Иммунорегуляция Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Медицинская Иммунология 2002, Т. 4, N<>2 О 2002, СПб РО РА АКИ

ИММУНОРЕГУЛЯЦИЯ

ПРИГЛАШЕНИЕ К НАУЧНОЙ ДИСКУССИИ

ХАРАКТЕР ИММУННОГО ОТВЕТА ОПРЕДЕЛЯЕТСЯ НА ЭТАПЕ ПРЕЗЕНТАЦИИ АНТИГЕНА

Как экзогенные, так и эндогенные антигены проходят сложный предварительный путь превращений, чтобы приобрести форму, доступную для распознавания предназначенными для этого специфическими рецепторами Т-лимфоцитов. Микроорганизмы, различные чужеродные частицы и молекулы, собственные инфицированные, трансформированные или отмирающие клетки организма прежде всего связываются менее разборчивыми, групповыми (т.н. “паттерн-распознающими”) рецепторами и оказываются внутри клеток, несущих такие рецепторы, за счет явления, получившего собирательное название “эндоцитоз”. Внутри клеток захваченные антигены подвергаются переработке, которая не ограничивается ферментативной деградацией, а включает обязательное комплекси-рование образовавшихся мелких фрагментов (например, пептидов) со значительно более крупными собственными молекулами главного комплекса гистосовместимости (МНС I и II классов). Только в случае формирования такого комплекса он транспортируется на мембрану клетки, где может быть распознан соответствующим по специфичности Т-клеточным рецептором. Однако и этого оказывается недостаточно для индукции полноценного иммунного ответа. Для того, чтобы распознавший антиген Т-лимфоцит ответил пролиферацией и дифференцировкой, он должен одновременно получить дополнительный сигнал активации, который обеспечивается взаимодействием попарно комплементарных так называемых костимулирующих молекул, присутствующих на поверхности взаимодействующих клеток. В качестве дополнительных сигналов активации Т-лимфоцитов срабатывают и цитокины, секре-тируемые клетками, активированными в момент захвата антигена. Активированный Т-лимфоцит не остается в долгу и обрушивает целый каскад цитокинов на связанную с ним клетку.

Таков самый грубый и приблизительный сценарий сложнейшего процесса, именуемого презентацией антигена. Ход этого процесса может быть нарушен и изменен на любом из перечисленных этапов. В деталях его остается до сих пор много не ясного, по многим вопросам мнения специалистов расходятся. В связи с этим мы решили иосвятить этой проблеме научную дискуссию с серией коротких докладов и возможностью обсудить ряд спорных вопросов.

1. Профессиональными ашпиген-презентирующими клетками принято считать только дендритные клетки, макрофаги и В-лимфоциты, однако способностью презешпировать антигены обладают и другие клетки, например, эпителиальные, эндотелиальные. Есть ли основания отводить им второстепенную роль?

2. Универсальными ашпиген-презентирующими клетками считаются дендритные клетки, но неоднозначность их происхождения, их гетерогенность, обилие субпопуляций, характерный жизненный цикл, невероятная пластичность их предшественников наводят на размышления о том, не является ли дендритная клетка одной из форм дифференцировки многих клеток при их включении в процесс презентации антигена.

3. Сравнительно недавно было показано, что в презентации липид-содержащих антигенов участвуют особые молекулы, обозначенные Сй1, в чем-то сходные с молекулами МНС1, но и отличающиеся от них. Как это отражается на эффективности и исходах презентации, во многом не ясно.

4. Особое место среди антиген-презентирующих клеток занимают В-лимфоциты, у которых есть их основная функция дифференцировки в антителопродуценты. Как уживаются эти две функции одной и той же клетки?

5. Один из самых животрепещущих вопросов связан с тем предположением, которое вынесено в заголовок этой заметки. Какие моменты и параметры процесса презентации определяют характер и, соответственно, эффективность иммунного ответа в каждом конкретном случае: при инфекции, аллергии, противоопухолевой защите, при аутоиммунных заболеваниях? Зависимость характера иммунного ответа (преобладание клеточного или гуморального ответа) от особенностей презентации антигена показана многократно с использованием самых современных экспериментальных подходов. Однако вопрос трудно считать решенным. Тем же дендритным клеткам приписывается способность "поляризовать ” иммунный ответ в сторону клеточного Т1г1 -зависимого. Но при уточнении деталей оказалось, что таким свойством обладают только зрелые дендритные клетки в отличие от незрелых, да еще при оптимальных количественных соотношениях с Т-лимфоцитами и при определенной длительности контакта, да еще при благоприятных условиях микроокружения, т.е. в присутствии конкретных цитокинов и хемокинов.

От решения этих вопросов зависит успех и дальнейшие достижения в развитии прикладных аспектов проблемы презентации антигенов: в разработке так называемых “дендритных вакцин” для противоопухолевой и противовирусной защиты.

ДОМИНАНТНЫЕ В КЛЕТОЧНЫЕ ЭПИТОПЫ ЯВЛЯЮТСЯ ХАРАКТЕРИСТИКОЙ БЕЛКА

Алексеева Л.Г.. Андронова Т.М., Свирщевская Е.В.

Институт биоорганической химии

им. М.М.Шемякина и Ю.В. Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Известно, что доминантные Т клеточные эпитопы белка зависят от структуры молекул ГКГС II класса, которые представляют данные пептиды Т клеткам. Следовательно, они зависят от генотипа мышей, которые отвечают на данный антиген. Поскольку ответ В клеток зависит от помощи Т клеток, то В клеточные эпитопы также могут зависеть от генотипа мышей. Для проверки данного предположения мышей линий BALB/c, СВА и С57В1/6 иммунизировали рекомбинантными белками из аллергена грибка Aspergillus fumigatus Asp f 2 или Asp f 3. Анализ В эпитопов проводили ИФА с использованием панели синтетических пептидов из каждого белка, перекрывающих 67 и 85% последовательности белков Asp f 2 и Asp f 3, соответственно. Всего было синтезировано 12 пептидов Asp f 2 и 11 пептидов Asp f3, выбранных в соответствии с компьютерным прогнозом. Было показано, что 4 пептида из Asp f 2 распознавались иммунными сыворотками мышей всех трех линий. Три дополнительных субдоминантных эпитопа распознавались сыворотками одной или двух линий мышей из трех изученных в различных сочетаниях. Аналогично, 2 пептида из Asp f 3 распознавались как доминантные В клеточные эпитопы белка Asp f 3 сыворотками всех исследованных линий мышей. Повторные иммунизации приводили к увеличению числа субдоминантных эпитопов, но не к смене доминирующих эпитопов. Таким образом, доминантные В клеточные эпитопы зависят от структуры белка и являются, по-види-мому, конформационными.

СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН МОНОЦИТОВ ПРИ РЕВМАТОДНОМ АРТРИТЕ

Арлеевская М.И.. Заботин А.И., Халиуллина Д.Г., Цибулькин А.П.

Государственная медицинская академия,

Институт биохимии и биофизики РАН,

Казань, Россия

Мононуклеарные фагоциты (МФ) являются важнейшим звеном в патогенезе ревматоидного артрита (РА). Мы показали, что для МФ при РА характерно активное экст-раклеточное переваривание путем выброса лизосомальных ферментов во внеклеточную среду на фоне замедленной интернализации объектов фагоцитоза. Эта особенность функционирования МФ, вероятно, приводит к массивному повреждению собственных тканей и является одним из

факторов патогенеза заболевания [Арлеевская М.И., Халиуллина Д.Г., Цибулькин А.П., 2002]. Замедленное поглощение, в свою очередь, может быть обусловлено либо особенностями клеточных мембран МФ, а именно, вязкостью их липидного бислоя, либо нарушением функционирования элементов цитоскелета. С помощью флюоресцентного зонда пирена (Sigma, USA) была исследована вязкость липидного бислоя клеточных мембран МФ у 10 больных РА (Б) в сравнении с их сверстниками - 10 здоровыми добровольцами (ЗЛ). МФ крови инкубировали в растворах с концентрацией пирена 10, 15. 30 и 60 мМ/л. Флуоресценция мономеров и эксимеров пирена измерялась при 370 нм и 460 нм соответственно (Лех^ЗЗбнм). Измерения проводили на флюориметре MPF - 44В (Perkin Elmer, USA). Затем высчитывался коэффициент эксимеризации (КЭ) как отношение флуоресценции эксимеров/мономеров. По мере нарастания концентрации пирена доля эксимсров монотонно увеличивалась в обеих группах. Однако у Б выход эксимеров при концентрациях пирена 15 и 30 мкМ был достоверно снижен по сравнению с показателями у их сверстников - ЗЛ (табл.1).

Как известно, КЭ пирена в клеточных мембранах определяется главным образом следующими факторами [Антонов, 1982]: во-первых, отношением белок/липиды; во-вторых, вязкостью липидного слоя, обусловленной концентрацией холестерина (ХС), качественным составом фосфолипидов (ФЛ), а также пропорцией ФЛ/ХС. Соотношение белок/липиды у Б (1,5) оказалось близким к таковому у ЗЛ (1,25). Содержание ОХ в мембранах МФ измеряли с помощью флюоресцентного зонда филипина (Fluka, Швейцария), образующего с ХС комплексы, которые при возбуждении светом с длиной волны Аех = 358 нм флюоресцируют в диапазоне Хет = 500-510 нм. Взвесь МФ инкубировали в растворе филипина в концентрации 2, 10, 20, 30, 40, 50 мкМ. Измерения проводили на флюориметре MPF - 44В в кварцевых микрокюветах. Достоверных различий в содержании ХС в мембранах МФ Б и их сверстников - ЗЛ не обнаружено. В то же время при концентрации филипина 50 мкМ в группе Б в отличие от ЗЛ интенсивность флюоресценции резко возрастала, что свидетельствовало о перегрузке мембран молекулами зонда, приводящей к их солюбилизации. Поскольку содержание ХС в клеточных мембранах МФ Б не отличалось от такового у ЗЛ, можно предположить, что устойчивость мембран при РА снижена по другим причинам. Это снижение может быть обусловлено составом ФЛ. Таким образом, у Б РА выявлены структурные особенности липидного бислоя клеточных мембран МФ, приводящие к повышению их вязкости. Эти изменения могут лежать в основе замедленной интернализации и преимущественно экстрацеллюляр-ного переваривания объектов фагоцитоза МФ.

