсутствовал, что позволило нам сделать вывод о регрессе эн-
дометриоидных гетеротопий у этих животных. При этом у трех крыс наблюдалась мультикистозная дегенерация очагов ЭЭ, а у 9 участок ЭЭ полностью заместился грануляционной тканью (табл. 1).
В процессе морфометрической оценки нами было установлено, что объем очагов ЭЭ и площадь сохранившихся эндометриоидных желез у животных, пролеченных ронколейкином, была досто-
■ ¡КУРЛАЛЪ АКУШЕРСТВА и ЖЕ ИСКИ XI БОЛЕЗНЕЙ
ТОМ IV ВЫПУСК 3/2006
ISSN 1684-0461
Таблица 1
Показатели пролиферативной активности эпителиальных клеток эндометриоидных гетеротопий
Показатели Без терапии (п = 20) Ронколейкин (п = 8)
Объем трансплантата, мм3 130,20 ± 4,78 104,30 ± 5,81**
Площадь железы от площади трансплантата, % 11,29±1,94 6,01 ± 1,06*
Высота эпителия, мкм 14,1 ± 0,74 8,68 ± 0,58***
Площадь ядер эпителия, мкм2 19,97 ± 0,76 15,58 ± 1,44**
Плоидность эпителия, с 3,35 ± 0,32 2,49 ± 0,25*
Количество ОЯОР в ядре, шт. 2,63 ± 0,16 2,05 ± 0,07*
Средняя площадь ОЯОР, мкм2 1,61 ± 0,09 1,06 ± 0,04***
Суммарная площадь ОЯОР в ядре, мкм2 3,17 ± 0,32 2,11 ± 0,10**
Достоверность различий между контрольной и основной группами: *—р<0,05, ** —р<0,01, ***—р<0,001
Особенности васкуляризации эндометриоидных гетеротопий
верно ниже, чем у крыс, не получавших лечение (см. рис. 2). Кроме того, при оценке площади ядер, высоты эпителия, плоидности клеток эктопического эндометрия и активно сти в их ядрах ОЯОР (рис. 3) нами было установлено достоверное уменьшение всех параметров, отражающих пролиферативную активность эпителиальных клеток в очагах ЭЭ у крыс, получавших ронколейкин (см. табл. 1).
При анализе степени васкуляризации очагов ЭЭ (рис. 4) нами было установлено достоверное снижение суммарной площади сосудистого русла, средней площади просвета капилляров, площади ядер эндотелиальных клеток, их плоидности и активности ОЯОР в ядрах эндотелиальных клеток у животных, получавших лечение ронколейкином (табл. 2).
При изучении особенностей лейкоцитарной инфильтрации ЭЭ (табл. 3) выявлено резкое ее
Таблица 2
возрастание на фоне применения ронколейкина. При этом в очагах ЭЭ возрастает не только интенсивность лейкоцитарной инфильтрации, но и меняется ее качественный состав в сторону достоверного увеличения количества лимфоцитов и снижения количества макрофагов, тучных клеток и нейтрофилов.
При сравнении перитонеального микроокружения у животных, получавших и не получавших лечение, нами было установлено снижение клеточности перитонеальной жидкости при применении ронколейкина. При этом в перитонеальной жидкости на фоне применения ронколейкина не только снижается количество клеток, но и меняется их качественный состав, в сторону снижения содержания тучных клеток, макрофагов и нейтрофилов и увеличения количества лимфоцитов (см. табл. 3).
