Научная статья на тему 'Иммунорегуляция'

Иммунорегуляция Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
431
59
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Иммунорегуляция»

Медицинская иммунология 2001, Т. 3, №2 © 2001, СПб РО РААКИ

ИММУНОРЕГУЛЯЦИЯ

ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНОСТЬ АЛЛОСПЕЦИФИЧЕСКИХ ЦТЛ В СИСТЕМАХ IN VITRO

Анфалова Т.В., Хромых Л.М., Казанский Д.Б.

НИИ канцерогенеза Российского Онкологического Научного Центра РАМН,

Москва, Россия

Специфические цитотоксические Т- лимфоциты (ЦТЛ) -основная субпопуляция Т клеток, осуществляющая защиту организма при вирусных инфекциях, поражении внутриклеточными бактериями, опухолевом росте и отторжении трансплантата. В отличие от большинства других исследователей, внимание которых направлено на изучение механизмов эф-фекторных цитолитических функций этих клеток, мы исследовали роль ЦТЛ в качестве нецитолитических регуляторных клеток. До сих пор остается дискуссионным вопрос о том, являются ли цитотоксические Т-лимфоциты и Т-супрессоры самостоятельными лимфоидными субпопуляциями или они относятся к единому клеточному пулу, разная функциональная активность которого проявляется в зависимости от конкретной иммунологической ситуации. В результате проведенных нами исследований были получены данные, подтверждающие вторую гипотезу. Получен ряд линий ЦТЛ, специфичных как ко всему Н-2 комплексу, так и к отдельным его субрегионам. Цнтотоксическую активность клеток оценивали по освобождению ? 1С г из клеток-мишеней. В результате взаимодействия аллоепецифическнх ЦТЛ одновременно с молекулой Н-2КЬ и а -тимознном Т-лимфоциты переходят в обратимое состояние анергии. Для этого перехода необходима повышенная концентрация с^-гимозина. В состоянии анергии эти ЦТЛ проявляют специфическую супрессорную активность, подавляя цитолитичсскую активность интактных ЦТЛ. Таким образом, показана возможность функциональной трансформации специфических ЦТЛ в Т-супрсссоры с антигенспе-цифпческой функцией. При дальнейшем изучении аллоспе-цифичсских ЦТЛ были получены результаты, которые показали новые нецнтолитическне регуляторные функции этих клеток. В частности, было показано, что клоны аллоспеци-фичеекпх ЦТЛ подавляют пролиферацию клеток, которая индуцируется при развитии ответа в MLR, независимо от специфичности рсспондеров и стимуляторов в данной MLR и специфичности ЦТЛ. Подавление реакции происходит только при непосредственном контакте ЦТЛ с клетками, взаимодействующими в MLR. Таким образом, полученные экспериментальные данные свидетельствуют о полифункциональности аллос-пецифпчсских ЦТЛ, выражающейся в способности этих клеток выполнять как эффекторные (лизис клеток-мишеней), так и регуляторные функции.

ИЗУЧЕНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ РЕКОМБИНАНТНОГО ИНТЕРЛЕЙКИНА-8 ЧЕЛОВЕКА В СИСТЕМЕ IN VIVO

Анциферова М.А., Казаков А.А.

ГНЦ НИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург, Россия

В настоящее время несомненна центральная роль интерлейкина-8 (IL-8) в привлечении и активации лейкоцитов при

воспалении. Главное свойство 1L-8 - стимуляция хемотаксиса нейтрофильных гранулоцитов, представляющих первую линию неспецифической защиты организма. Наряду с другими провоспалительными цитокинами IL-8 также регулирует функциональную активность нейтрофилов в очаге воспаления. Показано также, что IL-8 усиливает продукцию провоспали-тельных цитокинов (IL-1 (3, IL-6, TNF-a) мононуклеарами, обладает митогенной и хемотактической активностью для кера-тиноцитов, а также может стимулировать ангиогенез путем активации пролиферации эндотелиоцитов и гладкомышечных клеток.

Данная работа была предпринята с целью оценить биологическую активность нового препарата рекомбинантного IL-8 человека, полученного в ГНЦ НИИ особо чистых биопрепаратов, в системе in vivo. Рекомбинантный человеческий IL-8 в различных концентрациях вводили внут-рибрюшинно мышам гибридам (CBAxC57Bl)Fl. Двум группам вводили рекомбинантный IL-1 (3 человека, который, как известно, стимулирует выход нейтрофилов в очаг воспаления и усиливает их функциональную активность опосредованно, по всей видимости, путем индукции синтеза IL-8. Контрольной группе вводили стерильный физиологический раствор. Изучали в динамике относительное количество нейтрофилов в перитонеальной полости и в периферической крови, а также некоторые показатели функциональной активности перитонеальных клеток и нейтрофилов периферической крови: продукцию активных форм кислорода, фагоцитарную активность, адгезионную способность.

Внутрибрюшинное введение IL-8 вызывало миг рацию нейтрофилов в перитонеальную полость. Этот эффект был дозозависим и достигал максимума через 3-5 часа. Так, в опытных группах нейтрофилы составляли до 20% клеток перитонеального лаважа, тогда как в контрольной группе содержание нейтрофилов не превышало 1%. Местное введение 1L-8 также вызывало увеличение содержания циркулирующих нейтрофилов в периферической крови до 40%, по сравнению с 20% в контроле. На первые сутки после введения препарата содержание нейтрофилов в перитонеальном лаваже и в периферической крови достигало контрольного уровня. Интересно, что IL-1 (3 в используемых нами дозах не вызывал выход нейтрофилов в перитонеальную полость, однако обладал выраженным системным эффектом. При внутрибрюшинном введении IL-1(3 количество циркулирующих нейтрофилов увеличивалось до 70% через 3 часа после введения и снижалось до контрольного уровня на 1 сутки.

Полученные результаты подтверждают важную роль IL-8 в развитии воспалительной реакции. Биологические эффекты IL-8 делают его привлекательной мишенью для развития новых терапевтических стратегий. Подавление активности 1L-8 может иметь противовоспалительный эффект в лечении многих патологий, связанных е хроническим накоплением лейкоцитов при персистирующей инфекции, усиление активности этого цитокина может улучшать процессы заживления ран и восстановления поврежденных тканей. Однако для развития терапевтических агентов на основе 1L-8 в настоящее время накоплено недостаточно знаний о его биологической активности in vivo, для чего необходимы дальнейшие исследования в этой области

ПРОТЕКТИВНЫЙ ЭФФЕКТ ИНГИБИТОРОВ ХЛОРНЫХ КАНАЛОВ В МОДЕЛИ ОСМОТИЧЕСКОГО СТРЕССА КЛЕТОК ЛИМФОМЫ EL-4 СВЯЗАН С УВЕЛИЧЕНИЕМ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА 70

Баев Д.В., Сапожников А.М.

Институт биоорганической химии

им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Введение. Хлорные каналы плазматических мембран играют важную роль в процессах солевого обмена, регуляции объема, активации и программированной гибели лимфоидных клеток. При развитии апоптоза, на его начальных стадиях через эти каналы осуществляется дегидратация клеток, приводящая к уменьшению клеточного объема. Ранее мы продемонстрировали, что блокирование указанного этапа апоптоза селективными ингибиторами хлорных каналов (ИХК) препятствует развитию программированной гибели клеток лимфо-мы EL-4. Вместе с тем, в последующих исследованиях влияния ИХК на жизнеспособность клеток EL-4 в модели гипотонического стресса, характеризующейся увеличением клеточного объема, был также обнаружен протективный эффект данных ингибиторов. Очевидно, что, в отличие от модели апоптоза, указанный протективный эффект ИХК не может являться прямым следствием блокирования ионных каналов плазматических мембран, участвующих в регуляции клеточного объема. В связи с этим, мы предположили, что при культивировании клеток EL-4 в гипотонических условиях ИХК стимулируют экспрессию протективных белков теплового шока 70 (БТШ70), увеличивающих резистентность клеток к действию осмотического стресса.

Цель работы. Исследование влияния ИХК на уровень экспрессии БТШ70 в клетках лимфомы EL-4, культивируемых в условиях гипотонического стресса.

Материалы и методы. Ингибитор хлорных каналов -SITS (4-acetamido-4’-isothiocyanatostilbene-2,2’-disulfonic acid). Клетки мышиной лимфомы EL-4, культивируемые в стандартных условиях in vitro, с последующей 4-х часовой инкубацией в гипотонической среде с уменьшением тоничности питательной среды в 1,5 раза в присутствии и отсутствие S1TS. Для подсчета клеток использовался метод проточной цитоф-луориметрии (Epics Elite, Coulter, США) с использованием моноклональных антител к БТШ70.

Основные результаты. Клетки лимфомы EL-4, культивируемые in vitro в стандартных условиях, экспрессируют на своей поверхности БТШ70. В предыдущих исследованиях мы обнаружили у клеток EL-4 прямую корреляцию содержания БТШ70 на клеточной поверхности с интенсивностью синтеза данных протеинов, что позволяло с помощью метода проточной цитофлуориметрии оценивать вариации уровня экспрессии БТШ70, регистрируя изменения величины их поверхностного пула. Использование такого подхода в данном исследовании показало, что кратковременная инкубация клеток лимфомы EL-4 в гипотонической среде приводит к незначительному увеличению среднего размера, изменению объема клеток и к двукратному снижению уровня экспрессии БТ11170. Присутствие в гипотонической среде SITS ингибитора, в дозе супрессирующей развитие апоптоза клеток EL-4 (50 мкМ) не предотвращало увеличение клеточного объема, однако, в отличие от контроля, в этих условиях не наблюдалось падения уровня экспрессии БТШ70. Более того, в данных образцах экспрессия БТШ70 была более выраженной, чем в клетках, культивируемых в стандартных условиях в присутствии такой же дозы S1TS. Иными словами, гипотонический стресс

клеток EL-4, сопровождающийся блокированием хлорных каналов их плазматических мембран, приводил не к снижению, а к усилению экспрессии БТШ70 примерно в 1,5 раза.

Заключение. Полученные результаты подтверждают наше предположение о том, что блокирование хлорных каналов плазматических мембран клеток EL-4, культивируемых в гипотонических условиях, вызывает усиленную экспрессию протективных БТШ70, что может являться причиной защитного эффекта ИХК в модели осмотического стресса этих клеток. Механизмы данного явления требуют дальнейшего изучения.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 00-04-48898)

КОМПОНЕНТЫ ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИХ ПЕПТИДНЫХ КОМПЛЕКСОВ ТКАНЕЙ: НЕГАТИВНЫЕ РЕГУЛЯТОРЫ ПРОЛИФЕРАЦИИ КЛЕТОК

Блищенко Е.Ю., Карелин А.А., Филиппова М.М., Калинина О.А., Сазонова О.В., Яцкин О.Н., Хайдуков С.В., Шейкин Ю. А.*, Соколов Д. И.*, Фрейдлин И.С.* и Иванов В.Т.

Институт Биоорганической Химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

Москва, Россия

*Институт экспериментальной медицины РАМН, Сант-Петербург

Анализ экстрактов различных тканей млекопитающих показал, что все эти источники содержат в значимых количествах пептиды-продукты эндогенного протеолиза узкой группы белков с известной функцией, например, гемоглобина, актина, клеточных ферментов. В результате исследований установлено более 500 аминокислотных последовательностей таких пептидов. Показано, что состав и содержание этих веществ отличается высокой стабильностью в нормальных условиях и является тканеспецифической характеристикой. Стабильные и тканеспецифичные наборы этих пептидов получили название тканеспецифических комплексов тканей.

Изучение активности более 100 пептидов показало, что подавляющее большинство веществ обладают способностью ингибировать пролиферацию как трансформированных так и нормальных клеток in vitro. Исследование нескольких структурных групп пептидов, обладающих способностью уменьшать количество трансформированных клеток, в частности, пептидов, соответствующих участкам (3-цепи гемоглобина (32-41) и (3-актина (66-91), а также группы коротких пептидов длиной 3-4 АК, которые могут быть выщеплены из целого ряда белков-предшественников, позволило установить, что механизм их действия связан с обратимым ингибированием пролиферации. В случае наиболее активных веществ, этот процесс протекает с индукцией клеточной гибели. Антипроли-феративные эффекты этих веществ были изучены в панели трансформированных клеток различного происхождения, включая первичные опухолевые клетки и клетки, с приобретенной резистентностью к химиопрепаратам. Наиболее активные вещества - УУ-геморфин-5 и фрагменты (3-актина (75-90) и (68-77) обладали способностью подавлять пролиферацию опухолевых клеток на 70-95%, при наличии в несколько раз более низкой активности в культурах нормальных клеток. Все пептиды, несмотря на различие аминокислотных последовательностей, обладают общим механизмом действия на клетки, включающим обратимое подавление пролиферации и последующую индукцию обратимой резистентности клеток

к действию того же вещества. Исследование эффекта пептидов на трансформированные клетки в комбинации с противоопухолевыми цитостатическими препаратами показало, что результат совместного действия пары пептид/цитостатик напрямую зависит от времени и очередности добавления веществ к клеткам. С помощью изменения этих параметров можно добиться как ингибирования активности цитостатика пептидом, так и аддитивного антипролиферативного эффекта обоих веществ. Принципиальное различие эффектов напрямую связано со способностью пептидов обратимо останавливать деление клеток. Способность наиболее активных пептидов подавлять деление трансформированных клеток была подтверждена in vivo, что позволяет предположить, что атипроли-феративные эффекты компонентов ткансспецифических пептидных комплексов могут реализовываться на уровне организма. В рамках сообщения будет проведено сравнение основных характеристик компонентов ткансспецифических пептидных комплексов с пептидными гормонами и описано их предполагаемое участие в регуляции количества клеток в организме.

Работа поддержана Российским Фондом Фундаментальных Исследований, грант # Л-00-15-97948.

ВЛИЯНИЕ ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО РОСТОВОГО ФАКТОРА-р НА АНТИТОКСИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА С-РЕАКТИВНОГО БЕЛКА

Бутюгов А.А., Назаров П.Г.

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

Реализация эффекторными молекулами иммунной системы своих специфических функций в раннюю фазу развития инфекции играет ключевую роль в развитии адекватного иммунного ответа. При этом эффект данных взаимодействии зависит от возможного взаимодействия с другими агентами, как эндо- так и экзогенной природы. Ранее нами была показана способность мажорного реактанта острой фазы воспаления С-реактивного белка (СРБ) связывать стрептококковый порообразующий тиол-активируемый цитотоксин стрептолизин О (СЛО), что приводит к потере гемолитической активности СЛО. Известно, что трансформирующий фактор-Р (TGF-P) является модулятором диф-ференцировки и роста клеток вовлеченных в процессы клеточного и гуморального иммунного ответа, таких как В-лимфоциты, Т-хслперы и цитотокснческие Т-лимфоциты, тимоциты и ЕК-клетки, моноциты и макрофаги. В данной работе исследовалось влияние TGF-P на антитоксические свойства СРБ в гемолитической модели с эритроцитами человека (ЭЧ). С этой целью СЛО (НИИВС, СПб) в постоянной минимальной концентрации, обеспечивавшей 100% гемолиз, предварительно инкубировали в течение 30 минут при 37°С с СРБ в концентрациях 10 мкг/мл, 3 мкг/мл и 1,5 мкг/мл и двукратными разведениями TGF-P от исходной концентрации 2 мкг/мл. Затем к реакционным смесям, внесенным в лунки круглодонного 96-луночного планшета (“Linbro”) в объеме 50 мкл, добавляли по 30 мкл 1% суспензии ЭЧ, трехкратно отмытых в фосфатно-солевом буфере. Инкубацию проводили при 37°С до полного гемолиза эритроцитов в контрольных лунках. Затем планшет центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 минут, переносили по 70 мкл супернатанта в плоскодонный планшет и

проводили учет оптической плотности при 405 нм с помощью многоканального спектрофотометра SLT Spectra. Предварительная инкубация разведений TGF-P с токсином не приводила к изменению уровня гемолиза по сравнению с контролем. В то же время в присутствии максимальной концентрации СРБ (10 мкг/мл) наблюдалась полная отмена токсического действия СЛО. Оптическая плотность проб содержащих TGF-P в концентрациях 2мкг/мл и 1 мкг/мл с токсином и СРБ в концентрации 3 мкг/мл достоверно отличалась от значений в контрольных лунках. Четкий дозоза-нисимыи эффект отмены антитоксической активности СРБ был получен при инкубации разведений TGF-P с СЛО и СРБ в концентрации 1,5 мкг/мл. При исследовании действия TGF-p на субтоксические дозы СЛО не было получено данных об усилении гемолитической активности токсина. Изложенные результаты показывают, что TGF-P не нейтрализует СЛО, но блокирует антигемолитическую активность СРБ и, следовательно взаимодействует с СРБ.