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (грант №00-04-48224) и Фондом НИОКР АН Татарстана (грант №03-3.1 -82/2001).

Табл. 1. ЗАВИСИМОСТЬ КЭ ПИРЕНА В МЕМБРАНАХ МФ БОЛЬНЫХ РА И ЗЛ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ МЕТКИ В РАСТВОРЕ

Группы/ пирен, мкМ Возраст 10 15 30 60

ЗЛ 36,6±8,9 0,29±0,03 0,36±0,01 0,52+0,03 0,59±0,02

РА 40,3±5,9 0,21+0,01 0,30±0,02 0,42+0,03 0,60+0,03

ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КОРРИГИРУЮЩИХ ЭФФЕКТОВ ЭССЕНЦИАЛЬНЫХ ФОСФОЛИПИДОВ ПРИ ВИБРАЦИОННОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ТИМУСА

Боброва С.В.. Ефремов А.В., Вакулин Г.М.

Новосибирская государственная медицинская академия, Новосибирск, Россия

Производственные вибрации относятся к числу экстремальных факторов окружающей человека среды, а вибрационная патология занимает лидирующее положение среди отдельных нозологических форм хронических профессиональных заболеваний.

Методами световой и электронной микроскопии изучено состояние тимуса крыс-самцов линии Вистар. Животные по 12 особей в группе подвергались воздействию общей вертикальной вибрации (частотой 32 Гц при ускорении 50 м/с3) от вибростенда ВЭДС-100Б ежедневно в течение 30 сут. Контрольную группу составили интактные животные. С целью коррекции крысам вводили эссенциале Н („Ауепик”, Франция-Германия, зондовое введение) в дозировке 20 мг на 1 кг массы тела.

При исследованиии тимуса на фоне действия вибраци-онно - сгрессорного фактора выявлено усиление гибели Т-лимфоцитов корковой зоны тимуса за счет локальных разрывов их плазмалемм, увеличение фагоцитарной активности макрофагов уже после однократного действия вибрации. В корковом веществе, вне капиллярного русла, обнаруживались эозинофилы. На более поздних сроках эксперимента описанные изменения усиливались, выявлялись субклеточные признаки повреждения как тимоцитов, так и клеток эндотелия, эпителиального рстикулума, цитоархитектоники септ. Наблюдались дезинтегративные нарушения структуры крист митохондрий в эндотелиальных и эпителиальных клетках с появлением в матриксе органелл хлопьевидного осми-офильного материала.

На более поздних этапах экспериментального моделирования (спустя 30 сут) обнаруживалось значительное разво-локнение септ долей тимуса с нарушением непрерывности слоев соединительнотканных клеток, в сильно расширенных межклеточных промежутках которых часто выявлялись эозинофилы и плазматические клетки, численность которых в значительной мере возрастала и в коре тимуса. Признаки нарушения гемато-гимусного барьера коррелировали с изменениями капилляров септ.

По срокам эксперимента выявлялось выраженное укрупнение секреторных гранул в клетках ретикулярного эпителия наряду с нарушением, выраженным в разной степени, архитектоники цитоскелетных структур, указывающих на задержку вследствие этого выхода продуктов секреции, влияющих на функции их созревания и дифференцировки в известные подклассы Т-лимфоцитов, что предполагает нарушение этих функций экспериментально воспроизводимым фактором. В септах тимуса обнаруживались жировые клетки, популяция которых возрастала по мере увеличения продолжительности действия раздражающего этиологического фактора.

Протективное использование в ходе эксперимента эсссн-циальных фосфолипидов снижало субклеточные повреждения практически во всех клеточных составляющих тимуса. Наблюдалась сохранность ультраструктуры крист и матрикса митохондрий, гранулярной эндоплазматической сети как в эндотелиальных, так и в ретикуло - эпителиальных и стро-мальных клетках. Пиноцитозные пузырьки эндотелиальных клеток приобретали четкую очерчснность, содержимое визуализировалось электронносветлым. Выявлялось просвст-

ление секреторных гранул в ретикулярных эпителиальных клетках. С изменением свойств плазмалемм эпителиальных клеток под влиянием эссенциале, очевидно, связано и выраженное удлинение эпителиальных клеток, часто образующих отростки и псевдоподии.

Таким образом, проведенное экспериментальное исследование тимуса свидетельствует о сложной перестройке органов лимфатической, а также иммунной систем в ответ на воздействие вибрационного фактора. Сделан вывод, что вибрация является фактором дезинтеграции клеточной ауторегуляции. Результатами экспериментов доказана способность эссснциальных фосфолипидов к эффекту иммуномодуляции, опосредуемая гуморальными факторами, выделяемыми клетками лимфоидных органов.

ВЛИЯНИЕ КЛЕТОЧНЫХ ФАКТОРОВ НА ПЕРЕКЛЮЧЕНИЕ ИЗОТИПОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ МЫШИ

Борисова Т.К.. Сидорова Е.В.

Научно-исследовательский институт вирусных препаратов им.О.Г.Анджапаридзе, РАМН,

Москва, Россия

Экспрессия изотипов иммуноглобулинов (Ig), отличных от IgM, на клеточной мембране и секреция IgG, IgA или IgE свидетельствуют о том, что в ответ вовлечены В клетки памяти (Вп). Механизмы генерации Вп на белковые антигены, так называемые Т-зависимые антигены (ТЗ), достаточно хорошо изучены. Показано, что переключение изотипа Ig происходит на ранних стадиях образования В клеток памяти и требует контакта с Т клетками. В системах in vitro клеточный контакт В и Т клеток в ряде случаев может быть заменен цитокинами. Иммунный ответ на многие полисахариды (Т-иезависимые антигены 2-го типа, ТН2) in vivo характеризуется образованием IgM-антител и очень низкой продукцией антител других изотипов. Тем не менее, появление при ответе на ТН2 антигены антител не-IgM изотипа свидетельствует об участии в иммунном ответе Т клеток и их факторов, либо других клеток и цитокинов.

Целью данной работы было изучение роли клеточных популяций и факторов в переключении изотипа антител при иммунном ответе на ТН2 антигены (ДНФ-фиколл и ДНФ-декстран). Иммунный ответ индуцировали in vitro в культуре спленоцитов мышей СВА. О величине ответа судили, определяя число антителообразующих клеток (АОК) методом локального гемолиза в геле, изотип антител определяли с прмощыо ИФА. Для удаления из суспензии спленоцитов Т лимфоцитов применяли обработку клеток анти-ТН 1.2 антителами в присутствии комплемента морской свинки.

Изучено влияние кондиционированных сред (супернатант мышиной тимомы EL-4 и человеческой Т-Т гибридо-мы МР6) и рекомбинантных цитокинов (IL-2 человека, IL-

6 мыши и IFNy мыши) на иммунный ответ in vitro на ТН2 антигены. Показано, что добавление супернатантов EL-4 и МР6, а также IL-6 в культуру спленоцитов мышей повышает иммунный ответ на антигены и приводит к появлению IgG 1 анти-ДНФ антител. Присутствие в среде человеческого IL-2 не оказывало влияния ни на величину иммунного ответа, ни на изотип антител. В культуре спленоцитов, лишенных Т клеток (“В-спленоциты”) были получены аналогичные результаты, что может свидетельствовать об участии в переключении изотипа Ig Т-факторов. При добавлении в среду “коктейля” мышиных факторов (IL6+IFN-y+EL-4-супернатант) в ходе иммунного ответа наблюдалось переключение изотипа анти-ДНФ антител на IgG I, IgG2a и

^03. Эффект был обусловлен сочетанием рекомбинантных факторов с факторами, секретируемыми тимомой ЕЬ-4 (Ш-

4, 1Ь-5, 11_.-6, 1Ь-10, Тврр). Поскольку эти цитокины могут секрстировать не только Т клетки, но и макрофаги и В клетки (Ш-6, 1Ь-10, ТСР(3), тучные клетки (1Ь~4, 1Ь-5) и натуральные киллеры (^N7), полученные результаты свидетельствуют о том, что переключение изотипа ^ при ответе на ТН2 антигены может происходить под действием факторов, секретируемых нс только Т лимфоцитами, но и другими клетками.

УЧАСТИЕ ИНТЕРЛЕЙКИНА-6 В ПАТОГЕНЕЗЕ КОМБИНИРОВАННЫХ РАДИАЦИОННО-ТЕРМИЧЕСКИХ ПОРАЖЕНИЙ (КРТП)

Будагов Р.С., Ульянова Л.П.

Медицинский радиологический научный центр РАМН, г. Обнинск, Россия

Введение. Активация макрофагов в раннем посгожого-вом периоде, сопровождающаяся избыточным поступлением провоспалительных цитокинов в системный кровоток, играет важную роль в формировании иммуносупрессии и повышении чувствительности организма к инфекции, что может осложняться развитием сепсиса у ожоговых больных. В частности, большое значение в патогенезе сепсиса придают чрезмерному повышению концентрации сывороточного

11.-6, что предопределяет аутодеструктивный характер ци-токин - индуцированных острофазных реакций у пациентов с обширными термическими ожогами.

Цель и задачи. Работа посвящена исследованию вовлечения Ш-6 в патогенез ожоговой травмы, развивающейся в условиях КРТП (облучение + ожог). В экспериментах на лабораторных животных изучены изменения содержания 1Ь-6 в сыворотке крови мышей в первые 72 ч после ожога, облучения и КРТП. Дана оценка 30-суточной выживаемости мышей с КРТП под влиянием модификатора биологических реакций (МБР), известного своей способностью повышать синтез эндогенного 1Ь-6.

Материалы и методы. Опыты выполнены на мышах-самцах (СВА х С57ВЬ/6)Р] массой тела 22 - 24 г. Животных подвергали общему однократному гамма - облучению в дозе

7 Гр. (мощность дозы 0.45 Гр/мин). При моделировании КРТП глубокий термический ожог 10% общей площади поверхности тела наносили мышам непосредственно после облучения. Уровень IЬ-6 в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа с помощью наборов производства фирмы “Епс1о§еп” (США). В качестве МБР применяли синтетический аналог дикориномиколата трегалозы (САДТ)

- гликолипид клеточной стснки СогунеЬамепит (200 мкг/ мышь, внутрибрюшинно, через 1 ч после КРТП).