Показатели Без терапии (п = 20) Ронколейкин (п = 20)
Площадь просвета сосудов от площади трансплантата, % 10,79 ± 0,70 8,11 ± 0,95*
Средний просвет капилляра, мкм2 107,97 ± 9,73 77,30 ± 6,00**
Площадь ядер эпителия, мкм2 10,33 ± 0,54 8,69 ± 0,36*
Плоидность эпителия, с 2,28 ± 0,09 2,04 ± 0,07*
Количество ОЯОР в ядре, шт. 1,98 ± 0,11 1,88 ± 0,19
Средняя площадь ОЯОР, мкм2 0,74 ± 0,09 0,53 ± 0,05*
Суммарная площадь ОЯОР в ядре, мкм2 1,35 ± 0,08 0,86 ± 0,11**
Достоверность различий между контрольной и основной группами: * — р< 0,05, ** — р< 0,01, *** — р< 0,001
ЖУРНАЛ АКУШЕРСТВА ч ЖЕНСКИЙ! БОШНЕЯ
ТОМ IV ВЫПУСК 3/2006
155Ы 1684-0461 ■
Рис. 3. Микроскопические особенности участков экспериментального эндометриоза с сохраненным эпителием, в зависимости от используемого препарата: А — объем трансплантата и площадь эндометриоидной железы (контрольная группа); Б — уменьшение объема трансплантата и площади эндометриоидной железы (группа, получавшая интерлейкин-2); В — уменьшение объема трансплантата и площади эндометриоидной железы (группа, получавшая а-интерферон), окраска гематоксилином и эозином, *40
Таблица 3
Клеточный состав лейкоцитарных инфильтратов эндометриоидных гетеротопий и перитонеальной жидкости
Показатели Без терапии (п = 20) Ронколейкин (п = 20)
I. Лейкоцитарные инфильтраты
Лейкоциты в 1 мм2 1863,00 ± 359,00 3697,00 ± 308,60**
Нейтрофилы, % 3,36 ± 0,92 2,09 ± 0,37
Тучные клетки, % 2,95 ± 0,58 1,28 ± 0,28*
Макрофаги, % 2,00 ± 0,25 0,83 ± 0,17**
Лимфоциты, % 91,69 ± 3,95 95,80 ± 2,35
II. Перитонеальная жидкость
Лейкоциты, в 1 мл 174,23 ± 13,75 99,90 ± 15,36**
Нейтрофилы, % 14,32 ± 0,67 12,06 ± 0,65*
Тучные клетки, % 6,33 ± 0,41 4,59 ± 0,33**
Макрофаги, % 33,61 ± 1,16 25,37 ± 0,88***
Лимфоциты, % 45,74 ± 0,69 57,98 ± 0,96***
Достоверность различий меду контрольной и основной группами: *—р< 0,05, **—р<0,01,***—р< 0,001
■ ЖУРШЪ АКУШЕРСТВА И ЖЕНСКИХЪ БОЛЕЗНЕЙ
ТОМ IV ВЫПУСК 3/2006
ISSN 1684-0461
Рис. 4. Степень васкуляризации очагов эндометриоза и активность ОЯОР в ядрах эндотелиальных клеток, на фоне лечения ронколейкином: А — диаметр капилляров и площадь ядер эндотелиальных клеток (контрольная группа); Б — уменьшение диаметра капилляров и площади ядер эндотелиальных клеток в очаге эндометриоза (группа, получавшая рон-колейкин), окраска гематоксилином и эозином, хбОО; В — активность ОЯОР в ядрах клеток эндотелия в очаге эндометриоза (контрольная группа); Г — уменьшение активности ОЯОР в ядрах клеток эндотелия в очаге эндометриоза (группа, получавшая ронколейкин), окраска азотнокислым серебром, *1000
Заключение
Анализируя представленные данные можно констатировать, что на фоне внутрибрюшного применения ронколейкина полный регресс очагов ЭЭ наблюдается у 60 % лабораторных животных. В случае сохранения эндометриоидных желез наблюдается достоверное уменьшение их объема, а также снижение пролиферативной активности клеток эктопического эндометрия. Учитывая полученные данные, возможным механизмом действия ронколейкина в регрессе ЭЭ может являться увеличение активности лимфоцитов, инфильтрирующих очаги эндометриоза и обладающих прямым цитотоксическим действием на клетки эктопического эндометрия, при одновременном снижении в лейкоцитарных инфильтратах количества макрофагов, инициирующих процесс ангиогенеза. Дополнительным
подтверждением этого предположения можно считать снижение степени васкуляризации очагов ЭЭ и уменьшение активности эндотелиальных клеток на фоне проводимого лечения. Необходимо отметить, что используемый метод введения ронколейкина не имел отрицательного системного и местного действий.
Статья представлена М. И. Ярмолинской НИИ акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта, Санкт-Петербург
Литература
1. Автандилов /"./".Компьютерная микротелефотометрия в диагностической гистоцитопатологии / Автандилов Г. Г. — М.:РМАПО,1996.-256с.
2. Адамян Л. В. Эндометриозы: руководство для врачей / Ада-мян Л. В., Кулаков В.И.- М.: Медицина, 1998. - 320 с.