Работа поддержана грантом РФФИ (01-04-49615).

ПОДАВЛЕНИЕ ПРОЛИФЕРАЦИИ И ЭКСПРЕССИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ЦИТОКИНОВ В АКТИВИРОВАННЫХ Т-ЛИМФОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА ПОД ВЛИЯНИЕМ ТИМУСНЫХ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК

Григорьева Т.Ю., Никонова М.Ф., Лиепииьш Д.Я., Станислав М.Л., Варфоломеева М.И., Ярилин А.А.

ГНЦ РФ Институт иммунологии Минздрава России, Москва

Нами исследовано влияние тимусных эпителиальных клетками (ТЭК) на пролиферацию и апоптоз покоящихся и активированных Т-лимфоцитов крови человека, а также появление в их цитоплазме в условиях активации цитокинов ТЫ - и ТЬ2-типов.

При совместном культивировании мононуклеаров периферической крови человека (МНПК), стимулированных Т-клеточным митогеном ФГА, с ТЭК в течение 72 часов в соотношении ТЭК:мононуклеары равном 1:50, ТЭК практически полностью отменяют индуцированную пролиферацию Т-кле-ток, доводя ее до уровня, ниже спонтанного фона пролиферации. Этот эффект сохраняется в диапазоне соотношения ТЭ-К:мононуклеары до 1:500. Одновременно происходит небольшое, но значимое усиление апоптоза, что, однако, не может объяснить полного подавления ФГА-индуцированной пролиферации.

При сокультивировании ТЭК и МНПК, активированных ФГА, изменяется экспрессия некоторых мембранных и внутриклеточных маркеров, однако этот эффект достаточно вариабелен. Закономерного изменения экспрессии маркеров CD3, CD4, CD8, CD45 не происходит. Единственно статистически значимым эффектом является усиление экспрессии CD30. Наблюдается также ослабление накопления внутриклеточных цитокинов INFy и IL-4, рассматриваемых как маркеры хелперов ТЫ - и Т112-типа, причем в отношении 1L-4 эффект проявляется сильнее, чем в отношении INFy.

Таким образом, при взаимодействии МНПК и ТЭК in vitro подавляется пролиферация Т-клеток и ослабляется экспрессия в них цитоплазматических цитокинов, особенно Thl-типа, при не резко выраженном усилении апоптоза.

АНАЛИЗ ПРОДУКЦИИ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 КЛЕТКАМИ ЛИМФОМЫ EL-4

Гусарова Г.А., Тарасенко Т.Н., Мурашко Д.А., Сапожников А.М.

Институт биоорганической химии

им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Введение. Белки теплового шока 70 (БТШ70) относятся к большом)' семейству протективных стресс-индуцируемых протеинов, выполняющих сервисные функции в процессах синтеза, транспорта, репарации и утилизации широкого спектра внутриклеточных протеинов, а также предохраняющие их от денатурации различными повреждающими агентами. Наряду с этим, недавно было обнаружено, что экзогенные БТШ70 проявляют свойства цитокинов при взаимодействии с анти-ген-представляющими клетками, несущими на своей поверхности рецепторы к данным молекулам. С вовлеченностью БТШ70 в сеть иммунорегулирующих цитокинов может быть связан продемонстрированный в ряде работ феномен продукции этих внутриклеточных протеинов в межклеточное пространство. Однако в настоящее время механизмы формирования внеклеточного пула БТШ70 практически не изучены. Наиболее распространено представление о том, что эта форма БТШ70 обусловлена высвобождением внутриклеточного содержимого разрушенных (некротических) клеток. В то же время наши предварительные данные, полученные в опытах с культурой клеток мышиной лимфомы EL-4 in vitro, указывают на возможность активной продукции внутриклеточных БТШ70 во внешнюю среду путем их промежуточной транслокации на клеточную поверхность и последующего сбрасывания в межклеточное пространство. Очевидно, что подобный процесс активного экзоцитоза наиболее адекватен существующим представлениям о природе цитокинов.

Цель и задачи. Данная работа была направлена на выявление источника внеклеточного пула БТШ70, обнаруживаемого в супернатанте культуры клеток EL-4 in vitro. Основная задача исследования заключалась в сравнительном анализе спектра протеинов, содержащихся в межклеточном пространстве популяции живых и разрушенных внешними воздействиями клеток EL-4.

Материалы и методы. Клетки лимфомы EL-4 предварительно культивируются в полной питательной среде с последующей краткосрочной инкубацией клеточного монослоя высокой плотности в бессывороточной среде. Для подсчета клеток использовался метод проточной цитофлуориметрии (Epics Elite, Coulter, США). Также применялись другие аналитические методы, в том числе спектрофотометрия, электрофорез в полиакриламидном геле, иммуноблотинг.

Основные результаты. Установлено, что при одинаковой клеточной плотности, в супернатантах, получепных от популяций клеток, разрушенных многократным замораживанием

- оттаиванием или с помощью детергента тритон Х-100, суммарная концентрация протеинов была примерно в 2-3 раза выше, чем в супернатантах, полученных от популяций живых клеток. Учитывая, что количество погибших клеток в живых культурах (не более 5% клеток, позитивных к окрашиванию трипановым синим) было как минимум в 20 раз меньше, чем в суспензиях разрушенных клеток, эти данные можно расценивать как свидетельство активной продукции клетками EL-4 протеинов в окружающую среду, поскольку количество белка, попадающего в супернатант из разрушенных клеток, пропорционально числу последних. Электрофоретический анализ спектра протеинов в образцах супернатанта,

полученных от разрушенных клеток, обнаружил многочисленные четко выявляемые фракции белков различной молекулярной массы. В отличие от этого, в супернатанте живой культуры клеток отчетливо выявлялись лишь мажорная фракция с молекулярной массой около 70 кДа и две минорные фракции с молекулярными массами примерно 96 кДа и 26 кДа. Такие радикальные различия зарегистрированных электрофо-реграмм доказывали, что присутствие указанных фракций протеинов в межклеточном пространстве культуры клеток EL-4 нельзя объяснить высвобождением внутриклеточного содержимого из примеси погибших клеток. Результаты последующего иммуноблотинга продемонстрировали достоверное связывание моноклональных антител к БТШ70 с протеинами из зоны 70 кДа во всех тестируемых образцах.

Заключение. Клетки мышиной лимфомы EL-4, культивируемые in vitro, продуцируют БТШ70 в межклеточное пространство. Этот процесс не связан с диффузией данных протеинов во внешнюю среду из примеси погибших клеток. Механизмы экзоцитоза лимфоидными клетками иммунорегуля-торных БТШ70 требуют дальнейшего изучения.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (грант № 00-04-48898).

МИГРАЦИЯ АКТИВИРОВАННЫХ ЛИМФОЦИТОВ В КОЛЛАГЕНОВЫЙ МАТРИКС ПРИВОДИТ К ИНГИБИЦИИ ИХ ПРОЛИФЕРАЦИИ

Давыдова Н.В., Козлов И.Г.*, Сергиенко В.И., Горлина Н.К.*, Емельянов А.Ю.*, Чередеев А.Н.*

Институт физико-химической медицины М3 РФ, *Российский государственный медицинский университет,

Москва, Россия

В процессе миграции из кровеносных сосудов в ткани лимфоциты постоянно взаимодействуют с коллагеном - одним из основных компонентов экстраклеточного матрикса. На молекулярном уровне взаимодействие лимфоцитов с коллагеном обеспечивается экспрессией на их поверхности молекул интегринового семейства. Сигнал, поступающий с интег-ринов, способен изменять направление активации многих клеток организма, в том числе и клеток иммунной системы.

Целью нашей работы было изучение динамики миграции митоген-активированных лимфоцитов в 3-мерный коллагеновый матрикс и влияния коллагена на пролиферацию этих клеток.

Лимфоциты получали из селезенок мышей линии СВА. Спленоциты стимулировали Т-клеточным митогеном - кон-канавалином А (Кон А) или В-клеточным митогеном - липо-полисахаридом (ЛПС). Трехмерный коллагеновый матрикс (КМ) формировали из коллагена I типа. Для сравнения миграционной активности интактных и стимулированных спле-ноцитов на разные сроки митогенной стимуляции производили отбор аликвот из опытных и контрольных образцов и инкубировали их на КМ в течение 4 часов. Количество мигрировавших клеток подсчитывали в гемоцитометре. При оценке пролиферации спленоциты, предварительно стимулированные с митогенами, помещали в КМ, содержащий 3Н-тимидин. Сравнивали включение метки в клетки, выделенные с помощью коллагеназы из КМ (опыт) с аналогичным показателем в суспензии (контроль). В качестве дополнительного контроля использовали полувязкую метилцеллюлозную среду (МЦ). Апоптоз лимфоцитов оценивали с помощью проточной цитометрии.

Миграция спленоцитов в КМ сильно возрастала на ранних стадиях митогенной стимуляции. После первых 4 часов стимуляции Кон А миграция составляла 194± 14% от уровня в нестимулированном контроле. К 48 часам миграционная активность снижалась до контрольных значений. Увеличение сроков стимуляции до 72 и 120 часов приводило к повторному возрастанию миграции, соответственно до 118± 17% и 251 ±24%. При стимуляции ЛПС начальные этапы динамики миграции спленоцитов были аналогичными. Но, в отличие от Кон А, увеличение времени стимуляции до 120 часов не вызывало повторного повышения миграции спленоцитов. Культивирование в КМ вызывало сильное угнетение пролиферации предварительно стимулированных спленоцитов. Торможение пролиферации не зависело от типа митогена (Кон А или ЛПС), но была связано со временем инкубации в суспензии. При инкубации в суспензии до 20 часов наблюдалась практически полная блокада пролиферации клеток (3% от контроля). Когда клетки помещали в гель через 20-24 часа от начала активации пролиферация составляла 15-20% от контроля. Увеличение времени инкубации до 48 и 72 часов приводило к возрастанию пролиферации спленоцитов в КМ, соответственно, до 50-60 и 30-40% от контроля. Напротив, культивирование активированных спленоцитов в МЦ приводило лишь к незначительному снижению пролиферации по сравнению с суспензионным контролем (91% от контроля). Оценка апоп-тоза показала, что контакт активированных спленоцитов с КМ практически не изменяет уровень их апоптоза.

Из полученных в данной работе результатов можно заключить, что на самых ранних этапах активации происходит индукция миграции Т н В лимфоцитов в КМ. Обе популяции лимфоцитов имеют сходную динамику миграции на ранних и средних этапах активации. Расхождение в поведении Кон А-и ЛПС-стимулированных спленоцитов на поздних сроках активации (120 часов), возможно, связано с различной регуляцией экспрессии интегринов на поверхности этих клеток. В свою очередь, контакт активированных клеток с коллагеновыми фибриллами приводит к торможению пролиферации как Т, так и В лимфоцитов. Существует зависимость между степенью торможения пролиферации и временем активации клеток в суспензии, которая, по-видимому, связана со стадией клеточного цикла и уровнем экспрессии адгезионных рецепторов на поверхности лимфоцитов. Торможение пролиферации лимфоцитов в КМ не связано с индукцией апоптоза и слабо зависит от особенностей пространственного расположения клеток в трехмерном матриксе.

ВЛИЯНИЕ СЕКРЕТОРНОГО ПРОДУКТА АКТИВИРОВАННЫХ НЕЙТРОФИЛОВ (НЕЙТРОФИЛОКИНА) НА ТЕЧЕНИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА

Долгушин И.И., Колесникова А.А., Колесников О.Л., Волчсгорский И.А., Зурочка А.В.

Государственная медицинская академия,

Челябинск, Россия

В настоящее время инсулинзависимый сахарный диабет (ИЗСД) рассматривают как первичную аутоиммунную эндок-ринопатию. Кроме того, у людей, страдающих ИЗСД, имеет место целый ряд изменений иммунологического статуса, которые затрагивают как гуморальные, так и клеточные факторы резистентности организма. Это обуславливает применение иммунотерапии при сахарном диабете 1-го типа. В современной клинической диабетологии все шире используют раз-

личные иммуномодуляторы: Т-активин, а и у интерферон, левамизол, нуклеинат натрия, азатиоприн, циклоспорин А. Необходимо отметить, что иммуномодуляторы не только улучшают иммунный статус больных сахарным диабетом, но и благоприятно влияют на клинические проявления этого заболевания. Все выше изложенное делает, безусловно, актуальным дальнейшее изучение влияния иммуномодулирующих воздействий на развитие и течение сахарного диабета.

Работа была проведена на 42 крысах линии Вистар. Инсулинзависимый сахарный диабет у крыс индуцировали однократным внутрибрюшинным введением аллоксана тригидра-та в дозе 200 мг/кг. В качестве иммуностимулятора использовали нейтрофилокин, который вводили животным четыре раза в дозе 7 х 10'7 мг/крысу. Введение иммуностимулятора начинали через 72 часа после инъекции аллоксана. Забой животных производили через 10 суток после индуцирования сахарного диабета.

Через 10 дней после индукции аллоксанового сахарного диабета уровень глюкозы в крови составил 235,14% от контрольных показателей. В то же время зарегистрированы ги-перкреатининемия и прирост содержания вторичных гепта-нофильных и изопропанолрастворимых продуктов перекис-ного окисления липидов в почках, что свидетельствует о вероятном формировании диабетической нефропатии.

Введение нейтрофилокина не сопровождалось изменениями уровня глюкозы в крови крыс с сахарным диабетом. В тоже время использование нейтрофилокина благоприятно влияло на липидный обмен, это проявилось в снижении уровня циркулирующих триглицеридов и холестерина на 31,1 % и 17,1% соответственно (р<0,01). Нейтрофилокин достоверно снижал концентрацию креатинина в сыворотке крови в 1,37 раза (хотя и не воздействовал на содержание продуктов липо-пероксидации в почках). Это, скорее всего, свидетельствует об улучшении фильтрационной функции почек у крыс с сахарным диабетом, получавших нейтрофилокин. Известно, что гиперхолестеринемия во многом способствует развитию гло-мерулосклероза при сахарном диабете. По-видимому, улучшение фильтрационной функции почек после введения нейтрофилокина может быть связано со снижением содержания липидов в крови.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о благоприятном воздействии нейтрофилокина на течение экспериментального сахарного диабета.

ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТОВ а-2-МАКРОГЛОБУЛИНА ЧЕЛОВЕКА НА КОМПЛЕМЕНТЗАВИСИМЫЙ ГЕМОЛИЗ

Дорофейков В.В., Галебская Л.В., Соловцова И.Л., Фрейдлин Т.С.

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П.Павлова

Альфа-2-макроглобулин (МГ) относится к универсальным ингибиторам протеиназ. Вместе с тем, он способен угнетать только ферменты, обладающие достаточно широкой субстратной специфичностью. В соответствии с теорией ло-вушечного механизма действия МГ, для блокирования активного центра протеиназы-мишени она должна осуществить гидролиз какой-либо пептидной связи приманочного участка ингибитора. Протсиназы системы комплемента отличаются очень высокой избирательностью и не способны использовать приманочный участок МГ в качестве субстрата. Однако, в последнее время появились свидетельства о вне-ловушечном способе взаимодействия МГ с протеолитичес-

кими ферментами. Кроме того, в экспериментах с МГ крыс было продемонстрировано его влияние на комплемент-зави-симый гемолиз [Я. Ве11о1, 1991]. Эти факты потребовали более детального исследования взаимодействия МГ с системой комплемента.