Основные результаты измерений концентрации 1Ь-6 (пг/мл) представлены в таблице.

1L-6 обнаруживается в повышенных концентрациях в образцах сыворотки у мышей с КРТП во все сроки наблюдения. Только облучение и только ожог вызывают краткосрочное и менее выраженное повышение уровня 1L-6 в системном кровотоке (через 3-6 ч).

Введение САДТ приводит к резкому подъему содержания 1L-6 в сыворотке крови мышей с КРТП на протяжении 3-х суток наблюдения. В этой группе зафиксировано снижение выживаемости по сравнению с группой КРТП + физ. раствор (контроль) на 20%.

Заключение. Повышение концентрации 1L-6 в системном кровотоке на протяжении первых трех суток после КРТП может играть роль патогенетического фактора отягощения исходов комбинированных поражений.

РАННИЙ И ОТСРОЧЕННЫЙ МЕТАБОЛИЧЕСКИЙ ОТВЕТ ЛИМФОЦИТОВ НА ИНКУБАЦИЮ IN VITRO

Булыгин Г.В., Сараи П.В.

Красноярская государственная медицинская академия, Красноярск, Россия

Введение. Любая биологическая система характеризуется периодичностью протекающих в ней процессов. Наиболее распространенными в природе и достаточно хорошо изученными в клетках являются околочасовыс ритмы и входящие в них 20-минутные (Бродский В.Я., 1988) Однако, известно, что ранние эффекты гормонов проявляются уже через 10 минут контакта с клеткой - в момент акматичсской фазы 20-минутного цикла. (Бродский В.Я., 2000; Зайчик А.Ш., Чури-лов Л.П., 2000). Таким образом, для оценки раннего метаболического ответа клетки желательно использовать воздействия в течение 10 минут, а для характеристики отсроченного ответа - 60 минут. Изменение активности дегидрогеназ лимфоцитов отражает как изменения в них количества субстратов, так и изменение числа молекул фермента. Сопоставление метаболических эффектов первой и последующих реакций лимфоцитов на внешние воздействия может дать информацию о состоянии биохимических процессов и их генетического аппарата.

Цель исследования: анализ ранних и поздних метаболических изменений в лимфоцитах здоровых допоров при инкубации в срсдс, не содержащей субстратов.

Материалы и методы. Обследованы 25 клинически здоровых лиц. Лимфоциты выделяли из периферической крови с антикоагулянтом (3% раствор ЭДТА) по A.Boyum (1974) на градиенте плотности фиколл-верографина (1,077 г/см’). Суспензию выделенных лимфоцитов инкубировали в физрастворе (1,0 мл) при 37°С в течение 10 и 60 минут. Биолю-минссцентным методом с бактериальной люциферазой (Савченко А.А., Сунцова Л.Н., 1989) определяли активность ок-сиредуктаз в лимфоцитах: глюкозо-6-фосфатдегидрогсназы (Г6ФДГ); гл ицеро л-3-фо с фа I дегидрогеназы (Г'ЗФДГ),

Группа 3 ч 6 ч 24 ч 48 ч 72 ч

КРТП Облучение Ожог Интактные мыши КРТП + САДТ 317 ± 76 69 ± 17 269 ± 82 1139 ± 159 337 ± 89 53 ± 11 174 + 35 Не определяется (ни; 3255 ± 372 61 + 6 Не определяется (ни Не определяется (ни «е предела чувствите 3130 ± 749 194 ± 17 же предела чувствит же предела чувствит ;льности метода) 789 + 248 111 ± 11 зльности метода) ельности метода) 187 ± 3

лакатдегидрогеназы (ЛДГ), НАД- и НАДФ-зависимых малат-дегидрогеназ (НАДМДГ и НАДФМДГ), глутаматдегидрогеназ (НАДГДГ, НАДФГДГ), изоцитратдегидрогеназ (НАДИЦДГ, НАДФИЦДГ). Достоверность различий результатов оценивали с помощью пакета статистических программ “Statistica for Windows'6.0” и использованием критерия Вилкоксона.

Основные результаты. Инкубация лимфоцитов без поступления субстратов извне уже через 10 минут приводит к снижению активности Г6ФДГ, подающей субстраты на пентозо-фос-фатный путь; это снижение сохраняется и через 1 час. Активность мапатдегидрогеназ в цикле Кребса также снижается, что свидетельствует как об уменьшении образования АТФ, так и роли “малик-фермента” в продукции пирувата для гликолиза. Активность НАДГДГ через 10 минут инкубации ниже, а через час инкубации - выше по сравнению с исходной. Механизмами, компенсирующими уменьшение объема субстратов для гликолиза и цикла Кребса, можно считать и повышение активности ГЗФДГ, характеризующей интенсивность отттока субстратов с обмена липидов на гликолиз, а также повышение НАДФГДГ, которая наряду с НАДГДГ отражает интенсивность поступления в цикл Кребса продуктов аминокислотного обмена. Через 10 минут инкубации активность НАДФИЦДГ не изменяется, но повышается активность НАДИЦДГ, что свидетельствует об усилении поступления изоцитрата в цикл Кребса из цитозоля. Спустя 60 минут инкубации показатели активности обоих ферментов снижаются, вероятно, в виду уменьшения внутримитохондриальных и цитозольных резервов изоцитрата. Нами не обнаружены изменения активности ЛДГ, что свидетельствует об относительной стабильности процесса использования лактата в гликолизе при описываемых условиях инкубации.

Заключение. Отсутствие поступления субстратов извне на фоне адаптационной реакции лимфоцитов, развивающейся в ответ на механические воздействия при выделении их из крови и перемещение из физиологически оптимальной среды в изотонический раствор NaCl, приводит к изменениям метаболических характеристик клеток, зависящим от сроков инкубации. Большинство из этих изменений связаны с уменьшением количества внутриклеточных субстратов и перераспределением их потоков по метаболическим путям клетки. В то же время показатели гликолиза лимфоцитов здоровых индивидуумов остаются стабильными, что, по-видимому, обусловлено “умеренной” силой раздражения для клеток. Необходимость интенсификации этого филогенетически наиболее древнего пути обмена возникает только при достаточно сильных воздействиях на клетку, способных включать резервные механизмы адаптации (Маянский А.Н., Ма-янский Д.Н., 1983). Полученные данные позволяют оценить неизвестные до настоящего времени механизмы раннего и отсроченного метаболического ответа лимфоцитов, развивающегося в результате приспособительной реакции на комплекс неспецифических воздействий.

ВЛИЯНИЕ СУПЕРНАТАНТА АЛЛОГЕННЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ ФИБРОБЛАСТОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛОВ IN VITRO

Бурда Ю.Е.. Нестеренко С.Н., Шевченко С.М., Леонова И.Ю., Кулабухов А.С., Шуклин В.Б., Гридасов Ю.А., Субботина Е.И.

Курская областная клиническая больница, Россия

В прошлых наших работах установлено, что аллогенные человеческие эмбриональные фибробласты (ЭФ) in vitro обладают способностью за счет продукции растворимых медиаторов подавлять продукцию TNF-a мононуклеарными клетками периферической крови здоровых доноров. Кроме

того, установлено потенцирующее влияние предварительной обработки ЭФ дексаметазоном в концентрациях от 10'4 до 10 й моль/л на указанную способность, а также выраженное противовоспалительное влияние супернатанта фармакологически модифицированных ЭФ (СЭФ(^) при местном применении у больных неспецифическим язвенным колитом (НЯК). Целыо настоящего исследования явилось изучение влияния супернатанта аллогенных эмбриональных фибробластов, как нативных, так и модифицированных дексаметазоном в дозе 10~4 моль/л, на функциональную активность нейтрофилов (НФ). В качестве источника ЭФ служили 7-12-недельные эмбрионы (абортусы). НФ получали из периферической крови здоровых доноров (контрольная группа) и больных НЯК (исследуемая группа), выделяя на градиенте фиколл-урографин с р= 1,114. Определяли адгезивную способность НФ, спонтанную и зимозан-индуцированную активность кислой фос-фатазы, миелопероксидазы и тест восстановления НСТ. При изучении адгезивной способности нейтрофилов у здоровых доноров получены следующие результаты (М±о, в %): контроль - 90,14± 10,27, СЭФ - 66,83±9,856 (р<0,001), СЭФ^ -65,25± 10,79 (р<0,001). В группе больных НЯК показатели адгезии составили; контроль - 92,62±7,611, СЭФ -60,93±9,169 (р<0,001), СЭФ_1сх - 62,39±7,633 (р<0,001). Спонтанная активность кислой фосфатазы НФ составила в группе здоровых доноров: контроль - 91,57±8,422, СЭФ -124,2±24,53 (р<0,01), СЭФ^ - 126,3±24,39 (р<0,01); в группе больных НЯК соответственно - 94,66±6,465, 63,54±29,13 (р<0,01), 59,96±24,12 (р<0,01). Зимозан-стимулированная активность кислой фосфатазы НФ в группе больных НЯК составила соответственно - 94,56±5,561, 96,6±26,18 и 103,3±22,42 (везде р>0,05). Спонтанная активность миелопероксидазы НФ составила в группе здоровых доноров: контроль - 92,32±7,413, СЭФ - 129,8±20,34 (р<0,01), СЭФ^ -144,8±45,18 (р<0,05); в группе больных НЯК соответственно - 96,07±3,539,68,88±24,95 (р<0,01), 63,71±22,57 (р<0,01). Зимозан-стимулированная активность миелопероксидазы в группе больных НЯК составила: контроль - 93,78±8,775, СЭФ - 84,43±15,9, СЭФ, - 83,25±16,4 (везде р>0,05). Пока-

ОС* 1

затели спонтанного НСТ-теста в группе здоровых доноров были следующими: контроль - 84,62±12,79, СЭФ -277,2±105,4 (р<0,01), СЭФ^- 256,1 ±75,49 (р<0,001); в группе больных НЯК соответственно - 96,05±6,194, 134,9± 19,64 (р<0,001), 148,6±21,09 (р<0,001). Показатели стимулированного НСТ-теста в группе больных НЯК - 94,47±7,094, 117,4± 17,91 (р<0,001) и ! 16± 15,7 (р<0,001).

