CC BY
84
УДК 618/1+611.16611.018 © В.В. Евдокимова, 2013
В.В. Евдокимова
МОДЕЛИРОВАНИЕ НАРУЖНОГО ГЕНИТАЛЬНОГО ЭНДОМЕТРИОЗА НА КРЫСАХ С ИЗУЧЕНИЕМ АНГИОГЕНЕЗА В ЭНДОМЕТРИОИДНЫХ ИМПЛАНТАХ НА МАКРО- И МИКРОСКОПИЧЕСКОМ УРОВНЕ
Одесский национальный медицинский университет, г. Одесса
В результате работы была оценена роль эндотелиального фактора роста в имплантации и пролиферации эктопического эндометрия в условиях экспериментальной модели. Проведенные исследования подтвердили ведущую роль проангиоген-ных факторов в индуцировании и стимуляции развития эндометриоидных эктопий. Под воздействием блокады стимулирующего воздействия ЭФРС произошли снижение объема эндометриоидных эктопий и явления практически полной редукции очагов эндометриоза. Нами доказан эффект блокады стимулирующего воздействия ЭФРС, т.е. редукция размера эндометриоидных очагов - прямопропорциональна длительности введения Авастина®. Видна целесообразность применения в широкой клинической практике в комплексном лечении эндометриоза иммуномодулирующих лекарственных препаратов с антиангиогенным действием.
При анализе гистологических исследований нами отмечена положительная динамика - тенденция к восстановлению обычного количества сосудов, отсутствие макрофагальной, лимфоцитарной и гистиоцитарной инфильтраций периваскуля-рных пространств, а также практически полное исчезновение очагов эндометриоза по ходу тонких соединительнотканных волокон.
При 4-кратном введении внутрибрюшинно авастина (бевацизумаб) экспериментальным животным при помощи гистологических методов исследования доказано постепенное замещение стромальных эндометриоидных элементов на фибро-зированные и склерозированные за счет уменьшения кровоснабжения в очаге эндометриоза, что ведет к атрофии эндомет-риоидной ткани и выраженному фиброзу окружающих тканей.
Ключевые слова: эндометриоз, эксперимент, модель, блокада, ангиогенез, гистология, инфильтрация, фиброз, склероз, стаз.
V.V. Evdokimova
EXPERIMENTAL MODEL OF THE EXTERNAL GENITAL ENDOMETRIOSIS IN RATS AND MACRO- & MICROSCOPICAL STUDY OF ANGIOGENESIS IN ENDOMETRIOTIC IMPLANTS
The work evaluated the role of vascular endothelial growth factor in the implantation and proliferation of ectopic endometrium in experimental models. The study confirmed the leading role of pro-angiogenic factors in the induction and stimulation of endometrial ectopic lesions. Under the impact of the blockade stimulus of VEGF a decline occurred in endometrioid lesions and almost complete reduction of endometriosis. The work proves that the effect of the blockade stimulus VEGF is dependent on dose of Avastin®. We discuss the feasibility of clinical use of immunomodulators with antiangiogenic effect in treatment of endometriosis.
Histological analysis indicated a positive dynamics - a tendency for normal amount of vessels, lack of macrophage and lymphocyte infiltration of perivascular spaces, as well as the almost complete disappearance of endometriosis in thin connective tissue fibers.
After 4 intra-abdominal injections of Avastin (bevacizumab) in experimental animals histological methods demonstrated a gradual replacement of endometrial stromal elements on fibrous and sclerosal ones due to reduction of blood supply in endometrio-sis leading to atrophy of endometrial tissue and fibrosis of the surrounding tissues.
Key words: endometriosis, experiment, model, blockade, angiogenesis, histology, infiltration, fibrosis, sclerosis, stasis.
К гинекологическим заболеваниям с мультифакториальной этиологией относится такое заболевание, как эндометриоз. Эндометриоз (ЭМЗ) диагностируется приблизительно в 15% случаев всей женской популяции в фертильном возрасте, а его клинические проявления сводятся к синдрому хронических тазовых болей, нарушению менструального цикла и бесплодию [1]. Среди женщин, страдающих бесплодием, эндометриоз встречается в 70-80% случаев [2,5].