Препарат МГ получали из плазмы крови человека. В тер-мостатируемую при 37°С кювету спектрофотометра вносили пробы сыворотки крови здоровых доноров и препарат МГ. После 5-минутной инкубации добавляли прогретый до 37°С вероналовый буфер и клетки-мишени комплемента (эритроциты барана или кролика) и регистрировали динамику гемолиза по убыли оптической плотности при 800 нм. В большинстве случаев (при использовании препаратов МГ, выделенных из разных образцов донорской плазмы), достоверного влияния на скорость лизиса и емкость комплемента отмечено не было. Полагаем, что отсутствие существенного эффекта МГ было обусловлено достаточно высоким исходным содержанием эндогенного ингибитора в сыворотках крови. Поэтому для выяснения возможности взаимодействия МГ с комплементом нами были использованы препараты МГ, иммобилизованные на сефарозе СЬ 4В.

Смешанные донорские сыворотки элюировали через сорбент, содержащий нативный или обработанный метиламином МГ в одинаковых концентрациях (1 мг/мл) при скорости 5-20 мл/час и с остановкой процесса элюции на 30 мин после нанесения образца на сорбент (для увеличения времени экспозиции). Эксперименты проводили при 4°С и 20°С. В качестве контроля образцы этих же сывороток пропускали через колонки, содержащие сефарозу СЬ 4В. Было показано, что фильтраты сывороток, имевшие контакт с иммобилизованным МГ, отличались значительно более низкой активностью комплемента, чем контрольные. Скорость комплементзависимого лизиса была снижена в среднем на 60-80%. В такой же степени была понижена и емкость системы комплемента.

Температура проведения хроматографических процедур не имела существенного значения, что свидетельствует в пользу предположения о сорбции некоторых компонентов комплемента на МГ. Как нативные, так и обработанные метиламином препараты иммобилизированного МГ снижали активность комплемента примерно в одинаковой степени, причем как по классическому, так и по альтернативному путям.

Полученные нами данные о снижении активности комплемента после контакта с иммобилизированным как нативным, так и обработанным метиламином МГ свидетельствуют о внеловушечном механизме взаимодействия МГ с комплементом. Выявленная способность иммобилизированного МГ сорбировать из крови септических больных не только цито-кины, но и компоненты комплемента может оказать дополнительный полезный эффект, поскольку тяжесть септических проявлений напрямую зависит от активности системы комплемента.

ОБ АУТОКРИННЫХ ФАКТОРАХ ВЫЖИВАНИЯ КЛЕТОК ЦИТОТОКСИЧЕСКОЙ ЛИНИИ СТИ-2

Дьнчкова Л.Г., Гапон М.В., Костанян И.А., Луценко Г.В.

Институт биоорганической химии

им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Введение. В последнее время появляется все больше данных, указывающих на то, что выживание клеток млекопита-

ющих находится под строгим контролем факторов роста и аутокринных факторов выживания. Ранее нами была описана экспериментальная модель с переносом клеток цитотоксичес-кой линии СТ1Х-2 из культуры высокой плотности в культуру низкой плотности, в результате которого наблюдалась массовая гибель клеток. Внесение в культуру низкой плотности кондиционированной среды (КС), содержащей аутокринные факторы (АФ), полностью предотвращало гибель клеток. Было установлено, что наиболее вероятной причиной такой гибели является нарушение контроля выживания клеток СТЬЬ-2 аутокринными факторами, вызванное резким изменением их концентрации при переносе клеток из плотной культуры в разреженную.

Цель работы. Исследовать роль АФ в контроле выживания клеток 1Ь-2-зависимой линии СТ1Х-2, изучить механизмы регуляции их выживания и определить физико-химических характеристик АФ.

Материалы и методы. Бессывороточная среда для проведения экспериментов, приготовленная на основе ЯРМ1-1640, содержала 2мМ Ь-глутамина, 0,5 мг/мл Р-циклодекстрина, 0,5 мг/мл БСА, 5 мг/мл инсулина, 25 мг/мл трансферрина, 5х10'7 М путресцина, 50 мкг/мл гентамицина, 50 мкМ 2-меркаптоэ-танола и 100 Ед/мл ИЛ-2. Выживание клеток оценивали с использованием МТТ-теста. Для определения характера фрагментации ДНК клеток был использован метод электрофореза геномной ДНК в геле. Для определения молекулярной массы АФ использовали БОБ-электрофорез в полиакриламидном геле.

Основные результаты. Было показано, что клетки 1Ь-

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

2-зависимой цитотоксической линии СТЬЬ-2 после прекуль-тивирования в высокой плотности (в виде плотного осадка 1 х 106 клеток) в течение 14-16 часов и переноса в свежей среде в культуру низкой плотности (2 х 104 клеток/лунку) погибают в течение 5-6 часов. Уровень выживания клеток составлял лишь 5-20%. С использованием электрофореза геномной ДНК установлено, что гибель клеток носит некротический характер. Показано, что внесение в культуру низкой плотности 75% КС, полученной из культуры высокой плотности и содержащей АФ клеток СТЬЬ-2, полностью предотвращает клетки от гибели. Было проведено исследование роли ти-розиновых фосфатаз и тирозиновых киназ в механизме контроля выживания клеток СТЬЬ-2 аутокринными факторами. Установлено, что добавление ортованадата натрия (100 цМ), ингибитора тирозиновых фосфатаз, в культуру низкой плотности повышало выживание клеток после их переноса из плотной культуры с 7% до 40% (в отсутствие КС). В то же время, добавление генистеина (200 цМ), ингибитора тирозиновых киназ, усиливало эффект гибели клеток, отменяя спасающее действие КС на клетки. С использованием 80Б-электрофореза в полиакриламидном геле был проведен анализ белкового состава АФ, продуцируемых клетками СТЬЕ-2. В кондиционированной среде клеток СТЬЕ-2 помимо 1Ь-2 выявлены три группы белков с молекулярными массами: 30-40, 65-67 и 110 к£>а. В опытах с элюированием разделенных белков показано, что только белки с молекулярными массами 65-67 и 110 кЭа способны увеличивать выживание клеток СТЬЕ-2.

Заключение. Полученные данные свидетельствуют о важной роли АФ в контроле выживания клеток СТЕЕ-2 и об участии тирозиновых фосфатаз и тирозиновых киназ в механизме этого контроля. Получены данные о физико-химических характеристиках АФ, участвующих в контроле выживания клеток СТЕЕ-2.

Данная работа выполнена при поддержке РФФИ (грант 99-04-49620).

АКТИВАЦИЯ Т-КЛЕТОК CD4+ ДРЕВОВИДНЫМИ ПЕПТИДАМИ С ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬЮ МОЛЕКУЛ МНС

Казанский Д.Б., Побезинский Л.А., Побезинская Е.Л., Силаева Ю.Ю., Петрищев В.Н., Аифалова Т.В., Хромых Л.М., Скляров Л.Ю., Сбитнева И.Н., Копина Н.А., Сидорович И.Г.,

Российский Онкологический Научный Центр РАМН, ГП Институт иммунологии ФУ МБ и ЭП при М3 РФ, Москва, Россия

Мишенью антигенспецифических рецепторов (TCR) Т-лим-фоцитов, осуществляющих вспомогательные и эффекторные функции специфического клеточного иммунитета, являются молекулы главного комплекса гистосовместимости (МНС), представленные на поверхности клеток в виде комплексов с антигенными пептидами. Значительный вклад во взаимодействие TCR с комплексом молекула МНС/пептид вносят С-концевые участки a-спиралей доменов а, и а, молекул МНС класса I. Контактный сайт домена а, имеет ограниченную гомологию с Р-цепями молекул МНС класса II, что делает его привлекательным объектом исследований, направленных на стимуляцию иммунного ответа и дизайн новых вакцин. Для увеличения эффективности взаимодействия с рецепторами Т-клеток последовательность контактного сайта молекул H-2Db и H-2Ld АА158-175 синтезировали в форме древовидного тетрамера. В концентрациях менее 100 нг/мл в культуре in vitro тетрамер стимулирует пролиферацию спленоцитов мышей различных линий и приводит к длительному росту лимфоцитов и фибробластоподобных клеток. Сравнение спектров цитокшюв и костимуляторных молекул, экспрессируемых клоном активированных клеток памяти CD8 , со спектром цнтокинов, экспрессируемых Т-лимфоци-тами, индуцированными тетрамером in vitro, показало, что оба типа клеток экспрессируют мРНК CTLA-4, FasL. TNFa и TGFPr Но если первые экспрессируют мРНК у-интерферона, перфори-на и IL-10, то вторые не экспрессируют мРНК этих цнтокинов, но экспрессируют мРНК 1L-4. Однократная подкожная иммунизация экспериментальных животных древовидным тстрамером приводит к селективному увеличению доли клеток CD4 в периферических лимфоидных органах реципиентов. Это увеличение сопровождается усилением пролиферативных ответов лимфоцитов иммунизированных животных на аллельные продукты МНС, в частности, на индивидуальные продукты MFIC класса I. Полученные результаты свидетельствуют о возможности имитации естественных лигандов Т-клеточных рецепторов синтетическими пептидными конструкциями, что открывает перспективы создания новых и существенного повышения эффективности имеющихся вакцин, направленных на стимуляцию иммунитета к микробным и вирусным патогенам, а также антигенам злокачественно трансформированных меток.

ВЛИЯНИЕ АДАПТАЦИОННОГО СТРЕССА НА ХАРАКТЕР ЗАЩИТНЫХ РЕАКЦИЙ

Канайкин Д.П., Баскаков А.В., Крылов А.В., Медведский М.А., Полевщиков А.В.

Санкт-Петербургский государственный университет, Институт экспериментальной медицины РАМН,

Санкт-Петербург, Россия

Целью работы было изучение динамики защитных реакций у беломорского моллюска Mytilus edulis (мидия) на моде-

ли адаптации животных к изменению солености морской воды на фоне иммунизации стандартным антигеном - эритроцитами барана (ЭБ). Животные были разделены на три группы: первую составили животные, содержавшиеся в морской воде нормальной солености в течение всего срока эксперимента (15 суток), а также в течение 15 суток до его начала. Вторую группу составили мидии, которые в течение 15 дней адаптировались к условиям пониженной солености (переход ИЗ 25%о в воду с соленостью 10%о). Третью группу составили мидии, адаптация которых к изменению солености происходила на фоне введения ЭБ.

Характер гуморальных защитных реакций оценивали в реакции агглютинации по изменению титра гемагглютининов (ГА), специфичных к ЭБ. Клеточные защитные реакции оценивали на основании реакций адгезии гемоцитов к пластику, НСТ-теста и уровня пероксидазной активности гемоцитов.

Установлено, что в ответ на введение антигена уровень АГ достоверно снижался к 5-м суткам и восстанавливался до исходных значений к 15-м суткам эксперимента. При этом динамика и амплитуда уровней ГА была очень сходной в 1 и 2 группах, в то время как в 3-й группе наблюдали общее снижение уровней ГА в среднем на 2-2,5 разведения, а также изменение динамики и замедление скорости восстановления концентраций ГА.

Результаты оценки адгезионной активности гемоцитов показали, что максимальная адгезионная способность клеток формировалась к 5-м суткам эксперимента, одновременно с максимальным снижением титра ГА. Это наблюдение представляется существенным с той точки зрения, что согласно литературным данным ГА обычно являются и опсонинами для гемоцитов моллюсков. При этом самая низкая адгезионная способность отмечена как раз в 3-й группе.

Характер НСТ-теста у моллюсков всех трех групп был сходным: максимальный выброс активных форм кислорода через 5 минут после стимуляции зимозаном и постепенное снижение уровня продукции активных форм кислорода к 45 минуте.

Оценка пероксидазной активности показала, что у мидий эти ферменты локализованы как в гемоцитах, так и в гемолимфе. При этом у моллюсков групп 1 и 2 уровень перокси-дазы в гемолимфе в 2-3 раза выше, чем в клетках, в то время как у моллюсков группы 3 через 5 суток адаптации происходит резкое снижение уровня фермента в гемолимфе на фоне 10%-ного прироста его активности в клетках. Не исключено, что этот прирост отражает компенсационный прирост синтеза пероксидазы в клетках.

Следовательно, модель адаптационного стресса у моллюсков, во-первых, весьма чувствительно реагирует на влияние факторов окружающей среды, а во-вторых, свидетельствует, что данная модель может быть использована как в сравнительно-иммунологических, так и в эколого-иммунологичес-ких исследованиях.

КАТИОННЫЕ БЕЛКИ И ПОЛИПЕПТИДЫ НЕЙТРОФИЛОВ - СВЯЗУЮЩЕЕ ЗВЕНО МЕЖДУ ВРОЖДЕННЫМ ИММУНИТЕТОМ И АНГИОГЕНЕЗОМ

Киселева Е.П., Крылов А.В., Алешина Г.М., Шамова О.В., Кокряков В.Н.

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

В настоящее время большое внимание исследователей уделяется вопросам изучения врожденного иммунитета, и,

в частности, антибактериальным белкам и полипептидам, выделенным из нейтрофилов. Филогенетически древними факторами антибактериальной защиты являются а-дефенсины (Дф). Они представляют собой группу катионных пептидов с молекулярным весом 3,5-4,5 кДа, обладающих широким спектром проти-воинфекционной активности в отношении микробов, грибков и вирусов (LehrerR., 1993). Охарактеризована провоспалительная активность Дф: они обладают способностью активировать комплемент по классическому пути (Prohaszka Z. et al., 1997); привлекают в очаг воспаления моноциты (Territo et al., 1989), нейт-рофилы и Т-лимфоциты благодаря своим хемотакгическим свойствам (Chertov et al., 1996); способствуют формированию специфического иммунного ответа (Lillard J. et al., 1999).

Другим важным антибактериальным фактором нейтро-фильных гранулоцитов является лактоферрин (ЛФ), представляющий собой катионный железосвязывающий белок с молекулярной массой около 80 кДа. Он обладает выраженным бактерицидным и антипролиферативным действием, благодаря своей способности создавать среду, дефицитную по ионам железа. Независимо от своей железосвязывающей способности, ЛФ обладает иммунорегуляторным действием, причем как с про-, так и с антивоспалительным эффектом. С одной стороны, ЛФ активирует НК клетки (Shau Н. 1992), повышает цитотоксичность (Gahr М. et al., 1991), хемилюминесцен-цию (Ito М. 1983), фагоцитоз и продукцию супероксид радикалов (Кокряков В.Н., 1999) человеческими моноцитами и макрофагами животных, а также активирует адгезию (Oseas R. 1981) и продукцию гидроксильных радикалов нейтрофи-лами (Ambruso D. 1981). С другой стороны, ЛФ подавляет продукцию провоспалительных цитокинов мононуклеарами крови (Crouch S. 1992; Mattsby-Baltzer 1, 1996) и синтез антител in vitro (Duncan R.L., 1981).

В последние годы, в связи с интересом к изучению регуляции ангиогенеза, была пересмотрена роль нейтрофилов, которые раньше считались клетками, не принимавшими участие в новообразовании сосудов. Были получены данные о том, что нейтрофилы синтезируют ангиогенные факторы (VEGF, TNF-а, 1L-8, TGF[3) и протеолитические ферменты, влияющие на разные этапы роста сосудов. В связи с этим возник вопрос о роли в ангиогенезе катионных белков и пептидов нейтрофиль-ных гранулоцитов. Было показано, что Дф способны связываться с эндотелиальными клетками (Higazi et al., 1996), усиливать проницаемость сосудистой стенки (Ranadive N.S. 1968), стимулировать дегрануляцию тучных клеток (Befus ct al., 1999), оказывать митогенный эффект в отношении фибробластов (Murphy C.J. 1993; Плескач В.А. 1997). Впервые ангиогенная активность Дф кролика была продемонстрирована in vivo, когда в ответ на в/м введение препарата крысам было зарегистрировано увеличение количества и диаметра микрососудов. Кроме того, ежедневные инъекции Дф способствовали ускоренному ранозаживлению (Кудряшов и др., 1989, 1990).