Таким образом, СЭФ оказывал достоверное ингибирующее влияние на адгезивную способность НФ здоровых доноров и больных НЯК. В то же время, СЭФ разнонаправленно влиял на спонтанную активность кислой фосфатазы и миелопероксидазы у здоровых доноров и больных НЯК, стимулируя ее в контрольной группе и подавляя в исследуемой, при этом на зимозан-индуци-рованную активность указанных ферментов СЭФ влияния не оказывал в обеих группах. Указанная разнонаправленность действия может быть обусловлена различной исходной функциональной активность НФ у здоровых людей и больных НЯК в периоде обострения. В отношении спонтанного и стимулированного НСТ-тест СЭФ оказывал однонаправленное стимулирующее влияние и в контрольной группе, и у больных НЯК. Влияния фармакологической модификации ЭФ дексаметазоном на активность их супернатанта по сравнению с нативными ЭФ в указанных экспериментах выявить не удалось.

В статистической обработке результатов использовался однофакторный дисперсионный анализ и критерий Стьюден-та с поправкой Бонферони. Вычисления проводились с помощью программы “Биостат”.

ИММУНИЗАЦИЯ ЧИСТЫМ БЕЛКОМ НЕ ВЕДЕТ К ИНДУКЦИИ АЛЛЕРГИЧЕСКОГО ОТВЕТА И ПРОДУКЦИИ АНТИТЕЛ Е КЛАССА

Вискова Н.Ю.. Свиршевская Е.В.

Институт биоорганической химии

им.М.М.Шемякина и Ю.В.Овчинникова, РАН,

Москва, Россия.

Высокий уровень продукции антител Е класса часто ассоциируется с аллергическим иммунным ответом. Однако в экспериментах на животных продукция антиген специфичного

регистрируется редко. Целью данной работы был поиск схемы иммунизации мышей чистым белком, приводящей к высокому уровню продукции ^Е. Мышей линий ВАЬВ/с и С57В1/6 иммунизировали чистыми белками овальбумином (ОА) или лизоцимом из куриного яйца (НЕЬ). Иммунизацию проводили различными путями, без или с адъювантом, разными дозами, однократно или многократно. Продукцию антител, специфичных к антигену О и Е классов, а также продукцию общего 1§Е анализировали ИФА в динамике иммунного ответа. Было показано, что ни путь иммунизации (подкожный, п/к, интраназальный, и/н, внутрибрюшинный, в/б); ни наличие или отсутствие адъюванта (ПАФ, НАФ); ни доза антигена от сверх низких (20 нг на мышь в фосфатном буфере, 20 инъекций, в/б, общая доза 4 мкг на мышь) до сверх высоких (50 мкг на мышь, 40 инъекций, и/н, общая доза 2 мг на мышь); ни различие в генотипе мышей, ни тип и М\¥ антигенов не играли принципиальной роли в индукции антиген специфичного и общего 1£Е. Достоверное и логичное различие наблюдали по продукции который был тем выше, чем выше общая доза антигена. Продукцию ^Е наблюдали при всех схемах иммунизации примерно на одном уровне, соответствующем слабому иммунному ответу. Так, уровень при разведении сыворотки в 20 раз колебался от 0 до ОП =0.500, средние значения - ОП=0.070, а уровень общего 1§Ё менялся от нормального, 0п=0.300, до среднего, ОП=1.200, среднее значение ОП=0.500, при тех же разведениях. В противоположность этому, иммунизация неочищенным экстрактом аллергена из грибка АярегиШия /ипи§Ши5 приводила к высокой продукции общего ^Е (0п>2.500 при том же разведении), хотя специфичность этого была неизвестна. Таким образом, на основании полученных результатов был сделан вывод, что иммунизация чистым белком не приводит к индукции ^Е антител, тогда как распознавание одновременно множества белков приводит к аллергическому ответу. Причиной может быть высокий уровень продукции общим пулом Т лимфоцитов разной специфичности лимфокинов 1Ь-4,1Ь-5, 1Ь-13 при отсутствии адекватной когнатной помощи В клеткам, что и приводит к переключению В клеток на синтез ^Е.

РОЛЬ РАЗЛИЧНЫХ СУБПОПУЛЯЦИЙ В ЛИМФОЦИТОВ МЫШИ В ИММУННОМ ОТВЕТЕ НА Т-НЕЗАВИСИМЫЕ АНТИГЕНЫ 2-ГО ТИПА

Гаврилова М.В.. Чернышова И.Н., Сидорова Е.В.

ГУ научно-исследовательский институт вирусных препаратов РАМН, Москва, Россия

Введение антигена приводит не только к индукции синтеза антител (АТ) и появлению антителообразующих клеток (АОК), но и резко усиливает образование неспецифических иммуноглобулинов (НИГ) и повышает число образующих их клеток (НИГОК). Выяснение механизмов, ответственных за

образование индуцированных антигенами НИГ, и роли различных субпопуляций В-лимфоцитов в этих процессах является одной из задач фундаментальной иммунологии.

Известно, что различные субпопуляции В-лимфоцитов мыши отличаются по своим поверхностным маркерам, локализации в органах, способности к самообновлению и функционально активности. В 1977 г. было показано, что при ответе на Т-независимые антигены 2-го типа (ТН-2) за образование АТ отвечает субпопуляция В лимфоцитов, несущая поверхностный маркер Lyb5 (Ahmed et al., 1977). Позднее было установлено, что и за увеличение количества НИГОК в этом случае тоже отвечают зрелые Lyb5+ В клетки (Chernyshova et al., 1999). Известно, что у мутантных мышей CBA/N, не имеющих Lyb5 В клеток, иммунизация ТН-2 не индуцирует ни появления АОК, ни увеличения количества НИГОК. Однако, CBA/N мыши лишены также субпопуляции В лимфоцитов, экспрессирующих маркер Т хел-перов CD5, а в настоящее время предполагается, что именно CD5 В клетки отвечают на ТН-2. Не исключено, что субпопуляции Lyb5 и CD5 В клеток “перекрываются” (Smith et al., 1985). Настоящая работа предпринята с целью изучения роли CD5 В лимфоцитов в специфическом и неспецифическом иммунном ответе на ТН-2.

Были использованы 2 подхода. В 1-м из них определяли, как влияет удаление CD5 клеток на количества АОК и индуцированных антигеном НИГОК; во 2-м - спленоциты делили на субпопуляции В-1 и В-2 и исследовали образование АОК и НИГОК в каждой из них. Опыты проводили на мышах BALB/c и С57В1/6. В качестве ТН-2 использовали поли-винилпирролидон (ПВП). Мышей иммунизировали ПВП, на

З-й-4-й дни удаляли селезенки, готовили моноклеточные суспензии и определяли число АОК и иммуноглобулин - образующих клеток (ИГОК) с помощью клеточного иммунофер-ментного анализа. Число НИГОК расчитывали по разности между количествами ИГОК и АОК; прирост НИГОК, индуцированных ПВП, определяли по разности между количествами НИГОК в контроле и опыте. Для удаления CD5 клеток спленоциты обрабатывали анти-С05 сывороткой и комплементом. Разделение спленоци-тов на В-1 и В-2 субпопуляции проводили с помощью клеточного сортера (за разделение клеток приносим глубокую благодарность сотр. Стэн-фордского Университета Lu Li-Sheng и Brian Devlin).

В опытах на тотальных спленоцитах мышей BALB/c было показано, что введение ПВП увеличивает число АОК с 271 ±124 до 735± 134 и число ИГОК- с 2512±732 до 3561 ±460 на 106 спленоцитов, т.е. индуцирует как специфический, так и неспецифический иммунный ответ. Прирост АОК и НИГОК составлял 464±130 и 707±204 на 10fi клеток, соответственно. Обработка спленоцитов комплементом и антиС05 сывороткой снижала число АОК и НИГОК до 564±116/Ю6 и 2945±594/10<’ клеток, а прирост АОК и НИГОК- до 286± 87/10*’ и 467± 166/10*’ клеток, соответственно. Это указывает на то, что CD5 В лимфоциты участвуют не только в образовании АОК к ТН-2, но и в увеличении числа клеток, продуцирующих НИГ.

Экспрессия CD5 сама по себе не является доказательством принадлежности В клеток к субиопуляции В-1. Поэтому следующая серия опытов была проведена на В лимфоцитах, разделенных на В-1 и В-2 субпопуляции. Было показано, что основными продуцентами и АТ и индуцированных антигеном НИГОК являются В-1 клетки: число АОК и НИГОК в этой фракции превосходило количества АОК и НИГОК во фракции В-2 более, чем в 10 раз. Данные о роли В-1 клеток в образовании НИГ под действием ТН-2 получены впервые.

Как в опытах с тотальными епленоцитами, так и в опытах с В-1 клетками выявлен параллелизм между образованием АОК и индуцированных ТН-2 НИГОК. Это подтверждает результаты наших предыдущих исследований (см. Сидорова, 1997).

Полученные данные свидетельствуют о том, что ТН-2, не относящиеся к ауто-антигенам, способны индуцировать не только специфический, но и поликлональный иммунный ответ и о том, что основными продуцентами и АТ и НИГ в этом случае являются В-1 лимфоциты. Обсуждаются возможные механизмы, обеспечивающие параллелизм между образованием АТ и НИГ.

ВЛИЯНИЕ АДРЕНЕРГИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ И ТЕОФИЛЛИНА НА ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ IN VITRO ПРИ ПРОНИКАЮЩЕМ РАНЕНИИ ГЛАЗА

Гейн О.Н.. Шилов Ю.И., Черешнева М.В.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

В ранее опубликованных работах [Шилов Ю.И., Гейн С.В., 1998; 2001; Шилов Ю.И., Орлова Е.Г., 1998; 2000; Шилов Ю.И., Ланин Д.В., 2001], было показано участие адренергических механизмов в регуляции функций фагоцитирующих клеток при стрессе и в условиях введения глюко-кортикоидов. При сопряженных со стрессом состояниях, таких как травма, адренергические механизмы могут играть ключевую роль в изменениях функций иммунной системы. Однако этот аспект изучен недостаточно.