Этиология ЭМЗ и в настоящее время является неясной [4]. С учетом данных, свидетельствующих о повышении активности системной и локальной воспалительных реакций при ЭМЗ, доказано, что этот иммунный ответ сопровождается повышением уровня провоспалительных цитокинов и хемокинов (^-6, ^-8, ТОТ-а). Фактор некроза опухоли альфа (ФНО-а) принято считать наиболее
важным провоспалительным медиатором в патогенезе ЭМЗ [6]. ФНО-а стимулирует синтез ^-6, ^-8, которые в свою очередь являются промоторами неоангиогенеза, обязательного компонента формирования и развития эндометриоидных гетеротопий. Одним из наиболее активных проангиогенных факторов является эндотелиальный фактор роста сосудов (УБОБ), но до современных исследований изучению его активности в условиях экспериментального моделирования эндометриоза с последующей оценкой проангиогенных эффектов было не достаточно уделено внимания
[3, 4].
Цель работы. Изучение влияния анти-ангиогенного действия рекомбинантных мо-ноклональных антител в процессах имплантации и пролиферации клеток эктопического эндометрия в условиях проведения моделирования индуцированного эндометриоза.
Материал и методы. Проведенное моделирование индуцированного эндометриоза было осуществлено за период 2011 - 2012 гг. в вивариях Одесского государственного медицинского университета и ГУ «Институт патологии позвоночника и суставов им. проф. М.И. Ситенка НАМН Украини» (Харьков, Украина). Организация данного эксперимента затребовала 60 половорзелых самок крыс линии в возрасте 4 - 5 мес, массой 280 -300 г, животные были выращены герментив-но. Все крысы были распределено в 8 групп. В I группу вошли 10 крыс, разделенных на две подгруппы - опытную и контрольную. Опытной подгруппе (1а) на протяжении 14 суток вводился фолликулин (0,1% масляный раствор) («Здоровья» ООО ФК Украина, Харьков) из расчета 0,0043 мл на 100 г веса, контрольной - персиковое масло из расчета 0,043 мл на 100 г веса.
Далее в опытной группе производилась нижнесрединная лапаротомия под наркозом: аминозин в дозе 0,005 мл/100 г массы тела, а через 7-10 минут - кетамин в дозе 0,05 мл на 100 г массы тела крысы. В последующем мы давали оценку динамическим процессам жизнедеятельности животных в послеоперационном периоде.
На протяжении всего лабораторного этапа нами оценивались: состояние шерстяного покрова, наличие уплотнений в бедренной области от лекарственных инъекций, наличие геморрагий в ротовой и аноректальной областях и пр. На момент начала эксперимента общий внешний вид крыс не отклонялся от нормы: видимые слизистые оболочки чистые, патологических выделений в их области не определялось. Поведение животных было обычное, они не боялись внутримышечных инъекций.
Методика оперативного вмешательства проводилась по следующему алгоритму. На предоперационном этапе все животные визуально осматривались на предмет любых патологических состояний, при отсутствии последних крыс взвешивали для определения точной массы тела, что было необходимым условием для введения дозы наркоза и мо-ноклональных антител. До размещения крысы на операционный стол ей выбривалась нижняя треть брюшка опасной бритвой (4,5 см2) по белой линии живота до чистых кожных покровов, а операционное поле трижды обрабатывалось раствором йода и спирта. После проведения этапа премедикации животное погружалось в наркоз в течение 15 минут, длительность наркоза составляла 45-50 минут.
Перед операцией наркотизированное животное фиксировали на операционном столе в положении на спине брюшком вверх. Кожа рассекалась (длина разреза 1,7 - 2,2 см) в проекции белой линии живота. В брюшной полости была произведена ревизия внутренних органов и внутренних половых органов. При выведении в рану матки один из ее рогов подлежал иссечению путем наложения лигатуры на дистальный ее отдел. Извлеченный рог матки подвергался рассечению, выбиралась медиальная часть рога длиной до 0,6 - 0,7 см2. Полученный имплант фиксировали к слизистой передней брюшной стенке на 1,5 - 2 см латеральнее от разреза на коже. Обязательным условием в эпате фиксирования имплан-та было то, что его подшивку осуществляли поверхностью эндометрия вверх. С профилактической целью нтраперитонеально всем прооперированным животным вводился антибактериальный препарат - пенициллин - из расчета 150000 ед. на крысу. Завершали операцию ушиванием мышечного слоя сплошным однорядным швом, стенку брюшины - наложением узловых швов. Операционное поле обрабатывали раствором йода. Прооперированное животное специальным образом метили, снимали с операционного стола и перемещали в клетку спиной вверх.
