CC BY
15
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
ле и генномодифицированные) мышиные модели, как правило, не отражают последовательную динамику естественных патофизиологических процессов в момент зарождения, промоции и прогрессии опухолевого ростка. Линия мышей BLRB конвенционального разведения характеризуется высокой частотой естественно возникающего (спонтанного) РМЖ у самок по мере старения. Проведенный ранее патоморфологический анализ позволил выявить в данной линии мышей наличие всех основных типов РМЖ человека, а также этапы прогрессии от гиперплазии до карциномы in situ и инвазивного РМЖ (как лобулярного, так и протокового). Ранее было выявлено сходство состава лейкоцитарных инфильтратов мыши в этой модели и пациентов с РМЖ.
Цель. Оценить прогностический потенциал иммунологических показателей крови, измеренных до возникновения опухоли в спонтанной мышиной модели РМЖ человека BLRB.
Материалы и методы. У интактных самок BLRB (n = 81) нашей коллекции в возрасте от 27 до 99 недель (средний возраст 55,2±2,0) были прижизненно взяты образцы крови из ретроорбитального синуса в объёме 200 мкл. Методом проточной цитометрии (FACSCalibur, BD Biosciences, США) был измерен уровень 11 основных показателей ИС крови: лимфоцитов (CD45highSSClow), моноцитов (F4/80+SSCint), нейтрофилов (CD11b+F4/80negSSCint), эозинофилов (F4/80+SSChigh), CD4+ Т-хелперов, CD8+nrn, CD 19+B-лимфоцитов, NKLl+NK-лимфоцитов, NK1.1+CD3+NK-T лимфоцитов, CD4+CD25+ активированных (акт.) Т-хелперов, CD8+CD25+ акт. ЦТЛ. Далее в течение 7 месяцев ежедневно оценивали выживание стареющих самок, еженедельно индивидуально проводили пальпацию, регистрируя появление новых РМЖ. Статистическую значимость различий оценивали в программе STATISTICA 10 (StatSoft, США) по U-критерию Манна—Уитни, связь между параметрами оценивали по коэффициенту корреляции Спирмена.
Результаты. Спустя 7 месяцев РМЖ был выявлен у 21/81 самок (26%), 37/81 самок (46%) погибли без клинических признаков РМЖ и 23/81 самок (28%) были живы без РМЖ. Изначальный уровень моноцитов в крови выживших без РМЖ самок был ниже уровня у погибших самок (p = 0,02), так и у самок группы с РМЖ (p = 0,04). Изначальный уровень Т-хелперов в крови выживших без РМЖ самок был выше, чем у самок с РМЖ (p = 0,04). Однако не было обнаружено статистически значимых различий между группой погибших без РМЖ самок и группой самок с РМЖ. Далее мы обнаружили достоверную связь 9 из 11 измеренных показателей с возрастом самки на момент забора крови (p < 0,05): уровень лимфоцитов, эозинофилов, Т-хелперов, акт. Т-хелперов, NK-клеток снижался, а уровень нейтрофилов, ЦТЛ, акт. ЦТЛ и B-лимфоцитов повышался с возрастом. Обнаруженный у самок BLRB по мере старения иммунологический дисбаланс послужил основанием для разделения исходной популяции самок на условно «молодых» (от 27 до 55 нед., в среднем 42,0±1,4 нед., n = 45) и «старых» (от 56 до 99 нед., средний возраст 71,2±2,1 нед., n = 36) и рассматривать эти две группы отдельно. Оказалось, что у «молодых» самок с РМЖ изначальный уровень NK-клеток был ниже, чем у погибших без РМЖ (p = 0,009) и выживших без РМЖ (p = 0,032). У «старых» самок с РМЖ обнаружили сочетание изначально низкого уровня B-лимфоцитов с высоким уровнем Т-хелперов, в то время как у погиб-
ших без РМЖ оба параметра были низкие (p = 0,02), а у выживших без РМЖ — высокие (p = 0,011).
Выводы. 1) Иммунологический дисбаланс усиливался по мере старения еще до возникновения РМЖ. 2) У относительно «молодых» и более «старых» самок прогностическим потенциалом в крови обладают разные иммунологические показатели. 3) Только стратифицируя самок по возрасту, удалось выявить, какие параметры ИС предопределяют появление спонтанного РМЖ в модели BLRB.
ВЛИЯНИЕ ВРЕМЕНИ ЭКСПОЗИЦИИ С БЕТА-ЭНДОРФИНОМ НА СЕКРЕТОРНУЮ АКТИВНОСТЬ СПЛЕНОЦИТОВ И МАКРОФАГОВ У МЫШЕЙ
Баева Т.А., Гейн С.В.