Цель работы - изучение влияния адренергических соединений и теофиллина in vitro на фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови в экспериментально-биологической модели проникающего ранения глаза.

Материалы и методы. Эксперимент проведен на половозрелых крысах-самцах популяции Wistar. Всем животным наносилось проникающее ранение правого глаза. Крысы были разделены на 4 группы: 1-я - без терапии; 2-я - со стандартной терапией, применяемой в клинике и включающей ампициллин, гентамицин, дексаметазон, диклофенак натрия;

3-я - со стандартной терапией в комбинации с полиоксидо-нием (0,1 мг/кг массы тела, 1 раз через день через 7 ч, на 2-й,

4-й, 6-й, 8-й день от момента нанесения травмы); 4-я - с введением только одного полиоксидония. Влияние адреналина (0,1 и 1 мкг/мл), (3-адренергического агониста тербуталина сульфата (106 М), модулятора цАМФ-зависимых сигнальных путей теофиллина (3 мМ) на фагоцитарную активность лейкоцитов оценивали в условиях 60-минутной преинкубации in vitro. Контролем служили пробы с преинкубацией клеток крови в среде. Статистический анализ результатов проводили с использованием парного и непарного (-критерия Стью-дента, знакового (-критерия Вилкоксона и матричного метода [Златев С.П., Димитров И.Д., 1991].

Основные результаты. До нанесения травмы адреналин (0,1 мкг/мл) оказывал угнетающий эффект на фагоцитарную активность нейтрофилов и практически не влиял на интег-рльные показатели моноцитарного и эозинофильного фагоцитоза. В концентрации 1 мкг/мл угнетающий эффект адреналина на нейтрофильный фагоцитоз усиливался, выявлена депрессия эозинофильного фагоцитоза. Сходное по направленности действие оказывали (3 - адренергический агонист тербуталина сульфат и теофиллин. Одинаковая направленность действия теофиллина и тербуталина сульфата позволяет считать, что угнетение фагоцитоза связано с повыше-

нием внутриклеточного цАМФ и стимуляцией Р - адреноре-цепторов. Через 180 мин после ранения эти эффекты всех препаратов значительно усиливались, что может быть связано с повышением экспрессии |3-адренергических рецепторов и/или трансдукции с них регуляторного сигнала при участии цАМФ-зависимых путей. Механизм наблюдаемых изменений может быть связан с увеличением стрессорной продукции гормонов, в частности, глюкокортикоидов. Через 1 сутки угнетающий эффект адреналина в концентрации 0,1 мкг/мл исчезал, но сохранялся в концентрации 1 мкг/мл. Депрессивное действие тербуталина и теофиллина в этот срок также значительно снижалось. Сходные изменения отмечены и у животных 2-й группы, получавших в составе комплексной терапии дексаметазон. У животных 3-й и 4-й групп, получавших полиоксидоний, депрессивное действие всех изучаемых соединений не только сохранялось, но и значительно усиливалось. Таким образом, полиоксидоний в условиях как изолированного введения, так и в составе комплексной терапии, включающей глюкокортикоиды, существенно изменяет чувствительность фагоцитирующих клеток к адренергической регуляции.

Заключение. Таким образом, при проникающем ранении глаза выявлены фазные изменения чувствительности фагоцитирующих клеток к адренергической регуляции, динамика которых существенно модифицируется в условиях включения полиоксидония в комплексную терапию.

ВЛИЯНИЯ БЛОКАДЫ §-, Ц-. к-ОПИАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ ПРИ СТРЕССЕ И ОПИОИДНЫХ ПЕПТИДОВ НА ЛОКАЛЬНЫЙ ИММУНЫИ ОТВЕТ

Гейн С.В.. Симоненко Т.А.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермский государственный университет, Пермь, Россия

Эндогенные опиоидные пептиды играют важную роль в нейроэндокринной регуляции функций иммунной системы. Цель работы - исследование влияния опиоидных пептидов DADLE и DAGO, а также стресса на фоне блокады опиатных рецепторов на показатели клеточноопосредованного, гуморального иммунитета в условиях развития локальной формы иммунного ответа.

Материалы и методы. Эксперимент по влиянию блокады опиатных рецепторов при стрессе проведен на 40 мышах

- самцах. Все животные были разбиты на 4 группы: 1-я -контрольная, 2-я - часовой ротационный стресс, 3-я - часовой ротационный стресс на фоне блокады р.-, 8-, К-опиат-ных рецепторов налоксоном, 4-я - введение одного налоксо-на. Влияние агонистов 8- и Ц-рецепторов оценено в эксперименте на 70-мышах-самцах. Животные были разделены на 7 групп: контрольная и 6 опытных. DADLE и DAGO вводили в концентрациях 10 6, 10'9, 10 |2М на животное. Через 1ч после экспериментального воздействия всех мышей иммунизировали эритроцитами барана под кожу правой стопы. На 5-е сутки эксперимента проводили оценку выраженности гуморального и клеточноопосредованного иммунитета.

Основные результаты. Установлено, что стресс приводил к увеличению числа антителообразующих клеток в правом лимфатическом узле у животных 2-й группы по сравнению с контрольными. В 3-й группе при стрессе на фоне блокады ц-, 8-, к-опиатных рецепторов наблюдалась отмена стимулирующего эффекта стресса на гуморальный иммунный ответ. Изолированное введение налоксона на количество АОК влияния не оказывало. На 5-е сутки эксперимента развива-

лась выраженная реакция гиперчувствительности замедленного типа. Стресс приводил к снижению выраженности иммунного воспаления в сравнении с контрольной группой по индексу размера, но не по индексу массы. В 3-й группе показатели выраженности ГЗТ не отличались от контрольной группы. Показатели 4-й группы статистически достоверно от контроля не отличались.

Стимуляция 5-рецепторов оказывала преимущественно активирующий эффект на выраженность ГЗТ и число АОК в регионарном ЛУ, а также усиливала миграцию клеток из селезенки на периферию. Стимулирующее действие DADLE проявлялось в высоких концентрациях (10 h М, 10'9М), в то время как в низких он угнетал ГЗТ. Активация (Х-рецепто-ров, напротив, приводила исключительно к депрессии выраженности, как клеточноопосредованных, так и гуморальных иммунных реакций и снижению содержания ЯСК в очаге иммунного воспаления.

Заключение. Таким образом, опиоидпые механизмы играют важную роль в развитии гуморального и клеточноопосредованного иммунного ответа при стрессе. Эффекты, реализуемые через 5- и ц-рецепторы преимущественно носят противоположный характер.

ИНГИБИРОВАНИЕ ПРОЛИФЕРАЦИИ АКТИВИРОВАННЫХ IN VIVO ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ФИБРИЛЛЯРНЫМ КОЛЛАГЕНОМ

Давыдова Н.В.. Козлов И.Г.*, Ссргиенко В.И., Горлина Н.К.*, Ларина Н.А.*, Чередеев А.Н.*

Институт физико-химической медицины М3 РФ, *Российский государственный медицинский университет,

Москва, Россия

Введение. В процессе рециркуляции клетки иммунной системы постоянно мигрируют через ткани и взаимодействуют с одним из основных компонентов экстраклеточного матрикса - коллагеном. Это взаимодействие осуществляется через экспрессию на их поверхности специфических рецепторов семейства интегринов. Сигнал, возникающий при соединении интегринов со своими лигандами (и, в частности, с коллагеном), комбинируясь с основным активационным сигналом с антиген-распознающих рецепторов, способен изменять направление активации иммунокомпетентных клеток. Ранее нами было показано, что необратимо активированные in vitro лимфоциты при контакте с нативными коллагеновыми фибриллами частично утрачивают способность к пролиферации. Учитывая, что условия стимуляции в культуре могут в некоторой степени отличаться от аналогичных условий в организме, в этой работе мы сравнили эффект фибриллярного коллагена на лимфоциты активированные in vivo и in vitro.

Материалы и методы. Трехмерный коллагеновый матрикс (КМ) формировали из коллагена I типа. Лимфоциты получали из паховых лимфоузлов или селезенок мышей линии СВА. При индукции пролиферации in vitro лимфоциты стимулировали в суспензии в течение различных промежутков времени конканавалином А (КонА). Предстимулированные клетки отмывали от митогена и помещали в КМ, содержащий ’Н-тимидин. По истечении 72 ч от начала стимуляции сравнивали включение метки в клетки, выделенные с помощью коллагеназы из КМ (опыт) с аналогичным показателем в суспензии (контроль). Активацию Т-лимфоцитов in vivo производили нанесением на кожу мышей 0,3% раствора ди-

нитрофторбензола (ДНФБ). Для изучения динамики пролиферативного ответа в условиях in vivo, клетки лимфоузлов выделяли через каждые 24 ч в течение 7 суток с момента стимуляции и оценивали как количество клеток в лимфоузлах, так и их пролиферацию. На стадии максимальной пролиферации ДНФБ-стимулированные лимфоциты выделяли и помещали в КМ на 24 ч. Постановку контролей и оценку пролиферации проводили по аналогии со спленоцитами.

Результаты. Культивирование в КМ вызывало сильное угнетение пролиферации КонА-стимулированных клеток. Опыты показали, что ингибиция пролиферации лимфоцитов зависела от времени их преинкубации с митогеном. При внесении клеток в матрикс одновременно с митогеном сразу после выделения или при преинкубации их в суспензии до 20 ч наблюдалась практически полная блокада пролиферации (3% от контроля). При переносе клеток в гель через 20-24 ч от начала активации пролиферация была также ингибирована и составляла 15-20% от контроля. Увеличение времени преинкубации с митогеном до 48 и 72 ч приводило к возрастанию пролиферации спленоцитов в КМ, соответственно, до 50-60 и 30-40% по сравнению с суспензионными культурами. Через 72 ч после начала активации in vivo (максимальный пролиферативный ответ лимфоцитов на ДНФБ), перемещение клеток лимфоузлов в КМ также приводило к инги-биции их пролиферативного ответа, тогда как в суспензии эти клетки сохраняли высокий уровень пролиферации. В большинстве опытов пролиферация таких лимфоцитов в матриксе не превышала 30% от суспензионного контроля.