ЛФ, напротив, оказался способен проявлять антиангио-генные эффекты. Этот белок блокирует продукцию GM-CSF (Broxmeyer et al., 1978) и других ангиогенных факторов мо-нонуклеарными фагоцитами. Он подавляет синтез TNF-a моноцитами крови in vitro (Crouch S. et al., 1992) и снижает его уровень in vivo в ответ на введение ЛПС (Machnicki М. et al., 1993). Кроме того, появились сведения о том, что противоопухолевое действие ЛФ может быть связано не только со стимуляцией НК клеток, как предполагалось ранее (Bezault J. Et al., 1994), но и с ингибицией роста опухолеиндуцирован-ных сосудов (Yoo Y.C. et al., 1997). На модели ангиогенеза ш vitro было впервые показано прямое действие Дф и ЛФ на функциональную активность эндотелиальных клеток (Крылов А.В. и др., 2000). Дф усиливал пролиферативные и адгезионные свойства эндотелия, в то время как ЛФ проявлял ан-тиангиогенные свойства.

Таким образом, антибактериальные белки и полипептиды нейтрофилов являются связующим звеном врожденного иммунитета, воспаления и ангиогенеза. Дальнейшее изучение этих естественных, созданных для защиты кожи и слизистых факторов, сочетающих в себе антибактериальные и иммуно-регуляторные свойства со способностью влиять на ранозажив-ление, перспективно с целью их применения при лечении различных заболеваний.

Работа поддержана грантами РФФИ № 00-04-49430 и 99-04-49508.

УЧАСТВУЮТ ЛИ ГЕНЫ СИСТЕМЫ АНТИГЕНОВ LEWIS В РЕГУЛЯЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ИММУНИТЕТА?

Лапицкая А.М., Чепель А.И., Вечерко А.В., Кузьмин Н.С., Жибурт Е.Б.

Российская Военно-медицинская академия, Санкт-Петербург, Россия

В последние годы ведутся активные научные работы по выяснению роли ряда генов человека в регуляции различных физиологических процессов, в том числе иммунного ответа организма. В этом аспекте изучались гены главного комплекса гистосовместимости, кодирующие группы крови и множество других (Стефен Д. И др., 1994). В основе этих работ лежит предположение о том, что полиморфизм белковых структур, синтезируемых этими генами, создает различные условия взаимодействия в системе рецептор-лиганд. Вследствие этого клетки могут по разному воспринимать регулирующие сигналы. Особенно это важно для клеток иммунной системы.

С учетом полученных ранее данных о взаимосвязи энергетического метаболизма и фенотипов системы группы крови Lewis, представляется интересным изучение участия данной

ТАБЛИЦА. СОДЕРЖАНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ У ЗДОРОВЫХ И БОЛЬНЫХ ИБС ЛЮДЕЙ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ФЕНОТИПОВ СИСТЕМЫ АНТИГЕНОВ ЬЕЩМ+М)

Показатель 1 группа 2 группа Р

Lea'b' Leab+ Lea'b' Lea'b+

Ід М, г/л 1,48+0,08 1,27±0,09 2,47+0,11 2,18+0,12 <0,05

1д G, г/л 13,28+1,1 10,94+1,2 19,28±1,4* 15,94+1,3 <0,05

1д А, г/л 1,80±0,Г 1,42±0,09 4,61+0,17* 2,85+0,11 <0,01

Р-значимость различия между 1-ой и 2-ой группами; * -р<0,05, значимость различия между разными фенотипическими группами.

системы в регуляции иммунного ответа. На первых этапах исследовали некоторые показатели гуморального иммунитета у здоровых и больных ишемической болезнью сердца (ИБС) людей с различными фенотипами системы антигенов Lewis.

Обследовано 88 практически здоровых людей (1 группа) и 88 пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) (2 группа), имеющих фенотипы Lea'b' и Le"ь*. Характеристики исследуемых показателей представлены в таблице.

Установлено, что уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови отличается у людей первой и второй групп, причем во 2-ой группе эти показатели превышают норму, что свидетельствует об изменении состояния В-клеточного иммунитета при ИБС. Однако, в большей степени обращает на себя внимание тот факт, что у лиц с фенотипом Le:1'b' наблюдается более высокий уровень IgA в 1-ой и 2-ой группах и Ig G во 2-ой группе, по сравнению с людьми, имеющими фенотип Lea b’.

Таким образом, полученные результаты дают возможность предположить участие антигенных структур системы группы крови Lewis в регуляции функциональной активности В-лим-фоцитов.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОЖНОГО И БРОНХОАЛЬВЕОЛЯРНОГО ЭПИТЕЛИЯ С МОНОНУКЛЕАРАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO. ПРОЛИФЕРАЦИЯ, АП0ПТ03 И КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ

Лиепиньш Д.Я., Никонова М.Ф., Григорьева Т.Ю., Шарова Н.И., Ярилин А.А.

ГНЦ РФ Институт иммунологии Минздрава России, Москва

Цель работы. Прояснить взаимные эффекты совместного культивирования мононуклсаров периферической крови (МНПК) с человеческими кератиноцитами и клетками брон-хо-альвеолярного эпителия (БАЭ).

Материалы и методы. Покоящиеся или ФГА-активиро-ванные МНПК культивировались совместно с интактными или активированными lFN-гамма (1 ООЕд/мл) кератиноцитами или БАЭ. Пролиферация клеток определялась с помощью включения Н-’-тимидина. Клеточный цикл был оценен с помощью окраски ДНК пропидий иодидом (ПИ), проточной цитометрии с использованием программы оценки клеточного цикла Mod Fit LT. Апоптоз оценивался на проточном цитометре после фиксации клеток и их обработки ПИ.

Результаты. Неактивированные и активированные керати-ноциты и БАЭ либо не оказывали эффекта, либо незначительно стимулировали пролиферацию МНПК, тогда как пролиферация ФГА-активированных МР1ПК значительно подавлялась. Кератиноцигы, по сравнению с БАЭ, оказывали более выраженный ингибирующий эффект на пролиферацию МНПК. Данные, полученные в результате анализа клеточного цикла МНПК, в целом совпадают с данными по пролиферации, а угнетение пролиферации МНПК не связано с усилением их апоптоза.

ПРОЛАКТИН МОДУЛИРУЕТ АКТИВНОСТЬ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ МАКРОФАГОВ ПРИ СТРЕССЕ

Немирович-Данченко Е.А., Фомичева Е.Е.

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

Исследование модулирующего действия различных гормонов, в том числе пролактина, на активность макрофагов

проведено, в основном, в экспериментах in vitro. Установлено, что пролактин активирует функции перитонеальных макрофагов, стимулируя их фагоцитарную активность, усиливая пролиферацию этих клеток и продукцию ими различных ци-токинов, оказывающих направленное действие на дифферен-цировку иммунокомпетентных клеток. В условиях целостного организма под влиянием стрессорного воздействия также изменяется активность макрофагов и продукция ими цитоки-нов в зависимости от силы и длительности действия стрессора, что коррелирует с угнетением иммунного ответа. Пролактин предупреждает стрессобусловленную иммуносупрессию, однако, механизмы иммуномодулирующего действия пролактина практически не раскрыты. В настоящей работе исследовали влияние стресса и пролактина на активность перитонеальных макрофагов, продуцирующих лимфоцитактивирую-щие факторы - ЛАФ (IL-1, IL-6, TNF).

Продукцию ЛАФ макрофагами определяли по способности супернатантов инкубированных клеток оказывать коми-тогенное действие на пролиферацию мышиных тимоцитов, стимулированных субоптимальными дозами конканавалина А (Кон А). Для активации макрофагов и индукции образования ими ЛАФ использовали ЛПС в дозе 200 мкг/мл.

В качестве стрессорного воздействия применяли содержание животных (крысы-самцы Wistar) в Холодовой камере при -20°С, в течение 20 минут. Предварительно за 20 минут до стресса животным вводили пролактин в дозе 5 и 25 нг/100 г массы.

Установлено, что внутрибрюшинное введение нестресси-рованным животным пролактина в разных дозах вызывало освобождение ЛАФ макрофагами в зависимости от введенной дозы препарата. Дозозависимый эффект сохранялся при последовательной аппликации пролактина и стресса как через 10 минут, так и через 24 часа после стрессорного воздействия, превосходя в 1,5-2 раза значения ЛАФ, зарегистрированные в случае стрессорного воздействия у животных, получавших физиологический раствор (Р<0,05).

При дополнительной стимуляции ЛПС перитонеальных макрофагов животных всех групп также наблюдалось усиление продукции ЛАФ по сравнению со стимулированными клетками контрольной группы, получавшей физиологический раствор (Р<0,05), а также превосходило значения ЛАФ в 2 раза в группах животных, получавших пролактин, по сравнению с нестимулированными клетками животных этих же групп.

Полученные данные отражают высокий уровень активации макрофагов животных, получавших пролактин, как без их дополнительной стимуляции, так и особенно при добавлении к ним ЛПС. Стрессорное воздействие практически не изменяет активированный пролактином уровень освобожд-неия ЛАФ, что свидетельствует об увеличении под влиянием пролактина функционального резерва макрофагов и продукции ими ЛАФ, составляющими которого являются иммуномодулирующие цитокины.

ИССЛЕДОВАНИЕ ТОНКОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ КЛЕТОК ПАМЯТИ В ОТВЕТ НА АЛЛОАНТИГЕН Н-2КЬ

Побезинская Е.Л., Побезинский Л.А., Сернова Н.В., Казанский Д.Б.

Российский Онкологический Научный Центр РАМН, Москва, Россия

Феномен аллореактивности обусловлен высокой частотой клонов, отвечающих на аллельные формы молекул гистосовместимости. Поэтому наряду с использованием животных с трансгенным Т-клеточным рецептором этот феномен

может быть использован для сравнения функциональных характеристик наивных Т-клеток и клеток памяти. Для получения клеток памяти, специфичных к молекуле Н-2КЬ мышей R101 (KdIJDb) иммунизировали внутрибрюшинно клетками тимомы EL4 (KbDb). Через два месяца после иммунизации можно было обнаружить селективную пролиферацию клеток памяти в ответ на аллогенные стимуляторы С57В1/6 (KhDb), подвергнутые тепловому шоку. Ранее, используя мышей из серии bin-мутантов С57В1/6, которые несут точечные мутации в молекуле К1’, нами было показано, что популяция клеток памяти, специфических к молекуле дикого типа, способна распознавать мутантные формы Kbml и Kbm1, несущие замены аминокислотных остатков в и а2 доменах соответственно. Ответ на К1™1 был сравним по величине с уровнем пролиферации в ответ на молекулу дикого типа, а на Кь"’:’- был существенно ниже. С целью более детальной характеристики специфичности отдельных клонов клеток памяти были получены клоны клеток памяти, в том числе один долгоживущий клон (CD8+TCRa/(3+V(32+). Он обладал сильной специфической цитолитической активностью и в пролиферативном ответе на Dd(Ld) и D4(L4) проявлял свойства гетероклититического клона, т. е. отвечал на эти “посторонние” антигены значительно более интенсивно, чем на специфический антиген. С целью более репрезентативной характеристики тонкой специфичности клеток памяти были получены Т-клеточные гибридомы. Для этого клетки, обогащённые в ответе на прогретые стимуляторы, были слиты с BWZ.36 и клонированы. Активацию гибридом тестировали по секреции ими IL-2 в ответ на стимуляторы, экспрессирующие различные аллельные формы молекул МНС. Среди гибридом обнаружились как клоны сильно отвечающие на специфическую аллогенную молекулу Кь, так и большой процент клонов со слабой реактивностью на специфическую мишень. Последующий анализ кроссреактивности этих клонов показал, что гибридомы, сильно отвечающие на специфический антиген, также активируются в ответе на молекулу К1’1"’. Это может говорить о преимущественном распознавании такими клонами а2 домена молекулы Кь. Гибридомы, сильно отвечающие на bml, как правило, слабо отвечали на Кь, т. е. проявляли свойства гетероклитических клонов. Возможно, присутствие значительной доли таких клонов в гетерогенной популяции клеток памяти является их фундаментальным свойством. Выяснение причин и значения этого феномена будет предметом дальнейших исследований.

СУПРЕССИЯ ИММУННОГО ОТВЕТА НА АЛЛОАНТИГЕНЫ, ИНДУЦИРОВАННАЯ ТЕПЛОВЫМ ШОКОМ

Побезннский Л.А., Побезинская Е.Л., Сернова Н.В., Петрищев В.Н., Лим Д.А., Казанский Д.Б.

Российский Онкологический Научный Центр РАМН, Москва, Россия

Исследования последних лет высветили важную роль физиологических изменений антигенпрезентирующих клеток (АРС), наблюдающихся в клеточном стресс-ответе, в процессах иммунорегуляции. Нами было показано, что наивные Т клетки не способны отвечать на прогретые (при 42 или 45°С) аллогенные клетки стимуляторы в смешанной культуре лимфоцитов (MLR) in vitro. Используя RT-PCR, было показано существенное снижение мРНК гена В-7 в предварительно

прогретых АРС. В системах тестирования пролиферативного ответа на молекулы МНС класса I было показано, что отсутствие пролиферации в ответ на АПК, подвергнутые тепловому шоку, связано не с супрессией ответа, а с дефектами в активации отвечающих клеток, не получающих в этой системе костимуляторного сигнала. Однако, внутривенная иммунизация интактных мышей аллогенными клетками селезенки, подвергнутыми тепловому шоку, приводит к индукции супрессоров, которые могут быть обнаружены в селезенке реципиентов по их способности подавлять пролиферативную реакцию наивных Т-клеток в ответ на аллоантигены в MLR. С использованием титрования супрессоров, добавляемых в MLR, было показано, что эффективность такой супрессии в 4 раза превышает супрессорный эффект, достигаемый иммунизацией облученными клетками. С целью выяснения возможных механизмов наблюдаемого эффекта в этой работе мы оценивали 1) влияние теплового шока на изменения в сайтах миграции введенных аллогенных клеток in vivo\ 2) возможность индукции CTL прогретыми аллогенными клетками; 3) возможную роль индуцибельных лигандов, экспрессирующихся в АРС под воздействием теплового шока. Используя мечение прогретых клеток иодистым пропидием и клетки трансгенных мышей, экспрессирующих зеленый белок (GFP), были выявлены сайты миграции погибших и жизнеспособных прогретых клеток. Погибшие клетки после внутривенного введения захватывались печенью. Жизнеспособные клетки в равной степени оседали в селезенке и в печени. Мы показали, что супрессоры, полученные в ответе на прогретые аллогенные клетки, не обладают цитотоксической активностью после обработки митомицином С. Однако, без такой обработки культивирование in vitro в течение 3-х дней приводит к появлению значимых уровней специфической цитолитической активности. Обработка аллогенных клеток во время прогревания циклогексимидом, полностью блокирует индукцию супрессии в этой системе. Этот факт позволил предположить, что в формировании супрессорного ответа непосредственную роль могут играть белки, чья экспрессия возрастает под воздействием теплового шока. Данная работа показывает, что клетки подвергнутые тепловому шоку, способны индуцировать супрессоры у аллогенных реципиентов in vivo. Выяснение механизма действия данной популяции и её фенотипа, является предметом дальнейших исследований.