ФБГНУ«Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН, Пермь, Россия
Бета-эндорфин (BE) — представитель эндогенной опиоидной системы, активно участвующий в регуляции функций иммунной системы. Это короткоживущее пептидное соединение, оказывающие непродолжительные биологические эффекты. Большой интерес представляет наличие у BE опосредованных, отсроченных по времени эффектов на функуциональную активность клеток иммунной системы. Одним из механизмов опосредованных эффектов BE может являться модуляция продукции гормонов гипоталамо-гипофизарной оси, в частности, кор-тикостерона. Целью настоящего исследования являлось изучение влияния BE на уровни кортикостерона в плазме периферической крови мышей, секрецию IL-2, IL-4 и IFNy мышиными спленоцитами, а также продукцию IL-1P и IL-10 перитонеальными макрофагами in vivo через 1 час и через 6 ч после введения пептида.
Материалы и методы. Исследования были выполнены на беспородных мышах-самцах массой 22-25 грамм. В экспериментах использовали BE (Skytek Laboratories, США), который вводили однократно внутрибрюшинно в дозах от 100 до 0,0005 мкг/кг массы животного. Животным контрольной группы вводили эквивалентный объем 0,9% NaCl. Одну половину животных выводили из эксперимента через 1 час, а вторую через 6 часов после введения BE. Выделение и культивирование спленоцитов и перитонеальных макрофагов осуществляли по стандартным методикам. Каждая культура содержала 1 х 106 клеток в 1 мл полной культуральной среды, которую готовили ex tempore на основе среды RPMI 1640 с добавлением 10 mM HEPES, 2 mM L-глутамина, 100 мкг/мл гента-мицина, меркаптоэтанола (10-3М) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. В качестве митогена для спленоци-тов использовали конканавалин А (КонА) в концентрации 20 мкг/мл, а для макрофагов — опсонизированный зимозан (ОЗ) в концентрации 150 мкг/мл. Культивирование осуществляли во влажной атмосфере с 5% CO2 при 37 °C в течение 24 (для IL-2, IL-ф, IL-10) или 48 (для IFNy и IL-4) часов. Концентрацию кортикостеро-на определяли методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа c помощью коммерческой тест-системы Enzo (США). Количественное определение цитокинов в супернатантах клеточных культур проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью наборов для мышей по методике, предложенной производителем. Полученный материал обрабатывали с помощью однофакторного дисперсионного анализа для непарных данных. Статистическую значимость раз-
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
личий между группами оценивали с помощью критерия наименьшей значимой разницы (LSD-тест) Фишера.
Результаты и обсуждение. Установлено, что ВЕ угнетал продукцию про-(ГИР) и противовоспалительных (Ш-10) факторов, наиболее выражено — в нестимулиро-ванных культурах за 1 час до выведения животных из эксперимента. Так, введение ВЕ за 1 час до выведения животных из эксперимента приводило к угнетению только спонтанной продукции ГЬ-ф макрофагами в дозах 100, 0.01, 0.0005 мкг/кг. Аналогичный эффект пептид оказывал в отношении спонтанной секреции Ш-10, активными оказались дозы 1 и 0, 01 мкг/кг. При введении пептида за 6 часов до забоя активность проявила дозировка 1 мкг/кг, которая приводила к угнетению продукции ГЬ-ф и Ш-10 в стимулированных культурах макрофагов. В культурах, стимулированных Кон А наблюдалось усиление продукции Ш-4 — как через 1 ч, так и через 6 ч после инъекции ВЕ. На спонтанную продукцию Ш-4 спленоцитами ВЕ не оказывал значимого влияния. В работе не было выявлено эффекта пептида на Кон А — индуцированную продукцию Ш-2, независимо от времени введения. В то же время было зарегистрировано разнонаправленное влияние ВЕ на уровни Ш-2 в спонтанных культурах макрофагов: в группе животных, которым пептид вводили за 1 час до забоя, наблюдалось угнетение секреции ГЬ-2, а через 6 ч после введения — стимуляция. Продукция ШЫу как в спонтанных, так и в стимулированных клеточных культурах статистически значимо не изменялась под воздействием ВЕ. Было отмечено, что концентрация корти-костерона в плазме крови интактных мышей под воздействием ВЕ не изменяется как в ранние, так и в поздние сроки после введения пептида, что, в свою очередь, свидетельствует об отсутствии опосредованности эффекта пептида через продукцию кортикостерона. Таким образом, ВЕ играет важную роль в регуляции функций клеток адаптивного и врожденного иммунитета и, независимо от времени воздействия, усиливает продукцию спленоцита-ми ГЬ-4, угнетает продукцию ГЬ-ф и Ш-10 макрофагами перитонеальной полости. С другой стороны, направленность эффектов ВЕа на секрецию Ш-2 зависит от продолжительности действия пептида. Данные эффекты не связаны с изменением уровня кортикостерона в плазме крови экспериментальных животных.