Заключение. Таким образом, не только Т-лимфоциты, стимулированные КонА in vitro, но и клетки, активированные in vivo, отвечают значительным снижением пролиферации при взаимодействиии с основным компонентом экстраклеточного матрикса - коллагеном. Иначе говоря, ингибиция пролиферации лимфоцитов в КМ не зависит от способа их активации (in vitro или in vivo).

ВЛИЯНИЕ (х2-МАКРОГЛОБУЛИНА и ЦЕРУЛОПЛАЗМИНА НА ПРОЛИФЕРАЦИЮ ФИБРОБЛАСТОВ

Дорофейков В.В.. Полевщиков А.В., Медведский М.А., Захарова Е.Т., Шавловский М.М., Фрейдлин Т.С.

НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им.акад. И.П.Павлова, Санкт-Петербург, Россия

Целью данного исследования было изучение влияние а,-макроглобулина (МГ) и церулоплазмина (ЦП) на пролиферацию фибробластов человека и мыши.

В работе использовали две линии минимально трансформированных фибробластов (Фб) человека (линия L41) и мыши (линия L929). МГ и ЦП выделяли из сыворотки крови человека. F-формы МГ получали либо химической модификацией монометиламином. Принимая во внимание высокие сывороточные концентрации МГ, при работе с этим белком для оценки характера его влияния вместо эмбриональной сыворотки использовали синтетический заменитель сыворотки. Церулоплазмин в концентрации 500 мкг/ мл достоверно подавлял пролиферацию Фб линий L41 и L929 на 2-е сутки на 38% и 32% (р<0,001) соответственно, а на 3-и сутки - на 50% и 40% (р<0,001). Отмечается также достоверное подавление пролиферации Фб обеих линий на

3-и сутки при концентрации ЦП 50 мкг/мл. Напротив, при оценке пролиферации Фб в ответ на внесение МГ обнару-

жено усиление пролиферативной активности клеток обеих линий. Установлено, что 600 мкг/мл нативного МГ усиливали на 2-е сутки пролиферацию Фб линии Ь41 на 82% (р<0,001), а линии Ь929 - на 123%. На 3-и сутки также отмечено усиление пролиферации клеток линии Ь41 под действием нативного МГ на 53% (р<0,01), и линии Ь929 на 93% (р<0,001). Концентрация 300 мкг/мл той же формы белка обеспечивала усиление пролиферации клеток линий Ь41 и Ь929 на 2-е сутки на 50% и 46% (р<0,001) соответственно, а на 3-и сутки - на 58% и 57% (р<0,01 в обоих случаях). Трипсинизация МГ фактически не изменяла способности этого белка усиливать пролиферацию Фб. При оценке влияния на пролиферацию 300 мкг/мл трипсинизированного а2-МГ установлено, что на 2-е сутки пролиферация Фб линии Ь41 увеличилась на 39%, а линии Ь929- на 48% (в обоих случаях р<0,01). На 3-и сутки увеличение пролиферации составило соответственно 63% (р<0,05) и 52% (р<0,001). Влияние препарата МГ, обработанного метиламином, носило менее однозначный характер. В случае клеток человеческой линии Ь41 в концентрации 300 мкг/мл на 2-е сутки усиливал пролиферацию клеток линии Ь41 на 43% (р<0,001), в то время как нативная форма белка на этом сроке усиливала пролиферацию Ь41 на 82%. На 3-и сутки МГ, обработанный метиламином, усиливал пролиферацию Фб на 122%, в то время как нативная форма МГ в той же концентрации - только на 58%. В отношении клеток мышиной линии Ь929 влияние И-формы МГ на 2-е сутки носило недостоверный характер.

Т.о., полученные результаты доказывают участие МГ и ЦП в регуляции функций Фб в ходе острой фазы воспаления и косвенно свидетельствуют в пользу существования специфических рецепторов для этих белков на фибробластах использованных в работе клеточных линий.

ДЕЙСТВИЕ РИ-1Р (БЕТАЛЕЙКИНА) И PH-2 (РОНКОЛЕЙКИНА) НА ПРОЦЕССЫ РЕПАРАТИВНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ

Заболотных Н.В.. Виноградова Т.И.

ГУ “Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт фтизиопулъмонологии Минздрава России "

В предыдущих исследованиях нами показано влияние р1Ь-1Р (беталейкина) и р1Ь-2 (ронколейкина) на процессы пневмофиброзирования при туберкулезной инфекции у морских свинок. Под влиянием р1Ь зарегистрировано снижение распространенности избыточного фиброзирования и большая обратимость фибропластических реакций, что имеет значение в полноценном излечении туберкулеза. Целью настоящей работы является выяснение действия данных р!Ь на характер течения процессов репарации, играющих большую роль в процессах заживления тканевых дефектов, образование которых в ходе санации очагов специфического воспаления характерно для туберкулезного процесса. Репаративные процессы оценивались у интактных крыс на модели компенсаторной гипертрофии правого легкого после левосторонней пневмонэктомии (81 крыса) и по заживлению раны после удаления полнослойного лоскута кожи (57 крыс).

Основные результаты. Беталейкин при внутрибрю-шинном введении (100 нг/кг) ускорял репаративно-компен-саторный рост легочной ткани. При этом накопление сухой массы правого легкого до 100% массы легких интактных одновозрастных крыс при использовании беталейкина за-

фиксировано раньше (на 14-й день после операции), чем у прооперированных нелеченных животных (на 25-й день), и сопровождалось более выраженной клеточной инфильтрацией межальвеолярных перегородок. Выявлено также стимулирующее действие местного использования беталейкина (20нг в 0,1мл) на регенерацию кожной раны. Значимые различия у крыс опытной (оперированные с обработкой беталейкином) и контрольной (оперированные нелеченные) групп обнаружены на 5-й день после операции по проценту уменьшения площади раны (54,6±4,16% против 43,3±2,18%, Р<0,05) и срокам начала эпителизации. У ронколейкина значимого влияния на исследованные параметры не зарегистрировано.

Заключение. Ронколейкин и беталейкин не обладают ингибирующим действием на процессы репаративной регенерации. Беталейкин проявляет стимулирующий эффект на репарацию легочной ткани и заживление полнослойной кожной раны. Возможно, действие беталейкина на репаративные процессы обусловлено стимуляцией препаратом системы макрофагов, активно участвующих в процессах образования и резорбции соединительно-тканных волокон.

ВЛИЯНИЕ И-ос НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ФАГОЦИТОВ

Казаков А.А.. Анциферова М.А.

ГНЦ НИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург, Россия

Представитель цитокинов - интерлейкин-1 (1Ь-1) является одним из основных медиаторов защитных реакций организма. К семейству 1Ь-1 относятся 3 белка - 1Ь-1а, 1Ь-1Р и рецепторный антагонист 1Ь-1. Считается, что 1Ь-1а и 1Ь-1Р обладают сходными функциями в организме. В настоящее время существует достаточно много работ по изучению функций 1Ь-1Р, однако детального изучения свойств 1Ь-1а не проводилось.

Данная работа была проведена с целью охарактеризовать влияние местного введения 1Ь-1а на функциональную активность фагоцитов.

Материалы и методы. Эксперимент проводился на гибридных мышах. Рекомбинантный 1Ь-1а вводили внутрибрю-шинно в дозах 2, 20 и 200 нг на мышь. Контрольной группе животных вводили апирогенный физиологический раствор. На разных сроках после инъекции (1час, 3 часа, 7 часов, 1 сутки, 3 суток) у 4 мышей из каждой группы забирали периферическую кровь и перитонеальный экссудат для изучения цитологической картины и постановки реакции хемилюми-несценции (ХЛ). Показатель люминол-зависимой индуцированной зимозаном ХЛ отражает функциональную активность фагоцитов, связанную с фагоцитозом и продукцией активных форм кислорода.

Результаты. Цитологическое исследование мазков крови показало увеличение относительного количества нейтро-филов в периферической крови уже на первых сроках после внутрибрюшного введения 1Ь-1а. Максимальная нейтрофи-лия наблюдалась при введении 200 нг 1Ь-1сс на первый час после инъекции. Для дозы в 20 нг максимальное содержание нейтрофилов наблюдалось через 3 часа после введения. Достоверные различия по сравнению с контрольной группой для этих доз (Р<0,05) сохранялись и через 5 часов после инъекции. Для минимальной дозы (2нг) достоверные различия (Р<0,05) были получены только на 1 час после инъекции. На фоне увеличения относительного количества нейтрофилов, внутрибрюшное введение 1Ь-1а вызывало значительное

уменьшение абсолютного числа циркулирующих лейкоцитов в периферической крови.

Нами было показано, что XJ1 перитонеальных клеток, активированных зимозаном, достоверно увеличивалась через 3 часа, 7 часов и 1 сутки после введения IL-la в дозах 2 и 20 нг (р<0.05). Наблюдалась достоверная обратная дозовая зависимость. Максимальные значения для дозы 2 нг составляли 826±73.2 CPS (3 часа), для 20 нг - 320,5±57,8 CPS (1 сутки). При изучении ХЛ клеток периферической крови, активированных зимозаном, наблюдали обратный эффект. Наибольшие значения были получены для дозы в 200 нг (шах -3 часа; 88,9±7,6 CPS; контроль - 25,1 ±5,6). Доза в 2 нг не давала достоверных отличий по сравнению с контролем. Такой двусторонний эффект можно объяснить тем, что применение высоких доз (20,200 нг) IL-la на местном уровне приводит к десенситизации клеток перитонеального лаважа. Напротив, для изменений интенсивности неспецифических реакций на системном уровне (периферическая кровь) необходимы более высокие дозы этого цитокина.

Заключение. В результате проведенной работы нами было показано, что IL-la как и IL-ip, является активатором функциональной активности фагоцитов как на местном, так и на системном уровне. Для того, чтобы понять относительный вклад этих членов семейства 1L-I в развитие защитных реакций необходимы дополнительные более детальные исследования.