ЦЕРУЛОПЛАЗМИН: ВЛИЯНИЕ НА ФУНКЦИИ НЕЙТРОФИЛОВ, ПРОЛИФЕРАЦИЮ ЛИМФОЦИТОВ И ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ МОНОНУКЛЕАРАМИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO

Полевщиков А.В., Медведский М.А., Захарова Е/Г., Шавловский М.М.

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

Введение. Работа посвящена анализу иммунологических функций одного из острофазовых белков - церулоплазмина (ЦП)

- основного переносчика меди в организме, обладающего также собственной ферментативной активностью. Концентрация ЦП в сыворотке крови в норме составляет около 300±150 мкг/ мл и в острую фазу воспаления возрастает примерно в 2 раза. Несмотря на давнюю историю изучения ЦН и описание ряда его биохимических эффектов как металлопротеина, характер его влияний на клетки, вовлеченные в воспалительные и иммунные реакции, остается изученным недостаточно.

Цель» исследования. Изучить влияние ЦП на некоторые функции нейтрофилов (Нф), мнтогсн-индуцированную пролиферацию лимфоцитов периферической крови человека и продукцию ряда иммуномедиаторов мононуклерами периферической крови in vitro.

Материалы и методы. Исследование было проведено на гепаринизированной донорской крови человека (18 доноров), из которой выделяли гранулоциты (95% клеток в этой группе составляли нейтрофилы. поэтому суспензию в дальнейшем рассматривали как суспензию Нф), и мононуклеары периферической крови. Клетки переводили в среду RPMI-1640 с низким содержанием (1%) эмбриональной телячьей сыворотки, а также L-глютамин и гентамицин. В ходе работы оценивали влияние ЦП на адгезию Нф к пластику, их миграцию под агарозой, активность миелопероксидазы и продукцию ими супе-рокснданиона в автоматизированной модификации НСТ-тес-та. Пролиферацию лимфоцитов индуцировали ФГА и лимфоцитарным митогеном (J1M) и учитывали через 72 часа по изменению активности тимидин-киназы, оцененной в МТТ-те-сте. Продукцию 1L-1(3, IL-4, IL-6, IL-8, IFNy. TNFa оценивали по их концентрации в супернатантах через 24 и 72 часа после начала культивирования методом твердофазного имму-ноферментного анализа. В всех экспериментах ЦП (и/или его модификации) использовали в финальных концентрациях 5, 50 и 500 мкг/мл.

Результаты. Установлено, что ЦП не обладает хематтрак-тантными свойствами в отношении Нф человека, показатель хемотаксиса для ЦП достоверно не отличается от контрольного. При внесении ЦП к Нф, миграция которых под агарозой была вызвана бактериальными липополисахаридами, ЦГ1 в концентрации 500 мкг/мл достоверно снижал миграцию Нф на 48-75%. ЦП в диапазоне концентраций 5-500 мкг/мл не изменял адгезионной способности Нф к пластиковой поверхности. Этот результат был подтвержден данными cell-ELISA теста с моноклональными антителами против молекул CD lib/ CD 18, по которым экспрессия интегриновых рецепторов под влиянием ЦП не изменялась. Принципиальные результаты были получены при изучении влияния ЦП на кислородный метаболизм нейтрофилов. Установлено, что при действии на нести.мулированные клетки ЦП в концентрации 500 мкг/мл снижал продукцию активных форм кислорода по данным автоматизированного НСТ-теста на 31 % (р<0,01), а при действии на Нф, стимулированные опсонизированным зимозаном - на 47,5% (р<0,001). Более того, ингибиция зимозан-индуциро-ванного кислородного метаболизма была установлена и при концентрации ЦП 50 мкг/мл (-37%, р<0,001). Этот результат указывает на противовоспалительный характер эффектов ЦП. Данный результат предварительно подтвержден также методом люминол-зависимой хемилюминесценции. Оценка влияния ЦГ1 на пролиферацию лимфоцитов выявила неоднозначный характер действия этого белка, у большинства доноров он снижал активность тимидин-киназы на 8-36% как в интак-тных, так и стимулированных клетках. Обнаружено, что ЦП в концентрации 500 мкг/мл снижает уровень 1L-1 (3, TNFa и IL-8, но не IL-6, который запускающет его собственный синтез в печени, через 24 ч культивирования, а через 72 ч снижает продукцию IFNy, но не 1L-4 в супернатантах культур моно-нуклеаров.

Заключение. Полученные результаты дают основание предполагать, что подобно другим острофазовым белкам сыворотки крови (С-реактивный белок, сывороточный амилоид Р) ЦП обладает противовоспалительным действием и способствует формированию гуморального иммунного ответа.

Работа поддержана грантом РФФИ № 00-04-48037.

ВЛИЯНИЕ ГЛЮКОКОРТИКОИДОВ И ИХ АНТАГОНИСТОВ НА НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ ЗАЩИТЫ ОРГАНИЗМА

Рассохина Л.М.

Государственная медицинская академия,

Челябинск, Россия

Глюкокортикоиды относятся к препаратам, подавляющим механизмы неспецифической защиты, особенно при длительном применении в больших дозах. Остается актуальным поиск препаратов, корригирующих негативное влияние глюко-кортикоидов на мононуклеарные фагоциты. В этой связи целью настоящей работы явилось изучение особенностей влияния глюкокортикоидов и их рецепторных антагонистов (ан-тиглюкокортикоидов) на различные стороны функциональной активности макрофагов.

Исследовано действие гидрокортизона, дексаметазона и их антагониста мифепристона на показатели функциональной активности перитонеальных макрофагов мышей и крыс: способность к фагоцитозу частиц латекса, кислородзависимый метаболизм (НСТ-тест), интенсивность свечения лизосом, флюорохромированных акридиновым оранжевым, продукцию оксида азота.

Введение гидрокортизона в дозе 10 мг/кг в течение 7 дней приводило к подавлению фагоцитоза частиц латекса: процент фагоцитирующих клеток снижался в 1,4 раза, а фагоцитарное число - в 1,5 раза. Глюкокортикоид в 1,5 раза уменьшал интенсивность свечения лизосом и показатели НСТ-теста. Аналогичные по направленности изменения отмечены при введении дексаметазона. Глюкокортикоиды не влияли на спонтанную продукцию оксида азота, но существенно угнетали нитроксидергичес-кие процессы на фоне стимуляции бактериальным липополиса-харидом (ЛПС). В последнем случае выраженность эффекта определялась сроками вежду введением глюкокортикоидов и ЛПС. Наиболее сильное антинитроксидергическое действие глюкокортикоидов отмечено при одновременном применении с ЛПС. Мифепристон (50 мг/кг) не оказывал существенного влияния на исследуемые показатели при введении интактным животным. Принципиально иная картина наблюдалась при совместном применении глюкокортикоидов и их антагониста: восстанавливалась фагоцитарная способность макрофагов, активировался кислородзависимый метаболизм, нормализовалось содержание лизосо-мальных гранул. Мифепристон отменял антинитроксидергическое действие гидрокортизона и дексаметазона при условии одновременного введения с ЛПС и глюкокортикоидами. Таким образом, показано протекторное действие антиглюкокортикоидов при глюкокортикоид-индуцированном угнетении макрофагаль-ного звена неспецифической резистентности.

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ IN VIVO КАК РЕЗУЛЬТАТ БАЛЛИСТИЧЕСКОЙ ТРАНСФЕКЦИИ

Родин Д. В., Колесников В. А., Зеленина И. А.*, Зеленин А. В., Деев С. М.

Институт Молекулярной Биологии им.В.А.Энгельгардта РАН,

Москва, Россия

*Московский Государственный Университет иц.М.В .Ломоносова,

Москва, Россия

Введение. В последние годы достигнуты значительные успехи в создании неприродных антител с заданными функциями и на основе этих работ формируется новое направле-

ние, называемое intrabody (intracellular antibody). Основу его составляет введение в организм генетических конструкций, кодирующих in vivo антитела с запрограммированными анти-гснсвязывающими и/или эффекторными функциями. Такие белки, как показано в литературе, могут оказаться весьма эффективными при лечении онкологических, инфекционных И других заболеваний. Возможность получения терапевтического эффекта от такого подхода уже продемонстрирована в случаях СПИДа и других заболеваний.

Цели и задачи. Поскольку использование intrabody дает возможности для получения терапевтического эффекта, необходимо с одной стороны искать оптимальные способы введения генов в клетки, а с другой - изучить закономерности экспрессии введенных генов в зависимости от типа ткани. Весьма важно также оценить иммунный ответ организма на ксеногенные детерминанты синтезирующихся рекомбинантных белков.

Материалы и методы. Гены тяжелой и легкой цепей химерного (мышь/человек) IgE были введены in vivo методом баллистической трансфекции в различные ткани мышей: селезенку (иммунокомпетентный орган), печень (через печень проходит большой объем крови), подушечки лап, не столь хорошо снабжающиеся кровью, и хрящевые ткани ушей. Как в любой хрящевой ткани, в последней, движение молекул осуществляется исключительно за счет миграции. Количество синтезированного IgE оценивалось в иммунохимическом тесте.

Результаты и обсуждение. Показано, что концентрация трансгенного иммуноглобулина в крови растет в первые же дни после трансфекции и поддерживается в идентифицируемых количествах около трех недель. При трансфекции всех тканей, за исключением хрящевой, средняя концентрация IgE первые 3 недели составляла около 8 МЕ/мл (для хрящевой ткани - около 1 МЕ/мл). Концентрация антител, синтезированных иммунной системой мыши в ответ на появление ксе-ногенных детерминант, для всех групп мышей была одинакова - на уровне 20 МЕ/мл. Следовательно, несмотря на различия в количестве иммуиогенного белка, поступающего в организм из трансфецированных тканей (в случае печени, селезенки, подушек лап - 8 МЕ/мл, для хрящевой ткани - 1 МЕ/ мл) достигается одинаковый уровень иммунного ответа.

Повторная баллистическая трансфекция была произведена на 114-й день после первой. В пределах точности используемой иммунохимической тест-системы в крови мышей всех групп не были обнаружены ни химерные антитела, ни антитела к их кссногенным детерминантам.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Таким образом, показано, что экспрессия химерного IgE не является тканеспецифической (кроме хрящевой ткани, где сравнительно затруднено движение молекул); ксеногенный ответ на появление химерных антител не является дозозависимым. Однако, известно, что вторичный ответ на чужеродные детерминанты сильнее первичного и быстрее достигает максимума - следовательно, после повторной трансфекции синтезируемые химерные IgE могли быть почти сразу инактивированы в результате вторичного ответа. Тем временем антитела к “человеческим” детерминантам могли быть инактивированы мышиными антителами, поскольку человеческие и мышиные IgE иногда имеют перекрестное распознавание детерминант. Другим объяснением полученных данных может стать синтез не идентифицируемых нами антител к транс-фецируемой ДНК. Менее сильный первичный ответ мог позволить генам экспрессироваться, что стало невозможным после вторичного распознавания. Возможно, из-за того, что вторичный иммунный ответ сильнее первичного и проявляется быстрее, концентрация химерных иммуноглобулинов не

достигала значимых величин. Отсутствие же антител к человеческому ^Е могло явиться следствием его перекрестной реакции с мышиными иммуноглобулинами. Кроме того, нельзя исключать из рассмотрения вторичный Т-клеточный ответ, способный существенно снизить значения обоих измерявшихся параметров.

Заключение. Наблюдения могут оказаться полезными при проведении генетической иммунизации, поскольку баллистическая трансфекция хрящевой ткани уха существенно проще и не отягощена последующими побочными эффектами. Напротив, для задач генотерапии, при которых необходимо добиться существенной экспрессии вводимого гена, целесообразно использовать ткани, в которых биосинтез целевого белка и его последующий транспорт проходят более эффективно.

Работа поддержана грантами РФФИ (№99-04-48836 и №98-04-49947), Российской программы поддержки ведущих научных школ (№96-15-97 640) и Программы “Геном человека”.

ПРОЛИФЕРАТИВНЫЕ ЭФФЕКТЫ ЭНДОГЕННЫХ ФРАГМЕНТОВ ГЕМОГЛОБИНА: РОЛЬ В ТКАНЕВОЙ РЕГУЛЯЦИИ

Сазонова О.В., Блищенко Е.Ю., Калинина О.А., Хайдуков С.В., Карелин А.А., Иванов В.Т.

Институт Биоорганической Химии им. М.М Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Москва, Россия

Эндогенный протеолиз гемоглобина приводит к образованию фрагментов этого белка, детектируемых в тканях млекопитающих в количествах, достигающих 1 нМ на грамм ткани. Их состав и содержание стабильны в норме и являются тканеспецифическими характеристиками, но изменяются при некоторых патологиях, связанных с изменением пролиферативного статуса ткани, например, в связи с канцерогенезом. Тестирование биологической активности фрагментов гемоглобина, выделенных из мозга млекопитающих, а также лизата эритроцитов человека и супернатанта переживающей культуры этих клеток, показало для большинства из них способность влиять на пролиферацию клеточных культур, причем среди идентифицированных пептидов были как стимулирующие, так и ингибирующие пролиферацию. Это дало основание постулировать для них роль в регуляции соотношения клеток в тканях, то есть в поддержании тканевого гомеостаза.

Одними из самых активных стимуляторов пролиферации являются пептиды группы неокиоторфина - фрагменты, образующиеся из участка альфа-цепи гемоглобина (133-141). Неокиоторфин (ос-( 137-141)) отличается наиболее высоким содержанием в тканях и секретируется эритроцитами. Пептиды а-(133-141), а-(134-141), а-(135-141), а-(137-141), а-(134-140), а-(137-140), а-( 133-138) и а-(137-138) стимулируют пролиферацию трансформированных фибробластов мыши Ь929 меланоцитов мыши М3 в отсутствие фетальной сыворотки. Эффект при этом варьирует в диапазоне 30-50% в зависимости от последовательности. Для пептидов а-(134-141) и а-(137-141) также показана стимуляция пролиферации эмбриональных фибробластов мыши (МЕР) в отсутствие сыворотки. В случае долговременной депривации сыворотки для пептидов а-(134-141) и а-(137-141) показана способность поддерживать пролиферацию в культурах трансформированных клеток Ь929 и М3 по крайней мере 96 часов. В гетерогенных переживающих культурах нормальных клеток красного костного мозга и селезенки мышей этот эффект длится по крайней мере 72 часа. Это позволило охарактеризовать дан-

ную группу протеолитических фрагментов как пептиды с поддерживающей функцией.

Цитометрический анализ для неокиоторфина подтвердил его способность вызывать прогрессию клеточного цикла, и таким образом поддерживать пролиферативный статус клеток. Параллельно с анализом ДНК было выявлено уменьшение объема клеток приблизительно на 30%, что свидетельствует о наличии у неокиоторфина механизма действия, отличного от ростовых факторов.

Согласно группе результатов, полученных на модели клеточной плотности с использованием клеточных культур фиб-робластнческого (L929 и MEF) и меланоцитарного (М3) происхождения, в присутствии сыворотки стимулирующий эффект пептидов ot-( 134-141) и а-(137-141) зависит от количества клеток в популяции. Для пептида ot-( 134-141) вид зависимости эффекта от клеточной плотности позволил предположить его участие в процессах тканевой регенерации в организме (ускорение пролиферации только при сниженной клеточной плотности).

Полученные результаты указывают на способность фрагментов гемоглобина исследуемой группы, присутствующих в тканях, влиять на пролиферацию клеток. Они действуют аналогично факторам роста, но другим механизмам; in vivo в условиях дефицита ростовых факторов они могут компенсировать их недостаток, а в норме участвовать в поддержании нормального соотношения клеток в тканях. В то же время, изменение содержания пептидов может способствовать канцерогенезу, что происходит при накоплении неокиоторфина в легочной ткани при мелкоклеточном раке легкого.

Работа поддержана Российским Фондом Фундаментальных Исследований, грант #00-04-48639.

ЦИТОХРОМ Р450 И ИММУНИТЕТ

Сибиряк С.В.