РОЛЬ ЦИТОКИНОВ И ХЕМОКИНОВ В ТРАНСЭНДОТЕЛИАЛЬНОЙ МИГРАЦИИ NK-КЛЕТОК ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ
Баженов Д.О.1, Соколов Д.И.1, 2, Сельков С.А.1
1ФГБНУ «Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта», Санкт-Петербург, Россия 2 ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова» Министерства здравоохранения РФ, Санкт-Петербург, Россия
NK-клетки являются ведущей популяцией иммунных клеток в зоне маточно-плацентарного барьера. Они обладают фенотипическими и физиологическими особенностями, поэтому их выделяют в отдельную субпопуляцию — децидуальных NK-клеток. Ряд данных указывает на то, что пул этих клеток формируется из NK-клеток периферической крови, которые мигрируют в зону маточ-но-плацентарного кровотока. Однако до сих пор остается малоизученным вопрос о том, какие факторы направляют миграцию NK-клеток.
Цель. Изучить миграцию NK-клеток через эндотелий в присутствии цитокинов и секреторных продуктов плацент (СПП) 1-го и 3-го триместров.
Материалы и методы. Клетки линии EA.hy 926 вносили в верхнюю камеру поликарбонатной вставки (диаметр пор 8 мкм) для 24-луночных планшетов, инкубировали 24 часа. Затем в верхнюю вносили NK-клетки линии NK-92MI. В нижнюю камеру вносили кондиционированные среды из-под плацент и цитокины: IL-10 (100 E/мл), SDF-1 (100 Е/мл), инкубировали 24 часа. Затем NK-клетки из нижней и верхней камеры обрабатывали антителами к CD45. Абсолютный подсчет количества мигрировавших в нижнюю камеру NK-клеток измеряли на проточном цитофлуориметре FACSCantoII (BD, США).
Результаты. Установлено, что цитокин IL-10 увеличивал количество мигрировавших NK-клеток через монослой эндотелия в 1,2 раза. Хемокин SDF-1 увеличивал количество мигрировавших клеток в 2.5 раза. В присутствии кондиционированных сред плацент 1-го и 3-го триместров количество мигрировавших NK-клеток снижалось в 2,2 и 1,9 раза соответственно.
Выводы. SDF-1 может выступать в качестве хемоат-трактанта для NK-клеток. IL-10, концентрация которого в зоне маточно-плацентарного контакта возрастает, также усиливает миграцию NK-клеток.
МАРКЕРЫ ПОВРЕЖДЕНИЯ НЕРВНОЙ ТКАНИ И ВОСПАЛЕНИЯ ПРИ ТРАНЗИТОРНОМ НАРУШЕНИИ КРОВООБРАЩЕНИЯ СЕТЧАТКИ: ВОЗМОЖНОСТИ МЕДИКАМЕНТОЗНОЙ КОРРЕКЦИИ
Балацкая Н.В., Киселева Т.Н., Чудин А.В., Андрюшин А.Е.
ФГБУ«Московский научно-исследовательский институт глазных болезней им. Гельмгольца» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
Введение. Ретинальная ишемия — частая причина значительного снижения и потери зрения, развивающаяся на фоне сосудистых заболеваний (оптические нейропа-тии, окклюзии ретинальных сосудов, диабетическая ретинопатия, глаукома и т. д.). Транзиторные нарушения кровообращения глаза включают два периода — отсутствие кровотока (ишемия) и его восстановление (репер-фузия), которые являются частью одного патологического процесса — ишемии-реперфузии (И/Р). Известно, что активные формы кислорода, образующиеся в результате И/Р, запускают каскад воспалительных иммуномедиато-ров, миграцию лейкоцитов в очаг воспаления, способствующих дальнейшему повреждению тканей. Поэтому фармакологическая модуляция реперфузии может улучшить функциональное состояние сетчатой оболочки и последующее клиническое течение. В настоящее время в качестве одного из возможных терапевтических агентов рассматривается антиоксидант ресвератрол, терапевтический эффект которого уже был продемонстрирован в ряде экспериментальных работ.
Цель. Анализ динамики маркеров повреждения нервной ткани и воспаления в раннем и позднем постишеми-ческом периоде в ходе терапии ресвератролом при моделировании И/Р сетчатки в эксперименте.
Материалы и методы. Исследование проведено на 15 крысах (30 глаз) породы Wistar (в возрасте от 3 до 5 мес.) при общей (принятой в лабораторной практике), а также местной анестезии 0,4% р-ром оксибупрокаина. Моделирование односторонней И/Р сетчатки проводилось путем однократного субконъюнктивального введения в левый