РОЛЬ АПОПТОЗА В МЕХАНИЗМАХ ИНВОЛЮЦИИ ТИМУСА ПРИ ОПУХОЛЕВОМ РОСТЕ

Киселева Е.П.1. Огурцов Р.П. \ Суворов А.Н. Габрилович Д.И2.

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, £анкт-Перербург, Россия,

Раковый Центр имени Ли Моффитта,

Университет Южной Флориды,

Тампа, США

Рост многих опухолей человека и животных сопровождается развитием инволюции тимуса, механизмы которой неясны. Вместе с тем, состояние тимуса имеет большое значение для проведения лечебных мероприятий у онкологических больных. В наших предыдущих исследованиях было показано, что усиление апоптоза тимоцитов и внутритимус-ной их гибели имеет значение как один из возможных механизмов инволюции тимуса (Киселева и др., 1998). Целью настоящей работы было проведение анализа показателей спонтанного апоптоза тимоцитов in vitro в динамике роста опухоли и их сопоставление с эндогенным уровнем содержания ряда факторов, которые мы рассматривали в качестве потенциальных индукторов апоптоза тимоцитов в организме опухоленосителей. Опыты проводились на мышах линии СЗНА, которым п/к инокулировали 105 клеток сингенной перевиваемой гепатомы 22а. Апоптоз тимоцитов исследовали морфологически путем подсчета клеток, окрашенных с помощью акридинового оранжевого/этидиум бромида, а также по фрагментации ДНК, выявляемой в дифениламиновом тесте (ДФА) или на электрофорезе. В сыворотке крови определяли уровень ангиогенных (TNF-a) и гормонально-метаболических факторов (кортикостерон, лактат, холестерин), известных своей способностью индуцировать апоптоз тимоцитов in vitro. Кроме того, изучали влияние ангиогенного фактора VEGF на индукцию апоптоза в тимоцитах интактных мышей in vitro и in vivo.

Было показано, что уровень содержания кортикостерона и лактата не коррелирует с показателями апоптоза тимоцитов, усиливающегося в динамике роста гепатомы 22а. ТИР-а в сыворотке крови опухоленосителей не определялся. Ги-перхолестеринемия развивалась у мышей параллельно с усилением апоптоза, и была выявлена высокая степень корреляции между показателями содержания общего холестерина и ДФА-теста. Возможно, что гиперхолестеринемия оказывает влияние на апоптоз тимоцитов на поздних сроках развития опухоли, но не является фактором, вызывающим инволюцию тимуса. Мы предположили, что таким фактором может быть УБвР.

Установлено, что инкубация тимоцитов интактных мышей ВАЕВ/с в присутствии 50 и 100 нМ УЕвР вызывает достоверное усиление апоптоза тимоцитов, выявляемое в тестах с окрашиванием клеток меченым Аннексином V или пропидиум иодидом, учет которых проводили на проточном цигофлуориметре. Введение УЕвР интактным мышам в концентрации 50 и 100 нг/ч в течении 7 сут с помощью осмотических капсул также вызывало усиление апотоза тимоцитов, а более длительное введение в течение 21-28 сут приводило к развитию инволюции тимуса. Мы предполагаем, что УЕвР играет важную роль в нарушении процессов апоптоза и диф-ференцировки тимоцитов при опухолевом росте и участвует в механизмах развития инволюции вилочковой железы.

Работа поддержана грантами ИАТО 5А^5Т.СХО 975197) и РФФИ № 00-04-49430.

ДИСКУССИОННЫЕ АСПЕКТЫ ЭВОЛЮЦИОННОЙ ИММУНОЛОГИИ

Климович В.Б.

Центральный научно-исследовательский рентгено-радиологический институт Минздрава РФ, Санкт-Петербург, Россия

Одна из основных задач эволюционной иммунологии состоит в разработке представлений об эволюции системы адаптивного иммунитета, возникшей у позвоночных животных в дополнение к унаследованной от беспозвоночных системе иммунитета врожденного. Наиболее существенные различия между названными системами сводятся к следующему.

Факторы врожденного иммунитета распознают “не-свое”, продуцируются конститутивно, структура рецепторов консервативна, их разнообразие ограничено, а репертуар специфичностей определяется видовой принадлежностью и неизменен на протяжении жизни каждой особи. Контакт факторов врожденного иммунитета с чужеродным агентом не формирует памяти.

Факторы адаптивного иммунитета обеспечивают распознавание не только “не-своего”, но и “своего”. Структура рецепторов определяется стохастически в процессе рекомбинаций генов зародышевой линии, разнообразие их чрезвычайно велико, а репертуар изменяется в течение индивидуальной жизни. Рецепторы для антигенов распределены на клетках клонально, распознавание антигена осуществляется тремя видами клеток с помощью рецепторов трех разных типов, аффинитет рецепторов при повторном контакте с антигеном увеличивается на 3-6 порядков за счет процесса гипермутирования, при дифференцировке Т- и В-лимфоцитов действуют механизмы селекции, контакт с антигеном ведет к формированию иммунологической памяти.

Общепринятая точка зрения, состоит в том, что система адаптивного иммунитета возникла и эволюционировала как

средство защиты организма от патогенов. Однако, у низших позвоночных (у рыб, амфибий) эффективность иммунной защиты невысока: сроки развития иммунного ответа исчисляются неделями, антитела обладают низким аффинитетом и продуцируются в низких титрах. Численность видов в этих таксонах поддерживается обилием половых продуктов, а в защите от патогенов доминируют факторы врожденного иммунитета. Наибольшей эффективности система адаптивного иммунитета достигает у теплокровных животных. В этом случае защита от патогенов увеличивает жизнеспособность каждой особи и может быть фактором поддержания численности вида.

Могла ли малоэффективная система адаптивного иммунитета низших позвоночных быть объектом позитивного отбора? Какие преимущества в отборе получали виды, обладающие этой системой? Поиск ответов заставляет обратить внимание на два аспекта проблемы.

Первый состоит в том, что система адаптивного иммунитета формировалась в условиях контакта не только с патогенами, но и на фоне сосуществования с генетически чужеродными организмами, т.е. в условиях симбиоза, который сам по себе является фактором эволюции и дает организму не меньшие преимущества в отборе, чем защита от патогенов. Стабильность и высокая избирательность видовых сочетаний симбионтов может указывать на наличие элементов взаимного распознавания.

Второй аспект состоит в том, что многие проявления активности системы адаптивного иммунитета не являются защитными. К ним относится способность организма к поддержанию толерантности в отношении собственных тканей, нео-твечаемость на компоненты пищи и бактериальной флоры, на аллоантигены при беременности и при химеризме. Таким образом, иммунная система наряду с протективной обладает и второй функцией, которую следовало бы назвать акцептив-ной. Вопрос об эволюционном родстве и иерархии этих двух функций до настоящего времени не обсуждался. Ряд известных данных, в частности опережающее становление толерантности в онтогенезе, позволяет предполагать, что первично была сформирована и эволюционировала функция акцептив-ная. Протективная же развилась позднее и эволюционировала как реализация возможностей, заложенных в первой из них.

Если принять изложенную точку зрения, иммунитет следует определить как механизм поддержания постоянства внутренней среды путем ограничения экспансии генетически чужеродного материала или путем установления с ним симбиотических отношений.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты 00-04-49516 и 02-04-49120).

ИНДУКЦИЯ ЭКСПРЕССИИ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 НА ПОВЕРХНОСТИ КЛЕТОК К562 ПОД ДЕЙСТВИЕМ МОНЕНСИНА

Коваленко Е.И., Власкин П.А., Гусарова Г.А., Тарасенко Т.Н.. Сапожников А.М.

Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчиннникова РАН,

Москва, Россия

Белки теплового шока (БТШ) выполняют важные про-тективные функции для поддержания жизнеспособности клеток, растущих в как оптимальных, так и в менее благоприятных условиях. Локализация БТШ не ограничивается лишь внутриклеточным пространством. Они могут также присутствовать на поверхности опухолевых, вирус-инфици-

рованных и стрессированных клеток. Функция ассоциированных с плазматической мембраной БТШ не ясна. Предполагается, что они могут играть роль маркеров поврежденных клеток, опознаваемых иммунной системой. В задачу данной работы входило создание модели, включающей индукцию экспрессии БТШ на клеточной поверхности, для последующего изучения роли БТШ в опосредуемой натуральными киллерами цитотоксичности.

Ранее нами было показано, что инкубация клеток мышин-ной Т-лимфомы EL4, спонтанно экспрессирующих на своей поверхности БТШ, в присутствии ингибиторов клеточной секреции моненсина и брефелдина А приводит к дополнительному появлению на поверхности клеток БТШ70. В данной работе обработке моненсином были подвергнуты потенциальные мишени натуральных киллеров клетки эритролейкемии человека К562 и Т-лимфоциторной линии человека Jurkat. Экспрессию БТШ70 на клеточной поверхности определяли с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Часть клеточной популяции К562, в отличие от клеток Jurkat, спонтанно экспрессировала поверхностные БТШ70. Инкубация клеток К562 в присутствии низких доз моненсина (0.03-

0.1 мкг/мл) в течение 6-18 часов приводила к общему увеличению уровня поверхностной экспрессии БТШ70 (в 5 и более раз) и, в частности, к индукции экспрессии БТШ70 на поверхности клеток, ранее не экспрессирующих эти белки. При этом обработка клеток моненсином в использованных концентрациях не приводила к изменению клеточной морфологии и жизнеспособности. В то же время, инкубация клеток линии Jurkat в присутствии моненсина на протяжении 2-24 часов не сопровождалась транслокацией БТШ70 на клеточную поверхность.

Таким образом, для клеток линии К562 нами определены условия для увеличения уровня экспрессии БТШ70 на клеточной поверхности. Механизмы опосредованной моненсином транслокации БТШ70 на поверхность клеток К562 и EL4 требуют дальнейшего изучения.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 01-04-48693).

КОМПЛЕКСНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЭКЗОГЕННОГО ТИРОКСИНА НА ИММУННЫЕ РЕАКЦИИ

Бахметьев Б.А., Ширшев С.В.. Красных М.С.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Известно, что тироксин (Т ) обладает иммуномодулирующим эффектом на реакции врожденного и приобретенного иммунитета. Учитывая эти факты и тесную взаимосвязь вышеупомянутых видов иммунитета, актуальным является комплексная оценка иммунных реакций на фоне введения тироксина.