В раннем послеоперпционном периоде животные выходили из наркоза в среднем через 15 минут, в качестве обезболивания вводился кетамин. Через 2 часа после операции животным для свободного доступа ставили воду.
Выведение животных из эксперимента осуществлялось согласно плану эксперимента. Их забивали методом цервикальной дислокации. Сразу после забоя проводилась нижнесрединная лапаротомия, осматривались все органы брюшной полости и место фиксациии импланта, визуально оценивались размеры полученных эндометриоидных очагов. Все полученные данные фотографировались и заносились в специальный журнал учета. В ходе операции производили иссечение участка брюшины с участком экспериментально индуцированного эндометриоза. Иссеченный объект помещали в стеклянную посуду с 10% раствором формалина, посуда герметично закупоривалась.
С целью осуществления модуляции проангиогенного эффекта УБОБ животным в зависимости от опытной серии внутрибрю-шинно вводили препарат Авастин® курсом от 1 до 4 инъекций. Данный цитостатик, обладающий выраженным имуносупрессивным
действием, представлен рекомбинантным гиперхимерным моноклональным антителом, способным избирательно связываться с биологически активным VEGF и таким образом нейтрализовать его за счет уменьшения развития патологических сосудов и угнететения их роста в эндометриоидном очаге. На одно введение Авастина® рассчитанная нами доза составляла 0,35 мг (или 3 мл раствора, т.к. 100 мг препарата растворяли в 10 мл 0,9% физиологического раствора) для одного животного массой тела до 350 г. С целью контроля и дальнейшего сравнения в контрольных группах (индекс «б») крысам вместо Авастина® осуществляли введение 1,0 мл физиологического раствора (0,9% Physiological solution). Велись тщательный мониторинг и регистрация всей полученной информации в ходе эксперимента в журнал.
Методами дисперсионного анализа с помощью програмного обеспечения Stastica 7.0 (StatSoft Inc., США) была произведена статистическая обработка полученных данных.
Результаты. За время выполнения эксперимента во всех экспериментальных сериях животных не отмечалось случаев их падежа, животные удовлетворительно переносили введение всех лекарственных препаратов. Из наиболее выраженных осложнений после введения Авастина® в группах 1а, 1б, 2а, 3б, 4а и 4б отмечалось существенное снижение темпов набора массы - 9,2±0,2 г, тогда как в группах 5 и 6 (неоперированные животные) данный показатель составил 30,0±0,5 г, а в 7 и 8 группах, не подвергавшихся предварительной эстрогенизации и неоперированных -42,5±0,8 г (p<0,01). В группах 1а, 2а, 3а и 4а у животных начиная с третьего-четвертого дня после первого введения Авастина® нами было отмечено некоторое изменение характера испражнений (жидкий кал, не зловонный). В группе 4а животные после 4-го введения Авастина® находились в угнетенном состоянии, плохо и неохотно поедали корм, были вялыми, без двигательной активности, у них был снижен объем употребления питьевой воды, а из клеток этой группы ощущался зловонный запах «острого стула». Однако к тре-тьему-четвертому дню после 4-го введения Авастина® общее состояние животных из данной группы возвращалось в норму, и они практически не отличались от животных контрольной группы.
Ввиду всего вышеуказанного хотелось бы добавить, что на момент забоя животных характерной особенностью имела место вы-
раженная инъекция сосудистого русла органов малого таза и брюшной полости; компенсаторная, гипертрофия нерезецированного рога матки.
На момент забоя нами было визуально отмечено уменьшение очагов эндометриоза, что прямопропорционально соответствовало введению препарата Авастин® (рис. 1,2,3,4,5).