Отдел клинической и экспериментальной иммунологии Всероссийского центра глазной и пластической хирургии,

Уфа, Россия

Суперсемейство цитохромов Р450 (ЦхР450) представлено ассоциированной с мембраной гладкого эндоплазматичес-кого рстикулума обширной группой оксигеназ с различной субстратной специфичностью. ЦхР450 являются ключевыми ферментами, катализирующими окисление (монооксигениро-вание) самого широкого спектра липофильных ксенобиотиков, обеспечивая их биотрансформацию в водорастворимые метаболиты, а также эндобиотиков - стероидных гормонов, витамина D, ретиноидов. жирных и желчных кислот, арахи-допатов. В наибольшей мере ЦхР450 экспрессированы в ге-патоцитах, почках, легких, стероидпродуцирующих тканях надпочечников и половых желез, мозге, в клетках иммунной системы - лимфоцитах и макрофагах. Убедительно аргументирована роль иммунной системы в модуляции активности ЦхР450. Развитие вирусных и бактериальных инфекций, иммунизация, введение иммуностимуляторов приводит, опосредованно через цитокины (интерфероны, 1L-1, IL-2, IL-6, TNF) и ннтроксидергические механизмы депрессии активности ЦхР450-зависимых моиоокенгеназ. Это необходимо для изменения характера биотрансформации ряда эндогенных липофильных биорегуляторных молекул в условиях “иммунного стресса". Длительная локальная продукция TNF. 1L-6 или 1L-1 ведет к возрастанию активности некоторых изоформ ЦхР450 (CYP19, ароматаза), что является фактором риска развития гормон-завиенмых опухолей.

В лимфоцитах экспрессирован арилуглеводородный рецептор (АЫ1) - лиганд-активируемый транскриптационный фактор, который в неактивной форме представлен тримером (115р90)2А11А9-протеин. Эндогенными лигандами АИЯ являются, предположительно, метаболиты триптофана. АЬЯ-зави-симая изоформа СУР1А1 играет важную роль в регуляции митогенеза и апоптоза лимфоцитов; ее активность сопряжена с активностью протеинкиназы С, экспрессией с-Рэв, с-_щп, гена 1Ь-2 и некоторых других цитокинов, формированием ОТкВ, активностью р53, экспрессией ГаэЛ. Экспрессия в лимфоцитах иммунореактивных белков и энзиматических активностей изоформ, участвующих в синтезе и биотрансформации стероидов (СУР 11 А, СУР 19, СУР21, СУРЗА4/5) свидетельствует об участии этих клеток во внегландулярном метаболизме гормонов. В макрофагах экспрессирована стерол-27-гидроксилаза, превращающая холестерин в легко экскрети-руемые метаболиты. Это вносит существенный вклад в системную регуляцию уровня холестерина в организме и обеспечивает клеточно-автономную регуляцию уровня холестерина в мембране, что необходимо для пролиферации и диффе-ренцировки. В миеломоноцитарных предшественниках и макрофагах обнаружена высокая активность СУР450С11, которая катализирует образование важнейшего эндогенного иммунорегулятора 1,25-дигидрокси-витамина Бг

Исследования в этой области представляются чрезвычайно перспективными и позволят найти новые и неожиданные решения в разработке методов регуляции функций иммунной системы.

СОПРЯЖЕННОСТЬ ВЛИЯНИЯ ЦИТОКИНОВ НА СЕКРЕЦИЮ ХЕМОКИНА И-8 И НА ЭКСПРЕССИЮ АДГЕЗИОННОЙ МОЛЕКУЛЫ 1САМ-1 КЛЕТКАМИ ЛИНИИ ЕСТ304

Соколов Д.И., Котов А.Ю., Симбирцев А.С., Полосухина Е.Р., Барышников А.Ю., Фрейдлин И.С.

НИИ экспериментальной медицины РАМН, ГНЦ НИИ особочистых биопрепаратов,

Санкт-Петербург, Онкологический Научный Центр им.Н.Н.Блохина,

Москва, Россия

Ранее нами было показано, что ТОТа и 1Ь-1 (3 оказывают одинаково выраженное дозозависимое стимулирующее действие на экспрессию 1САМ-1, и на секрецию 11.-8 эндотелиальными клетками линии ЕСУ304, хотя стимулирующее действие ГЬ-1 (3 на экспрессию 1САМ-1 было достоверно ниже стимулирующего действия Т№а. Равноценное стимулирующее действие и на экспрессию 1САМ-1 и на секрецию 1Ь-8 оказывали сочетания Т1МРа с 1Ь-1Р и/или с №N7. На основании совпадения стимулирующих эффектов провоспалитель-ных цитокинов на секрецию 11.-8 и на экспрессию 1САМ-1 можно было предположить, что повышение экспрессии 1САМ-

1 является следствием усиленной продукции хемокина 1Ь-8, который аутокринно стимулирует экспрессию адгезионных молекул 1САМ-1 на эндотелиальных клетках. Однако, как показали наши исследования, рекомбинантный 11.-8 в широком диапазоне концентраций не оказывает влияния на экспрессию 1САМ-1 на поверхности клеток линии ЕСУ304. Для проверки предположения о возможности аутокринного влияния 1Ь-8 на экспрессию 1САМ-1 клетками линии ЕСУ304 дополнительно был использован ингибиторный анализ с использованием моноклональных антител против И.-8, нейтрализующих этот цитокин. Добавление моноклональных антител в

концентрации 0,2 - 1,0 мкг/мл в культуральную среду одновременно с ТОТа за сутки приводило к снижению концентрации секретируемого клетками ЕСУ304 1Ь-8 с 5108± 116 пг/мл до 133,5±3,8 пг/мл и 118,5±1,9 пг/мл - соответственно, что свидетельствует о нейтрализации специфическими антителами основной массы секретированного цитокина. Стимулирующее влияние ТОТа, 1Ь-1а и их сочетания на экспрессию 1САМ-1 на клетках линии ЕСУ304 полностью сохранялось на фоне нейтрализации 1Ь-8. Нейтрализация секретированного клетками линии ЕСУ304 1Ь-8 не отражалась и на стимулирующих эффектах №N7 и его сочетаний с ТИРа и смесью ТОТа-МИр. Полученные результаты позволяют заключить, что индукция провоспалительными цитокинами усиленной экспрессии адгезионных молекул 1САМ-1 на клетках линии ЕСУ304 является их самостоятельным эффектом, не опосредованным через аутокринную регуляцию параллельно индуцированным хемокином 11.-8. В пользу автономного характера регуляции этих двух проявлений биологической активности эндотелиальных клеток свидетельствуют также эффекты других изученных цитокинов. Так, ШИу стимулировал экспрессию 1САМ-1 на клетках линии ЕСУ304, не влияя на секрецию 11.-8 этими клетками. 1Ь-10, наоборот, несколько усиливал секрецию клетками 11.-8, не влияя на экспрессию 1САМ-1. вМ-СБТ ингибировал только секрецию 11.-8, не влияя на экспрессию 1САМ-1.

Работа поддержана грантом РФФИ №00-04-48064.

ЭФФЕКТ ПРЯМОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С-РЕАКТИВНОГО БЕЛКА, СЫВОРОТОЧНОГО АМИЛОИДА Р И ИНТЕРЛЕЙКИНА-8 НА НЕЙТРОФИЛЫ ЧЕЛОВЕКА

Турчинович Г.Б., Галкина Е.В., Назаров П.Г.

Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург

С-реактивный белок (СРВ) и его близкий гомолог сывороточный амилоид Р (САР) относятся к семейству пентраксинов. Их концентрации резко повышаются в сыворотке крови во время острой фазы воспаления, вызванного преимущественно бактериальными патогенами. Оба белка обладают функциональными свойствами лектинов беспозвоночных животных. На данный момент обнаружено значительное число лигандов для СРВ и САР. Для СРВ это богатые фосфорилхолином вещества (С-полисахарид клеточной стенки пневмококков), компоненты каскада комплемента, некоторые углеводные остатки, полианионы и поликатионы. Для САР описана способность взаимодействия с ламинином, что обуславливает его наличие в составе амилоидных отложений по ходу сосудов. Еще одной интересной группой лигандов для СРВ и САР являются некоторые ци-токины, в частности, интерлейкин-8 (11.-8), являющийся основным активатором и хемоаттрактантом для нейтрофилов (Нф). Задачей данного исследования являлось изучение механизмов регуляции С-реактивным белком и сывороточным амилоидом Р цитотропных эффектов 11.-8.

Нейтрофилы выделяли из крови здоровых взрослых доноров. Адгезию Нф к иммобилизованным белкам измеряли с помощью окраски кристалл-виолетом. Прямое взаимодействие между пентраксинами и 11.-8 было установлено с использованием иммуноферментного метода (ИФА). Для этого СРВ или САР иммобилизовали на пластике, свободные места для посадки белков забивали БСА, далее лунки инкубировали с ИЛ-8. Связавшийся 11.-8 выявлялся поликлональными антителами с использованием двукратных разведений, начиная с 1/100.

В ходе исследований было выявлено, что СРВ и 1L-8 взаимодействуют друг с другом при предварительной иммобилизации СРВ на пластике. Аналогичные данные были получены и по связыванию САР и IL-8, причем выяснено, что эти взаимодействия являются Са++-независимыми. Обязательным условием является предварительная иммобилизация пентраксинов, так как в обратной ситуации - при иммобилизации IL-8 -взаимодействие не обнаружено. Также показано, что адгезия Нф к иммобилизованным СРВ, САР и СРВ в присутствии IL-8 не превышает контроль (БСА), в то время как иммобилизация САР и 1L-8 приводит к достоверному усилению адгезии Нф по сравнению с контролем.

Таким образом, можно заключить, что СРВ и САР играют важную роль в регуляции миграции и адгезии Нф через связывание IL-8. Отдельный интерес представляет вопрос о роли этих белков в очаге воспаления и на стенках кровеносных сосудов, где оба пентраксина могут откладываться. Возможно, что и СРВ и САР выполняют функцию защиты не поврежденных тканей от атаки активированных лейкоцитов. Так или иначе, регуляторная функция пентраксинов не может быть отнесена ни к про-, ни к противовоспалительной, а зависит от конкретных условий реакции воспаления.

Работа поддержана грантом РФФИ (01-04-49615).

ИНДУКЦИЯ АПОПТОЗА ДОНОРОМ ОКСИДА АЗОТА З-НИТРО-4-ФЕНИЛФУРОКСАНОМ В КЛЕТКАХ ОПУХОЛЕВЫХ ЛИНИЙ HeLa, РАЗЛИЧАЮЩИХСЯ ПО ЭКСПРЕССИИ ПРОТООНКОГЕНА Вс1-2

Фрезе К.В.1, Плотников Е.Ю.1, Коц А Я.2, Хропов Ю.В.2, Белов Г.А.3, Овчинников И.В.4, Махова Н.Н.4

?Каф. Клеточной физиологгш и иммунологии,

Лаб. Химии ферментов Биологического факультета МГУ им. М.В.Ломоносова,

, Москва

лаб.взаимодействия вирусов с клеткой НИИ физико-химической биологии МГУ им. М.В.Ломоносова,

Москва

лаб. азотсодержащих соединений Института Органической химии РАН,

Москва

Введение. Одной из эндогенных эффекторных цитоток-сических молекул является оксид азота (N0), продуцируемый, в том числе, макрофагами при соответствующей стимуляции. Показана способность N0, в физиологических концентрациях вызывать индукцию программы гибели (апоптоза) чувствительных опухолевых клеток-мишеней in vitro. Использование в модельных экспериментах азотсодержащих соединений - источников (доноров) экзогенного оксида азота, является подходом для изучения запуска и реализации апоптотической программы. Индукция и развитие апоптотической программы тесно связаны с изменениями в функциональном состоянии митохондрий, и одним из основных участников процессов, приводящих в конечном итоге к самоубийству клеток, является ассоциированный с митохондриями антиапоптоти-ческий белок Вс1-2.

Цель исследования. Изучение апоптогенной активности донора оксида азота - З-нитро-4-фенилфуроксана (3NPF), способного высвобождать N0 при взаимодействии с SH-rpynna-ми белков (Ferioli R, et al, 1995, Br J Pharmacol; 114 (4):816-20). Для изучения механизмов гибели клеток, индуцируемой

ЗМРР, использовали клеточные линии, различающиеся по экспрессии Вс1-2.

Материалы и методы. Сверхэкспрессию гена Ьс1-2 в клетках НеЬа получали в результате стабильной трансформации исходной линии клеток НеЬа ретровирусным вектором, несущим кДНК Ьс1-2. Селекцию клеток проводили в среде, содержащей пуромицин, устойчивость к которому служит маркером использованного экспрессионного вектора. Цитотоксичес-кое действие ЗМРР на линии НеЬа и НеЬа/Вс1-2, несущую Ьс1-

2 трансген, изучали с помощью МТТ-теста, а наличие апоп-тотичсских изменений в клетках выявляли с помощью флуоресцентной микроскопии с красителем Ноес!^ и электрофореза тотальной клеточной ДНК.

Результаты и обсуждение. С использованием цитотокси-ческого МТТ-теста установлено, что экспрессия антиапопто-тического белка Вс1-2 в клетках НеЬа приводит к существенному повышению их резистентности к оксиду азота, по сравнению с родительской линией, не несущей трансгена. Эти данные свидетельствуют о вовлечении ингибитора апоптоза Вс1-2 в развитие устойчивости к ЗЫРР

В работе собраны доказательства в подтверждение апоп-тотического характера гибели клеток в данных экспериментальных условиях. При окраске ДНК ядер витальным красителем Ноес!^ обнаружена конденсация хроматина в клетках НеЬа после обработки ЗМРР. Такая конденсация, характерная для апоптоза, выражена значительно слабее в клетках НеЬа/ Ьс1-2. Дополнительно, для выявления апоптотических изменений, происходящих в гибнущих клетках, из них выделяли ДНК, которую затем анализировали электрофорезом в агарозном геле. В таких условиях детектируется ДНК, подвергающаяся фрагментации, характерной для апоптоза. Деградация ДНК на олигонуклеосомные фрагменты наблюдается в клетках, обработанных ЗМРР в случае линий НеЬа и, в меньшей степени НеЬа/Вс1-2.

Заключение. Наличие фрагментированной ДНК в образцах из клеточных культур, инкубированных с донором оксида азота ЗМРР подтверждает, что индуцированная им гибель клеток происходит путем апоптоза. Кроме того, защитное действие белка Вс1-2, направленое на подавление проявлений апоптоза дополняет данное утверждение. На основе полученных результатов делается вывод о перспективности выбранной модели для дальнейшего изучения молекулярных механизмов регуляции программы клеточной гибели под действием оксида азота.

УВЕЛИЧЕНИЕ ОПОСРЕДОВАННОГО НАТУРАЛЬНЫМИ КИЛЛЕРАМИ ЛИЗИСА КЛЕТОК К562 И РАЛ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ С ПОМОЩЬЮ ЛИПОФИЛЬНЫХ ГЛИКОКОНЪЮГАТОВ, НЕ СВЯЗАНО С ЭКСПРЕССИЕЙ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК-МИШЕНЕЙ

Хирова Е.В., Коваленко Е.И., Овчинникова Т.В., Хайдуков С.В., Сапожников А.М.

Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Введение. В распознавании натуральными киллерами (ЫК-клетками) клеток-мишеней участвуют углеводы клеточной поверхности мишеней. Наряду с этим, в настоящее время известно, что распознаваться ~ЫК-клетками и влиять на цитотоксичность могут также стресс-индуцируемые протеины, основными представителями которых являются белки тепло-

вого шока (БТШ). Нами ранее было выявлено позитивное влияние ряда сахаридов, содержащих общий структурный мотив

- трисахарид Ье\у1зХ, на опосредованную ЫК-клетками человека цитотоксичность в модели, включающей модификацию клеток-мишеней с помощью неогликолипидов, содержащих различные углеводные лиганды.