ЖУРШЪ АКУШЕРСТВА >' ЖЕНСКИХ!. БОШНЕЙ
ТОМ IV ВЫПУСК 3/2006
ISSN 1684-0461
3. КрамареваН.Л. Значение компонентов иммунной системы и генетическихфакторов в патогенезе и терапии наружного генитального эндометриоза: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. - СПб., 2002.
4. Махмудова Г. М. Роль некоторых факторов перитонеальной жидкости в патогенезе эндометриоза / Махмудова Г. М., Попов А. В. // Российский вестник акушера-гинеколога. — 2004. — №2, — С. 27-30.
Б. Савицкий Г. А. Перитонеальный эндометриоз и бесплодие (клинико-морфологические исследования) / Савицкий Г. А., Горбушин С.М. — СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2002. - 170 с.
6. Селъков С. А. Локальная продукция цитокинов у пациенток с наружным генитальным эндометриозом / Сельков С. А., Крамарева Н. Л., Павлов О. В., Ярмолинская М.И. // Ж. акуш. жен. болезн. — 2002. — Т. LI, Вып. 3. — С. 57-62.
7. Система интерферонов и цитотоксических клеток в регуляции пролиферативных процессов при эндометриозе / Ярмолинская М. И., Григорьева В. В., Аникин В. Б. [и др.] // Иммунология репродукции. — 2004. — Т. 6, № 3-5. — С. 394-395.
8. Чернова Е. Г.Клинико-иммунологическая эффективность ронколейкина в комплексном лечении наружного генитального эндометриоза: автореф. дис. ... канд. мед. наук. -М., 2002.
9. Berkkanoglu М Immunology and endometriosis / Berkkanoglu M., Arid A. //Am.J. Reprod. Immunol. - 2003,-Vol. 50.N1.-P. 48-59.
10. DmowskiP. ff.lmmunologyofendometriosis./PaulDmowskiW., BraunD. P.//Best. Pract. Res.Clin.Obstet.Gynaecol.-2004,-Vol. 18, N2.-P. 245-263.
11. GnRH analogues, transvaginal ultrasound-guided drainage and intracystic injection of recombinant interleukin-2 in the treatment of endometriosis / Aden P., Quereda F. J., Gomez-TorresM. J. [etal.]//Gynecol.Obstet.Invest.-2003.-Vol.55, N2.-P. 96-104.
12. Increase in the expression of killer cell inhibitory receptors on peritoneal natural killer cells in women with endometriosis /
Wu M. Y„ Yang J. H., Chao K. H. [et al.] // Fertil. Steril. - 2000. -Vol. 74, N6. — P. 1187-1191.
13. SeliE. Pathogenesis of endometriosis / Seli E., Berkkanoglu M., Arid A. // Obstet. Gynecol. Clin. North. Am. - 2003. - Vol. 30, N1.-P. 41-61.
14. The involvement of T lymphocytes in the pathogenesis of endometriotictissues overgrowth inwomenwithendometriosis/ Szyllo K., Tchorzewski H., Banasik M. [et al.] // Mediators Inflamm. - 2003. - Vol. 12.N3.-P. 131-138.
15. WuM. XTheroleof cytokines inendometriosis/WuM.Y., Ho H.N.// Am.J. Reprod. Immunol. -2003. -Vol.49,N5.- P. 285-296.
EFFICACY EVALUATION OF RONCOLEUKINE INTRAABDOMINAL APPLICATION INTREATMENTOF ENDOMETRIOSIS RAT MODELS
Pavlov R. V., Selkov S. A.
■ Summary: The article represents the results of intra-abdominal administration ofrecombinant human interleukine-2 (roncoleukine) to 20 rat models (Wistar line rats) ofendometriosis. The treatment efficacy criteria applied were: presence ofectopic endometrium in cornu uterus' transplantation sites, endometrioid cells proliferative activity, vascularization and leucocytic infiltration features in endometriosis focuses. The author points out that local application of roncoleukine causes regress in endometrioid heterotopia in 60 % of models. Even if endometrioid epithelium remained present, its proliferative activity was significantly lowered under roncoleukine impact. In all transplantants from rats treated with roncoleukine there were observed reduced vascularization degrees and intensified leucocytic infiltration (due to lymphocytes) concurrent with decreased macrophages portion in leucocytic infiltration formula.
■ Key words: endometriosis; roncoleukine
■ ЖУРШЪ АКУШЕРСТВА и ЖЕ HC KU ХЪ БОЛЕЗНЕЙ
TOM LV ВЫПУСК 3/2006
ISSN 1684-0461