Рис. 1. Эндометриоидный очаг на передней брюшной стенке крысы и значительно выраженное полнокровие сосудов органов брюшной полости до применения рекомбинантного гиперхимерного моноклонального антитела
Рис. 2. Эндометриоидный очаг на передней брюшной стенке крысы после применения первой инъекции рекомбинантного гиперхимерного моноклонального антитела
Рис. 3. Эндометриоидный очаг в виде «стекловидного тела» с незначительным сине-фиолетовым оттенком после применения второй инъекции рекомбинантного гиперхимерного монокло-нального антитела
Рис. 4. Эндометриоидный очаг на передней брюшной стенке крысы, уменьшеный в размерах, после применения третьей инъекции рекомбинантного гиперхимерного моноклонального антитела
Рис. 5. Незначительный эндометриоидный очаг, уменьшенный в размерах в 5-6 раз в соответствии с рис. 1., после введения четвертой инъекции рекомбинантного гиперхимерного мо-ноклонального антитела
Рис. 6. Передняя брюшная стенка крысы с местом фиксации эндометриоидого импланта с визуальным отсутствием очага эндометриоза, неделю спустя после 4-х инъекций рекомби-нантного гиперхимерного моноклонального антитела
При анализе протоколов гистологических наблюдений I - II групп (1 и, соответственно, 2 инъекции авастина) экспериментальных животных было обнаружено большое количество сосудов с утолщенной стенкой, пе-риваскулярно визуализировались выраженные инфильтраты из макрофагов, лимфоцитов и гистиоцитов. Также периваскулярно локализовались очаги эндометриоза со значительно выраженной лимфоцитарной инфильтрацией по ходу тонких соединительнотканных волокон. В сальнике наблюдалось полнокровие сосудов, наблюдался стаз в его сосудах. Относительно III и IV групп (3 и, соответственно, 4 инъекции Авастина) гистологическая картина была следующей: в III группе преобладало умеренное количество сосудов, местами периваскулярно визуализировались единичные очаги эндометриоза с незачительно выраженной лимфоцитарной и макрофагаль-ной инфильтрациями по ходу тонких соединительнотканных волокон, стаз в сосудах сальника практически отсутствовал; в IV группе количество сосудов окружающего сосудистого русла было обычным, в периваскулярных пространствах инфильтраты из макрофагов, лимфоцитов или гистиоцитов не определялись, по ходу тонких соединительнотканных волокон очаги эндометриоза отсутствовали. Описанное выше представлено на рис. 7,8,9,10,11.
Рис. 7. Обширный очаг эндометриоза сальника крысы с гистио-лимфоцитарной и макрофагальной инфильтрациями, окраска
гематоксилином и эозином
Рис. 8. Участки эндометриоза сальника крыс I группы через 1 неделю после 1-го введения гиперхимерного моноклонального антитела, окраска гематоксилином и эозином
Рис. 9. Незначительные участки эндометриоза сальника крыс II
группы через 1 неделю после 2-го введения гиперхимерного моноклонального антитела, окраска гематоксилином и эозином
Рис. 10. Единичные участки эндометриоза сальника крыс III группы через 1 неделю после 3-го введения гиперхимерного моноклонального антитела, окраска гематоксилином и эозином
Рис.11. Отсутсвие очагов эндометриоза сальника крыс IV группы, через неделю после 4-го введения гиперхимерного мо-ноклонального антитела, окраска гематоксилином и эозином
В результате проведенной экспериментальной модели эндометриоза на крысах нами была определена явная редукция размеров эндометриоидных очагов. Так как и в наших предыдущих работах наблюдалась практически их полная редукция.
Анализ динамики регресса очагов эн-дометриоза в различных группах животных показал, что приведенная выше экспериментальная модель с применением антиангиоген-ных лекарственных средств позволяет моделировать депрессию возникновения и развития новых сосудов, значительно уменьшить объем эндометриоидных эктопий путем контролированного (дозированного) введения рекомбинантного гиперхимерного монкло-гального антитела, что приводит к уменьшению кровоснабжения в очаге эндометриоза.