Цель работы. Изучение возможного вклада экспрессии на клеточной поверхности мишеней БТШ различных классов в увеличение цитотоксичности МК-клеток.

Материалы и методы. В работе были использованы полимерные липофильные неогликоконъюгаты, синтезированные в лаборатории химии углеводов Института биоорганической химии РАН. Для модификации использовали клетки линий К562 и Ла^, различные по чувствительности к действию натуральных киллеров. Встраивание гликоконъюгатов проводили при 37°С в течение 45 мин, с концентрацией гликоконъ-югатов от 50 до 100 мкг/мл. Количественную оценку экспрессии БТШ на клеточной поверхности проводили с помощью метода проточной цитофлуориметрии с использованием моноклональных антител к различным классам БТШ, а именно к БТШ90, БТШ70, БТШ60 и БТШ25, до и после встраивания.

Основные результаты. После подбора оптимальных условий для встраивания неогликоконъюгатов в клетки была произведена оценка влияния ряда сахаридов на цитотоксичность МК-клеток человека. Выявлены углеводы, оказывающие позитивное действие на активность натуральных киллеров. В то же время было изучено возможное влияние БТШ на увеличение цитотоксичности. Для этого были выбраны два гликоконъюгата: Ье\у1эХ, позитивно влияющий на активность МК-клеток, и ВОл, не увеличивающий цитотоксичность. Нами было показано, что после встраивания гликоконъюгатов в клетки-мишени экспрессия БТШ на клеточной поверхности не увеличивалась.

Заключение. Полученные результаты свидетельствуют о том, что данные условия встраивания гликоконъюгатов в клет-ки-мишени не вызывают изменения экспрессии БТШ на клеточной поверхности. Следовательно, поверхностные БТШ не вносят вклад в наблюдаемое увеличение ЫК-клеточной цитотоксичности. Таким образом, основная роль в этом процессе принадлежит углеводным лигандам.

Работа осуществляется при поддержке гранта РФФИ (01-04-48693).

РАЗЛИЧИЯ МЕЖДУ МОЛЕКУЛЯРНЫМИ МЕХАНИЗМАМИ ПРОВЕДЕНИЯ АПОПТОТИЧЕСКОГО СИГНАЛА, ИНДУЦИРУЕМОГО ОПУХОЛЕВЫМ ГАНГЛИОЗИДОМ СМ2 И ГАНГЛИОЗИДАМИ -НОРМАЛЬНЫМИ КОМПОНЕНТАМИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН.

Холоденко Р.В., Михалев И.И., Молотковский Юл.Г., Сапожников А.М., Молотковская И.М.

Институт биоорганической химии

им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Известно, что ганглиозиды принимают участие в разнообразных рецептор-опосредованных процессах, в том числе способных супрессировать цитотоксичность МК-клеток, ослабляя противоопухолевый иммунитет, участвуют в запуске апоптоза. Нами было показано, что ганглиозиды индуцируют развитие апоптоза клеток 1Ь-2-зависимой цитотоксической клеточной линии СТЬЬ-2.

Цель работы. Сравнить молекулярные механизмы проведения апоптотического сигнала, индуцируемого ганглиози-дами и TNF.

Материалы и методы. В качестве индукторов апоп-тоза использовали ганглиозиды. Для анализа механизма проведения сигнала на апопгоз применили ингибиторы основных каспаз и флуоресцентные субстраты протеаз, участвующих в этом процессе: каспазы 1 - Ac-YVAD-AFC, каспазы 3 - Ac-DEVD-AFC, каспазы 4 - Ac-LEVD-AFC, каспазы 8 - Ac-1ETD-AFC, каспазы 9 - Ac-LEHD-AFC. Оценку числа клеток, вступивших в апоптоз, проводили на цитофлуориметре EPICS ELITE (Coulter), окрашивая ДНК пропидийиодидом и FITC-меченым аннексином V. Кроме того, использовали “концевое мечение”, или “TUNEL” - метод, и электрофорез ДНК клеток. Активацию каспаз регистрировали по разгоранию флуоресценции AFC, измеряемой на спектрофлуориметре Hitachi-4000, в лизатах клеток тестируемой линии.

Результаты и обсуждение. Одновременное добавление к клеткам TNF или ганглиозидов GM1, СМЗ, GDla, GDlb, GD3, GTlb и основных ингибиторов каспаз приводило к полной или частичной отмене апоптоза. Эти результаты хорошо сопоставимы с наблюдаемым разгоранием флуоресценции меченых субстратов изучаемых каспаз, а также с появлением характерной “лесенки” при электрофорезе ДНК этих клеток. Резко отличным оказалось действие опухолевого ган-глиозида GM2. Хотя индукция клеток этим ганглиозидом и приводила к появлению FITC-аннексин V-позитивных клеток, электрофорез ДНК не выявил полос, характерных для ее фрагментации. Ингибиторы основных каспаз не восстановили пролиферацию клеток, супрессируемую под влиянием GM2. Мы не обнаружили также и разгорания флуоресценции при инкубации лизата активированных этим ганглиозидом клеток с мечеными субстратами. Для проверки пути, по которому GM2 приводит клетки к смерти, мы тестировали TdT-опосредованное dUTP одноцепочечное концевое мечение (использовали прямой метод TUNEL); регистрацию проводили на цитофлуориметре. Оказалось, что индукция клеток ганглиозидом GM2 приводит к достоверному увеличению числа разрывов на ДНК, что свидетельствует о запуске этим ганглиозидом апоптоза.

Заключение. Молекулярные механизмы проведения апоптотического сигнала, индуцируемые различными ганглиози-дами, отличаются.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 00-04-49381).

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ БИОХИМИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК И БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФАКТОРА КОРТИЗОЛ-РЕЗИСТЕНТНЫХ ТИМОЦИТОВ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ КЛЕТОК-ПРОДУЦЕНТОВ

Хромых Л.М., Анфалова Т.В., *Куликова Н.Л., * Абрамов В.М., Казанский Д.Б.

НИИ канцерогенеза Российского Онкологического Научного Центра РАМН,

Москва,

*Институт инженерной иммунологии РАО Биопрепарат,

Любучаны, Московская обл., Россия

Фактор кортизол-резистентных тимоцитов (ФКРТ) спонтанно продуцируется данными клетками. Биологическая активность

ФКРТ направлена на регуляцию гемо- и лимфопоэза в норме и па их восстановление при различных стрессовых состояниях. Введение изучаемого медиатора экспериментальным животным приводит к усилению миграции стволовых элементов из костного мозга на периферию и увеличению количества селезеночных эндоколоний после сублетального облучения мышей.

Было показано, что клетками-продуцентами ФКРТ являются двойные негативные (CD4 /8) кортизол-резистентные тимо-циты. Эта клеточная популяция составляет всего около 0,01 % от общей популяции клеток тимуса. В связи с этим поиск клеточной линии, способной выполнять роль продуцента изучаемого фактора, очень актуален. Одним из вероятных продуцентов ФКРТ может быть тимома EL-4, характеризующаяся кортизол-резистентностью и отсутствием корецепторов на ее поверхности.

Исследования биологической активности супернатанта EL-4 выявили его способность в 2-3 раза усиливать образование селезеночных эндоколоний, что может свидетельствовать о функциональном сходстве фактора, продуцируемого этой тимомой, с ФКРТ.

Анализ, сделанный при помощи RT-PCR показал, что клетки EL-4 не продуцируют известных цитокинов, отвечающих за миграцию клеток костного мозга - IL-2, 4, 7, а также колониестимулирующих факторов - CSF, GM-CSF и IL-3.

В процессе биохимических исследований был показан высокий уровень сходства хроматографических профилей супернатантов EL-4 и кортизол-резистентных тимоцитов. Анализ биологической активности отдельных фракций супернатанта EL-4 in vivo показал, что ее пик совпадает с фракцией, содержащей белок с молекулярной массой около 30 кД, что также согласуется с данными, полученными при изучении ФКРТ.

Таким образом, проведенные исследования позволяют предположить целесообразность дальнейшей работы по выделению ФКРТ из супернатанта, полученного при культивировании клеток EL-4.

ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ КОМПЛЕКСНЫХ И СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ В КУЛЬТУРЕ ТКАНИ

Чалисова Н.И., Хавинсон В.Х.

Санкт-Петербургский Институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН,

Санкт-Петербург, Россия

Цитомедины - природные пептидные биорегуляторы, поддерживающие структурный и функциональный гомеостаз тех клеточных популяций, которые продуцируют эти факторы. На их основе были недавно созданы синтетические пептиды - искусственно сконструированные аналоги цитомединов. Нами изучено влияние пептидов на клетки тканей различных органов. Синтетические пептиды кортаген, эпиталон, ливаген и вилон добавлялись в культуральную среду в концентрациях 2-20 нг/мл. Органотипические культуры фрагментов тканей коры, подкорковых структур головного мозга, печени и тимуса 3-недельных крыс развивались в течение 3 суток на коллагеновом покрытии в питательной среде, состоящей из 35% среды Игла, 35% раствора Хенкса, 25% фетальной сыворотки быка и 5% куриного эмбрионального экстракта. При фазово-контрастной микроскопии с помощью окуляр-микрометра определялся индекс площади (ИП), который рассчитывался в условных единицах как соотношение площади всего эксплантата, вместе с зоной выселяющихся клеток, к исходной площади эксплантата.

На эксплантаты коры крыс стимулирующим образом из всех исследованных пептидов действовал только кортаген, ИП повышался на 38±7%. При культивировании фрагментов подкорковых структур головного мозга стимуляцию роста вызывал только эпи-

талон, ИП повышался на 36±5%. При культивировании фрагментов печени, обнаружено, что в ткани печени только ливаген значительно стимулировал зону роста эксплантатов, ИП повышался на 24±3%. Вилон и культуре ткани вилочковой железы увеличивал развитие зоны роста на 25±5%. Полученные данные свидетельствуют о том, что синтетические пептиды обладают тканеспеци-фичностыо, т.к. каждый пептид был способен усиливать развитие эксплантатов тканей, соответствующих данному пептиду.

ВЛИЯНИЕ СИНТЕТИЧЕСКИХ АГОНИСТОВ РЕТИНОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ НА ИНДУЦИРОВАННУЮ TNFa ЭКСПРЕССИЮ VCAM-1 И ICAM-1 НА ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТКАХ ЛИНИИ EA.HY 926

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Шейкнн Ю.А., Хансон Г., Фрейдлин И.С., Сирсьо А.

Центр молекулярной медицины,

Каролинский институт,

Стокгольм, Швеция,

НИИ экспериментальной медицины РАМН,

СПбГМУ им. акад. И. П.Павлова,

С.-Петербург

Ретиноиды являются производными витамина А и регулируют многие жизненно важные функции и биологические процессы, включая воспалительный и иммунный ответы. Биологические эффекты рстиноидов опосредованы взаимодействием с ядерными рецепторами двух типов: RAR (retinoid acid receptor) и RXR (retinoid X receptor).

Целыо данного исследования было изучение влияния синтетических агонистов: RAR и RXR, а также алл-транс-ретино-евой кислоты (естественный RAR агонист) на индуцированную TNFa экспрессию VCAM-1 и1САМ-1 на эндотелиальных клетках линии EA.hy 926 с помощью проточной цитометрии.

Было обнаружено, что как предобработка синтетическим RAR - агонистом CD367 (106 М) в течение 18-24 часов до добавления TNFa (400 Ед/ мл), так и одновременная обработка клеток CD367 и TNFa в течение 18 часов увеличивают экспрессию ICAM-1 и в меньшей степени VCAM-1 по сравнению с эффектом одного TNFa. Алл-транс-ретиноевая кислота оказывает еще более выраженное костимулирующее действие на экспрессию адгезионных молекул. Предобработка, как и одновременная обработка синтетическим RXR-агонистом (SR11237) НУ6 М не оказывала влияния на уровень экспрессии изучаемых адгезионных молекул в присутствии TNFa. Ни RAR-, ни RXR - агонисты не оказывали влияния на уровень базальной экспрессии тех же адгезионных молекул. Указанные эффекты можно объяснить наличием участков связывания RAR в промоторных областях генов ICAM-1 и VCAM-1, однако такие участки до сих пор не обнаружены.

МОДУЛЯЦИЯ АДРЕНАЛИНОМ И ТЕОФИЛЛИНОМ IN VITRO ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ ЛЕЙКОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ КРЫС, ПОДВЕРГУТЫХ СТРЕССУ

Шилов Ю. И., Орлова Е.Г.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Ранее нами было показано, что блокада (3-адренорецепто-ров усиливает активацию функций фагоцитирующих клеток в условиях острого стресса [Ю.И. Шилов, Е.Г. Орлова, 1997; 2000]. В системе in vitro направленность эффекта адренерги-

ческих соединений на фагоцитоз прямо зависит от типа адре-норецепторов [Ю.И. Шилов с соавт., 1998].

Цель работы. Исследовать изменения направленности влияния адреналина и теофиллина на фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови крыс in vitro в экспериментальной модели острого стресса с блокадой (3-адре-норецепторов.

Материалы и методы. Эксперимент выполнен на кры-сах-самцах популяции Wistar массой 169,8±6,05 г. Животные 1 -й группы были подвергнуты острому 6-часовому иммоби-лизационному стрессу в сочетании с дозированной кровопо-терей (по 0,5 мл крови взято из сосудов хвоста до начала иммобилизации и спустя 30 минут, 1, 3, 6 часов, 1, 3, 5 и 7 суток). Крысы 2-й группы подвергались аналогичному воздействию в условиях блокады (3-адренорецепторов по схеме П.Д. Горизонтова с соавт. [1983]. Пропранолола гидрохлорид вводили подкожно двукратно в разовой дозе 5 мг/кг массы тела с интервалом 3 часа; первая инъекция - за 30 минут до начала иммобилизации. Фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови оценивали в микромодификации метода В.Н. Каплина с соавт. [1992, 1996]. Влияние адреналина (0,1 мкг/мл) и теофиллина (3 тМ) на фагоцитарную активность лейкоцитов оценивали в условиях 60-минутной преинкуба-ции in vitro у животных 1-й и 2-й группы до стрессорного воздействия, а также через 360 минут и 1 сутки от начала иммобилизации.

Контролем служили пробы с преинкубацией клеток крови в среде. Достоверность различий оценивали с помощью парного г-критерия Стьюдента и знакового Т-критерия Вил-коксона.

Основные результаты. В условиях стресса и блокады (3-адренорецепторов выявлено изменение направленности эффектов адреналина на фагоцитоз в системе in vitro. У интакт-ных животных адреналин активирует нейтрофильный и эозинофильный фагоцитоз и оказывает слабый угнетающий эффект на фагоцитарную активность моноцитов. Через 6 часов от начала эксперимента активирующий эффект адреналина на нейтрофильный и эозинофильный фагоцитоз исчезает. Через 24 часа регистрируется преимущественно ингибирующий эффект на нейтрофильный и моноцитарный фагоцитоз, что, возможно, объясняется повышением экспрессии при стрессе 3-адренорецепторов под действием глюкокортикоидов [Н.Н. Дыгало с соавт., 1998]. На фоне блокады (3-адренорецепторов при стрессе, адреналин, действуя через а-адренорецепторы, активирует моноцитарный и нейтрофильный фагоцитоз в системе in vitro. Известно, что эффекты стимуляции (3-адрено-рецепторов реализуются через повышение уровня внутриклеточного цАМФ [A.D. Strosberg, 1995]. У интактных животных теофиллин угнетает фагоцитарную активность нейтро-филов и моноцитов и оказывает слабое активирующее действие на эозинофильный фагоцитоз. Поскольку эффекты теофиллина на нейтрофильный и моноцитарный фагоцитоз имеют одинаковую направленность с (3-адренергическим агонистом тербуталином сульфатом [Ю.И. Шилов с соавт., 1998], можно полагать, что угнетение фагоцитоза связано с повышением уровня цАМФ. Активация эозинофильного фагоцитоза может опосредоваться действием теофиллина через аде-нозиновые рецепторы [И.С. Гущин, 1998]. На фоне стресса и блокады (3-адренорецепторов теофиллин угнетал фагоцитарную активность нейтрофилов и эозинофилов. Действие теофиллина на моноцитарный фагоцитоз варьировало, по-види-мому, в зависимости от исходного уровня цАМФ в клетке. Наибольший угнетающий эффект выявлен при высокой функциональной активности моноцитов, а при низкой теофиллин действия не оказывал. Поскольку уровень цАМФ и фагоци-

тарная активность находятся в обратной зависимости, можно предположить, что чувствительность моноцитов к теофилли-ну зависит от изменения уровня цАМФ в клетке. Угнетающий эффект адреналина на фагоцитарную активность, по-ви-димому, может опосредоваться через повышение внутриклеточного уровня цАМФ при стимуляции Р-адренорецепторов.