При изучении данных гистологического исследования во всех серийных группах была прослежена тенденция к изменениям морфологической составляющей в сторону исчезновения эндометриоидной эктопии. Это было продемонстрировано в IV группе животных, и подтверждением явились нормализация количества сосудов, отсутствие инфильтратов из макрофагов, лимфоцитов и гистиоцитов в пе-риваскулярных пространствах, практически полное исчезновение эндометриоидных очагов по ходу тонких соединительнотканных волокон.
Учитывая высокую токсичность Авастина®, применение в лечении эндометри-оза в клинических условиях невозможно, однако, получив результаты данного эксперимента и изучив роль факторов ангиогенеза в развитии этого заболевания, целесообразно использовать в комплексной терапии эндо-метриоза препараты с иммуномодулирующей (антицитокиновой) активностью, селективно ингибирующих проангиогенные факторы, в частности VEGF.
Выводы.
1. При моделировании экспериментальной модели эндометриоза нами подтвердилась основная роль проангиогенной актив-
ности в стимуляции развития и росте эндо-метриоидных эктопий.
2. Реализация практически полной редукции и индуцированных в ходе эксперимента эндометриоидных эктопий возможна благодаря блокаде ангиогенной активности эндотелиального фактора роста сосудов с селективной возможностью связываться с биологически активным VEGF и, таким образом, нейтрализовать его за счет уменьшения развития патологических сосудов и угнететения их роста непосредственно в самом эндомет-риоидном очаге.
3. Эффект блокады ангиогенеза VEGF - явление дозозависимое. Экспериментальная модель позволила моделировать возникновение и развитие новых патологических сосудов, значительно уменьшить объем эндомет-риоидных эктопий путём контролированного введения рекомбинантного гиперхимерного монклогального антитела, т.е. редукция размера эндометриоидного очага была прямо-пропорциональна длительности введения Авастина®.
4. Анализ гистологических исследований указал на тенденцию «от большого - к малому» - от значительных нарушений морфологической иерархии и цитоархитектоники до их восстановления: нормализации количества сосудов, отсутствия макрофагальной, лимфоцитарной и гистиоцитарной инфильтраций периваскулярных пространств, практически полное исчезновение индуцированных очагов эндометриоза по ходу тонких соединительнотканных волокон.
5. В результате 4-кратного введения внутрибрюшино Авастина (бевацизумаб) экспериментальным животным с индуцированной моделью эндометриоза при помощи гистологических методов исследования доказано постепенное замещение стромальных эн-дометриоидных элементов на фиброзирован-ные и склерозированные, т.е. уменьшение кровоснабжения в очаге эндометриоза ведет к атрофии эндометриоидной ткани и фиброзу окружающих тканей.
Сведения об авторе статьи:
Евдокимова В.В. - сотрудник Одесского национального медицинского университета. Адрес: 65082, г. Одесса, Валихов-ский переулок, 2.
ЛИТЕРАТУРА
1. Баскаков, В.П. Эндометриоидная болезнь / В.П. Баскаков, Ю.В. Цвелев, Е.В. Кира. - СПб., 2002. - 452 с.
2. Евдокимова, В.В. Порiвняння рiзних експериментальних моделей ендометрюзу. / В.В. Евдокимова // Питання експерименталь-но! та кшшчно! медицини». - 2011. - Вип. 15. Т. 2. - С. 71 - 77.
3. Евдокимова В.В. Патент Укра!ни на корисну модель № 65875 МПК (2011.01) G09B 23/28 (2006.01), A61B 17/00. СпоЫб моде-лювання зовшшнього гештального ендометрюзу / В.В. Евдокимова Заявник та правовласник: Одеський нацюнальний медичний ушверситет Заявка № u201112063 вщ 14.10.2011 Опубл. 12.12.2011 бюл. №23 2011 р.
4. Guidice L.C. Endometriosis: Science and Practice. /ed. L.C. Guidice, J.L. Evers, D.L. Healy NY., Wiley-Blackwell; 1 ed.- 2012- 552 p.
5. Mitchell L.A. Endometriosis: Symptoms, Diagnosis & Treatments / L.A. Mitchell NY, Nova Science Publishers Inc - 2010 - 272 p.