Заключение. Полученные результаты указывают на диаметрально противоположную направленность эффекта стимуляции разных типов адренорецепторов и вовлеченность цАМФ-зависимых сигнальных путей в реализацию иммуномодулирующего действия адренергических соединений в условиях стресса.

ИЗМЕНЕНИЯ ФУНКЦИЙ ФАГОЦИТИРУЮЩИХ КЛЕТОК БРЮШНОЙ ПОЛОСТИ В УСЛОВИЯХ АДРЕНАЛИНОВОГО СТРЕССА ПРИ БЛОКАДЕ АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ

Шилов Ю.И., Гилёва Н.А., Таскаев В.П.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН,

Пермь, Россия.

Пермский государственный университет,

Пермь, Россия

Цель работы. Анализ эффектов антагонистов а -, а,- и (3-адренорецепторов в условиях адреналинового стресса на показатели фагоцитарной активности и кислородозависимой бактерицидности фагоцитирующих клеток брюшной полости в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тест) у крыс-сам-цов популяции \Vistar.

Материалы и методы. Для экспериментального моделирования острого фармакологического стресса использовали введение высокой дозы адреналина (1 мг/кг массы тела подкожно). Крысам 1-й группы вводили только адреналин. Животные 2-й, 3-й и 4-й групп были подвергнуты аналогичному воздействию в условиях блокады различных типов адренергических рецепторов специфическими антагонистами, которые вводились подкожно за 1 час до инъекции адреналина с интервалом 3 часа двукратно. Для блокады Р-адренорецепто-ров вводили пропранолола гидрохлорид (по 5 мг/кг массы тела на инъекцию), для блокады а,-адренорецепторов - йохимби-на гидрохлорид (по 5 мг/кг), а а-адренорецепторов - празо-зина гидрохлорид (по 1 мг/кг). Животные 5-й группы служили контролем. Показатели кислородозависимой бактерицидности фагоцитирующих клеток перитонеального смыва оценивали в спектрофотометрическом варианте НСТ-теста с использованием опсонизированного зимозана. Фагоцитарную активность перитонеальных клеток определяли по отношению к формалинизированным эритроцитам барана. Статистический анализ результатов проведен с использованием непарного г-критерия Стьюдента и непараметрического рангового \¥-критерия Вилкоксона.

Основные результаты. На фоне адреналинового стресса отмечена активация суммарной фагоцитарной активности перитонеальных клеток в интегральном выражении (по числу объектов фагоцитоза в расчете на все фагоцитирующие клетки брюшной полости). Блокада а-адренорецепторов отменяла этот эффект, а Р-адренорецепторов - несколько усиливала. Выраженность эффекта блокады разных типов рецепторов зависела от типа фагоцитирующих клеток, что может указывать на различия их экспрессии в зависимости от типа клетки. Так, полная отмена увеличения фагоцитарной активности мононуклеарных фагоцитов в перитонеальной полости адреналином отмечена при бло-

каде а7-адренорецепторов, в то время как блокада Р-адреноре-цепторов не влияла на эффект адреналина. Повышение адреналином фагоцитарной активности перитонеальных нейтрофилов было более выраженным в условиях блокады Р-адренорецепто-ров и отменялось блокадой а,-адренорецепторов. Увеличение фагоцитарной активности тучных клеток адреналином выявлено только в условиях блокады Р-адренорецепторов. В условиях адреналинового стресса отмечено увеличение абсолютных показателей НСТ-теста с перитонеальными клетками, которое отменялось в условиях блокады а-адренорецепторов и усиливалось при блокаде Р-адренорецепторов. Отмечены выраженные изменения клеточного состава брюшной полости. При адреналиновом стрессе увеличивалось общее число ядросодержащих клеток, суммарное количество гранулоцитов и мононуклеарных фагоцитов, абсолютное число тучных клеток. В условиях блокады а-адренорецепторов эти сдвиги нивелировались, а на фоне блокады а,-адренорецепторов наблюдалось статистически значимое снижение абсолютного числа мононуклеарных фагоцитов и лимфоидных клеток. Последнее статистически достоверно снижалось и в условиях блокады а -адренорецепторов.

Заключение. Таким образом, направленность эффекта антагонистов адренорецепторов на бактерицидный потенциал и поглотительную активность фагоцитирующих клеток, их рециркуляцию и аккумуляцию в брюшной полости прямо зависит от типа рецептора. С учетом прямо противоположной направленности действия антагонистов по отношению к агонистам можно полагать, что через Р-адренорецепторы реализуются преимущественно угнетающие эффекты катехоламинов, а через а-адренорецепторы - стимулирующие. Выраженность этих эффектов зависит от типа фагоцитирующих клеток, что, вероятно, связано с различиями экспрессии соответствующих адренорецепторов и/или особенностей реализации регуляторных сигналов с них на внутриклеточном уровне.

ВЛИЯНИЕ ГИДРОКОРТИЗОНА НА ФУНКЦИИ ФАГОЦИТИРУЮЩИХ КЛЕТОК В УСЛОВИЯХ БЛОКАДЫ Р-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ

Шилов Ю.И., Ланин Д.В., Ширшев С.В.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН,

Пермь, Россия

Известно, что глюкокортикоидные гормоны модулируют экспрессию адренорецепторов на клетках-мишенях различных органов и оказывают пермиссивный эффект по отношению к катехоламинам.

Цель работы. Изучение влияния гидрокортизона на функции фагоцитирующих клеток периферической крови в условиях фармакологической блокады Р-адренорецепторов.

Материалы и методы. Эксперимент выполнен на половозрелых крысах-самцах популяции \Vistar. Животным 1-й группы вводили однократно внутрибрюшинно гидрокортизон в дозе 50 мг/кг. Крысам 2-й группы вводили гидрокортизон в той же дозе на фоне блокады Р-адренорецепторов пропранололом (4 инъекции по 5 мг/кг массы тела подкожно с интервалом 3 часа, 1 -я инъекция за 30 минут до введения гидрокортизона). Интактные животные

3-й группы служили контролем. Периферическую кровь получали из сосудов хвоста до начала введения гормона и пропранолола (показатели исходного фона, использовавшиеся в качестве контроля для всех исследований с кровью), а также через 6, 24, 48 часов после инъекции гидрокортизона. Через 48 часов от введения гормона оценивали показатели массы и клеточности органов лимфомиелоидного комплекса и клеточного состава брюшной полости (суспензию перитонеальных клеток получали промыва-

ниєм брюшной полосім средой 199 с добавлением 20 ЕД/мл гепарина, 10 мМ НЕРЕБ и 2 мМ і-глутамина). Кислородозависимую бактерицидності, фагоцитирующих клеток периферической крови и перитонельного смыва оценивали в спектрофотометрическом варианте НСТ-теста, фагоцитарную активность - по поглощению формалинизированных эритроцитов барана.

Основные результаты. Установлено, что при введении гидрокортизона развивались абсолютный нейтрофильный лейкоцитоз с увеличением молодых форм нейтрофнлов (палочкоядерных и юных), эозинопения и лимфопения, выраженные во все сроки исследования, а также снижение массы тимуса, лимфатических узлов и селезенки, числа мононуклеарпых фагоцитов и тучных клеток в брюшной полос ти. Несмотря на развитие нейт-рофильного лейкоцитоза, абсолютное число нейтрофилов в брюшной полости существенно нс изменялось. Гидрокортизон оказывал прямо противоположный эффект на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови и брюшной полости. Отмечено увеличение относительных и абсолютных показателей фагоцитарной активности нейтрофилов в периферической крови и депрессия нейтрофильного фагоцитоза в брюшной полости. Гидрокортизон не влиял на моноцитарный фагоцитоз при исследовании периферической крови, но значительно снижал относительные и абсолютные показатели поглотительной активности мононуклеарных фагоцитов брюшной полости. Выявлено снижение абсолютных (но не относительных) параметров фагоцитарной активности эозинофилов периферической крови и тучных клеток в брюшной полости. Суммарный бактерицидный потенциал фагоцитирующих клеток периферической крови по данным НСТ-теста снижался, при этом изолированное введение гормона не влияло на бактерицидный потенциал фагоцитирующих клеток перитонеальной полости. На фоне блокады Р-адренорецепторов эффекты гидрокортизона существенно модифицировались. Уменьшалась продолжительнос ть лимфопении (через 24 и 48 ч абсолютное число лимфоцитов нс отличалось от контроля), отменялось снижение массы селезенки, увеличивалась выраженность опустошения лимфатических узлов, наблюдалось развитие моноцитоза через 48 ч. При анализе клеточного состава брюшной полости установлено, что число тучных клеток не снижалось, а содержание нейтрофилов значительно уменьшалось. Помимо этого, при блокаде Р-адренорецепторов нивелировался депрессивный эффект гидрокортизона на бактерицидный потенциал клеток периферической крови в НСТ-тесте, абсолютные показатели НСТ-теста с клетками брюшной полости, напротив, снижались. В периферической крови и брюшной полости на фоне блокады Р-адренорецепторов отменялись эффекты гидрокортизона на нейтрофильный фагоцитоз.

Заключение. Таким образом, полученные результаты указывают на опосредованность эффектов глюкокортикоидов на функции фагоцитирующих клеток эндогенными катехоламинами через модуляцию экспрессии Р-адрснорецепторов и открывают новые перспективы для изучения взаимозависимости иммуномодулирующих эффектов катехоламинов и глюкокортикоидов.

ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ФАГОЦИТИРУЮЩИХ КЛЕТОК

Ширшев С.В., Бахметьев Б.А., Кеворков Н.Н., Куклина Е.М., Заморина С.А., Лихачева Н.С., Агафонова А.В.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН,

Пермь, Россия

Эндокринная система является одной из трех интегративных систем организма млекопитающих. В настоящее время

идентифицированы рецепторы для большинства гормонов на акцессорных и иммунокомпетентных клетках человека и животных. Все это предполагает тесную связь нейроэндокринной системы с иммунной в процессах контроля за генетическим постоянством индивидуума. Известно, что процессы утилизации антигена и его последующая презентация является основополагающим феноменом для реализации врожденного иммунитета и развития адаптивных иммунных реакций. В то же время, механизмы гормонального контроля за эффектами фагоцитов наименее проработаны в современной литературе.

Целью нашей работы явился анализ механизмов гормонального контроля за функцией фагоцитирующих клеток периферической крови человека в условиях in vitro и in vivo.

Изучены основные гормоны, принимающие участие в процессах роста, метаболизме и репродукции. Оценку функции лейкоцитов проводили, определяя фагоцитарную активность, кислородозависимую биоцидность и экспрессию таких молекул, как CD18 и CD14. Помимо этого, оценивали роль аденилатциклаз-ной системы, циклооксигеназы (ЦОГ) и Са2 -акцептирующих белков в фагоцит-модулирующем действии гормонов репродукции. Гормональное воздействие осуществлялось в системе in vitro с учетом пола и фаз менструального цикла доноров фагоцитов.

Установлено, что гормон роста (СТГ) усиливает фагоцитарную активность гранулоцитов и моноцитов периферической крови, повышая роль моноцитов в общем пуле фагоцитирующих лейкоцитов. Тироксин (Т4) достоверно увеличивает процент клеток, способных захватить максимальное количество объектов фагоцитоза (“активные фагоциты”). Хорионический гонадотропин (ХГ) оказывает наиболее выраженные селективные эффекты на пул фагоцитов. Так, гормон угнетает фагоцитарную активность фракционированных нейтрофилов, экспрессию CD 18, респираторный взрыв и продукцию N0. Данные эффекты зависят от уровня цАМФ и активности ЦОГ. В то же время половые стероидные гормоны оказывают дозозависимые стимулирующие эффекты на продукцию N0, которые интерферируют с действиями ХГ при их совместном культивировании, что приводит к активации поглотительной способности моноцитов и эозинофилов в фолликулярную фазу менструального цикла. На уровне моноцитов ХГ дозозависимо регулирует функциональную активность только женских клеток, угнетая процессы фагоцитоза моноцитов фолликулярной фазы и стимулируя функциональную активность моноцитов лютеиновой фазы менструального цикла. Молекулярные механизмы ХГ-зависимой модуляции связаны с селективным экранированием молекул CD 14, повышением уровня цАМФ, активностью Са2 -акцептирующих белков и ЦОГ.

Таким образом, установлена разнонаправленная гормональная регуляция фагоцитов периферической крови, механизмы которой аналогичны действующим на уровне классических органов-мишеней. Кроме того, установлен факт ре-ципрокного регулирования фагоцитарной активности гормонами гипофизарно-гонадной оси.

ЦИНК ИНГИБИРУЕТ УЛЬТРАФИОЛЕТ С - ЗАВИСИМОЕ УСКОРЕНИЕ АП0ПТ03А НЕЙТРОФИЛОВ ЧЕЛОВЕКА

Юринская М.М., Винокуров М.Г., Долгачева Н.Н., Гражданкин Е.Б., Косякова Н.И., Печатников В.А.

Институт биофизики клетки РАН, Институт фундаментальных проблем биологии РАН, г. Пущино, Россия

Цинк играет важную роль в иммунной системе: дефицит цинка увеличивает восприимчивость организма к различным патоге-

нам. Он необходим для нормального развития и функционирования клеток иммунной системы, ответственных за неспецифический иммунитет (нейтрофилов). Показано участие Zn2+ в процессах регуляции апоптоза некоторых клеток. В данной работе мы исследовали действие ацетата цинка на ультрафиолет С-индуци-рованный апоптоз культивируемых ш vitro нейтрофилов человека. Нейтрофилы выделяли из периферической крови здоровых доноров на 2-х слойном градиенте фиколл-верографина и облучали УФ-светом с длиной волны 254 нм на аппарате “Изольда” МФ-73М в фосфатном буфере pH 7,2. После облучения клетки культивировали в среде RPMI-1640 с 10% эмбриональной телячьей сывороткой (“Sigma”). Процент апоптотических клеток определяли методами проточной цитометрии (с использованием флуоресцентного зонда Hoechst-33258) и световой микроскопии. Процент живых клеток определяли методом проточной цитометрии.

Показано, что в широком интервале доз (0-160 Дж/м2) цинк ингибирует УФС-зависимое ускорение апоптоза нейтрофилов приблизительно в 2 раза (40 Дж/м2). При этом низкие концентрации Znu (0,2-1 мМ) практически не ингибируют спонтанный апоптоз нейтрофилов, в то время как высокие концентрации (5 мМ) ингибируют как спонтанный (на 50+1,9%), так и УФС-индуцированный апоптоз нейтрофилов (не менее, чем в 3 раза). Полученные результаты хорошо коррелируют с другими данными о том, что цинк модулирует апоптоз некоторых клеток посредством ингибирования 8-ой и 3-ей каспаз, участвующих в передаче апоптотического сигнала с Раэ-ре-цептора к ядру клетки.

Работа выполнена при финансовой поддержке фонда “Университеты России. Фундаментальные исследования”, грант № 991928.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.