Цель работы - оценить влияния различных доз тироксина на фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови, на формирование антителообразующих клеток селезенки (АОК) и на реакцию гиперчувствительность замедленного типа (РГЗТ).

Материалы и методы. Эксперимент проведен на 77 мы-шах-самцах породы Swiss массой 20-22 г. Инъекции тироксина проводили в течение 10 дней в дозах 4 мкг/кг или 4000 мкг/ кг. На 5-е сутки введения Т4 животных внутрибрюшинно иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ). На 9-е сутки от начала эксперимента в стопу мыши вводили разрешающую дозу антигена. Влияние гормона на иммунный ответ оценивали по числу АОК (IgM-продуценты) в селезенке (методом

локального гемолиза в геле) и по степени утолщения стопы подопытной мыши (РГЗТ). Кроме этого, у иммунизированных животных одновременно регистрировали фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови, клеток селезенки и перитонеальной полости. В качестве объектов фагоцитоза использовали формализированные ЭБ.

Основные результаты. При введении Т4 в дозе 4 мкг/кг установлено снижение процента ядросодержащих клеток в крови и перитонеальной полости, но не в селезенке. Несмотря на то, что, численность нейтрофильных лейкоцитов в крови этих животных повышалась, значимых изменений их фагоцитарной активности не выявлено. Введение низкой дозы Т4 на фоне повторной иммунизации Т-зависимым антигеном сопровождалось снижением формирования АОК в селезенке мышей и фиксировалась тенденцией к повышению РГЗТ. Т4 в дозе 4000 мкг/кг оказывает выраженное угнетающее действие на общую фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови. Такое действие высокой дозы гормона не ассоциировано с падением численности фагоцитов в крови, где напротив, наблюдается повышение относительного количества сегментоядерных нейтрофилов. Одновременно, при введении высокой дозы Т4 снижается концентрация лимфоцитов в крови, а также ядросодержащих клеток в перитонеальной полости. Уровень иммунных реакций в данной группе животных по сравнению с контролем достоверно не изменялся.

Заключение. Таким образом, тироксин оказывает влияние как на реакции врожденного, так и приобретенного иммунитета. В зависимости от дозы, гормон по-разному изменяет фагоцитарную активность и перераспределение клеточных элементов в исследованных компартментах иммунной системы. Ингибирующее действие гормона на формирование антителобразующих клеток селезенки можно объяснить миграцией этих клеток в костный мозг, или их дифференци-ровкой в -продуценты.

ГЛЮКОКОРТИКОИДНЫЕ ГОРМОНЫ КАК МОДУЛЯТОРЫ АНГИОГЕННОЙ АКТИВНОСТИ МАКРОФАГОВ

Крылов А.В.. Киселева Е.П, Людыно В.И., Зубарева О.Е.

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН,

Санкт- Петербург, Россия

Большое внимание как зарубежных, так и отечественных исследователей уделяется вопросам регуляции ангиогенеза. Макрофаги являются основными участниками данного процесса при ишемических заболеваниях, ранозаживлении, воспалении, опухолевом росте и др. Несмотря на то, что значительное количество работ посвящено иммунорегуляторной роли глюкокортикоидов, лишь единичные исследования посвящены изучению способности этих гормонов влиять на ангиогенные свойства макрофагов. Вместе с тем известно, что гормоны коры надпочечников способны усиливать рано-заживление, а так же стимулировать пролиферацию фиброб-ластов и эндотелиальных клеток.

Целью настоящего исследования послужило изучение влияния физиологических доз дексаметазона на функциональную активность перитонеальных мышиных макрофагов и экспрессию ими мРНК УЕСР, как проангиогенного фактора, и мРНК тромбоспондина-1 (Т5Р-1), обладающего анти-ангиогенной активностью. Перитониальные макрофаги получали промыванием брюшной полости животных средой

ЯРМ1 1640, содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки. Инкубация клеток с исследуемым медиатором проводилась 4 и 24 часа при 37°С. Продукцию нитроксид анионов определяли по содержанию И02 в супернатантах с помощью реактива Грисса; продукцию супероксид анионов в НСТ-те-сте; пиноцитоз - по поглощению красителя нейтрального красного; активность 5’-нуклеотидазы биохимическим методом по образованию неорганического фосфата. Уровень экспрессии мРНК УЕСР и Т5Р-1 оценивали методом ОТ-ПЦР со специфическими праймерами.

Полученные результаты выявили следующие эффекты: дексаметазон снижал спонтанную и индуцированную липо-полисахаридом продукцию нитроксид анионов, а так же активность 5’-нуклеотидазы. В то же время препарат не оказывал влияния на продукцию макрофагами супероксид анионов, но стимулировал пиноцитоз при 24-часовой инкубации. Дексаметазон ингибировал экспрессию мРНК УЕйР в концентрациях 10 и 100 нм/мл на 4 и 24 часа и не оказывал влияния на уровень экспрессии мРНК ТБР-Г

Способность дексаметазона подавлять экспрессию мРНК УЕвР в макрофагах показана нами впервые. Этот эффект наблюдался уже через четыре часа после добавления препарата, что согласуется с данными литературы о раннем (2 часа) противовоспалительном эффекте глюкокортикоидов, осуществляющемся через ингибицию посттранскрипционного фактора ЫР-кВ (БИештап е1.а1., 1995). Полученные нами данные

о подавлении продукции нитроксид анионов, являющихся регуляторами ангиогенеза, подтверждают данные литературы о подавлении гена N0 синтазы. Вместе с тем имеются данные о том, что добавление дексаметазона повышает экспрессию мРНК ряда ангиогенных факторов в моноцитах крови человека и усиливает ангиогенную активность их супернатантов(Кос1е1]а е1.а1., 1997).

Поскольку новообразование сосудов в организме является строго ограниченным процессом и имеется четкая смена фаз его регуляции при ранозаживлении (Мвкеп е^а!., 1998), можно предположить, что глюкокортикоиды подавляют продукцию УЕвР и нитроксид анионов на поздих стадиях тканевой репарации.

Работа поддержана грантами РФФИ № 00-04-49430 и 01-

04-06564

ИЗМЕНЕНИЯ ФУНКЦИЙ ФАГОЦИТИРУЮЩИХ КЛЕТОК ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ ТИРЕОТОКСИКОЗЕ

Ланин Д.В.. Шилов Ю.И., Ширшев С.В.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Известно, что тиреоидные гормоны оказывают значительное влияние на функции иммунной системы, которое может частично опосредоваться через изменения экспрессии адре-норецепторов. Однако влияние повышенного уровня тирео-идных гормонов на фагоцитарную активность лейкоцитов изучено недостаточно. Цель работы - исследовать изменения функций фагоцитирующих клеток периферической крови и направленности влияния на них адренергических соединений при экспериментальном тиреотоксикозе разной тяжести.

Материалы и методы. Для моделирования состояния тиреотоксикоза разной степени тяжести у крыс-самцов популяции \Vistar использовали экспериментальную модель с введением /.-тироксина, обоснованную в работах Б.А. Бахметьева с соавт. [1984; 1986, и др.]. Животные 1-й группы получали /.-тироксин в течение 14 дней ежедневно подкож-

но по 40 мг/кг/сут, а 2-й группы - по 0,04 мг/кг/сут. Периферическую кровь получали из сосудов хвоста до начала введения гормона (показатели исходного фона, использовавшиеся в качестве контроля), а также на 5-е, 10-е и 15-е сут. Во все сроки эксперимента проводили оценку поглотительной активности фагоцитов периферической крови по отношению к формалинизированным эритроцитам барана, показателей кислородозависимой микробицидности в спектрофотометрическом варианте НСТ-теста. Помимо этого в динамике эксперимента оценивали влияние in vitro на функции фагоцитирующих клеток адреналина гидрохлорида (0,1 мкг/мл) и (3-адренергического агониста тербуталина сульфата (10~6 М) в условиях преинкубации при 37° С в течение 60 мин.

Основные результаты. Установлено, что при введении тироксина в дозе 40 мг/кг развивались двухфазные изменения фагоцитарной активности нейтрофилов. В первую фазу (5-е и 10-е сут эксперимента) выявлено повышение относительных показателей нейтрофильного фагоцитоза и отсутствие достоверных изменений абсолютных. Во вторую фазу (15-е сут эксперимента) регистрировалось снижение некоторых относительных и всех абсолютных параметров нейтрофильного фагоцитоза. Абсолютные показатели моноцитарного фагоцитоза были снижены во все сроки исследования, а относительные - на 15-е сут. Изменений относительных показателей фагоцитарной активности эози-нофилов не выявлено, в то время как абсолютные снижались на 15-е сут, что связано с развитием эозинопении. В условиях введения тироксина в дозе 0,04 мг/кг выявлена активация нейтрофильного фагоцитоза в абсолютном и относительном выражении во все сроки исследования. Изменений моноцитарного фагоцитоза не выявлено. Относительные показатели эозинофильного фагоцитоза снижались во все сроки исследования, а абсолютные не изменялись. На фоне экспериментального тиреотоксикоза выявлено снижение показателей НСТ-теста в пробах с добавлением опсо-низированного зимозана (стимулированный вариант теста) на 5-е сутки у животных с более легкой формой тиреотоксикоза (2-я группа) в сравнении с объединенным исходным фоном. В условиях введения более высокой дозы гормона (40 мг/кг) изменений параметров НСТ-теста в сравнении с объединенным исходным фоном не выявлено, однако в стимулированном варианте теста они были статистически достоверно выше на 5-е и 10-е сут эксперимента, чем у животных, получавших тироксин в дозе 0,04 мг/кг. При изучении влияния тербуталина сульфата и адреналина гидрохлорида in vitro на функции фагоцитирующих клеток установлено, что у интактных животных направленность действия адреналина на нейтрофильный фагоцитоз (угнетение) была аналогичной эффекту (3-адренергического агониста. На фагоцитарную активность эозинофилов адреналин оказывал преимущественно а-адренергическое действие (стимуляция). На фоне введения тироксина депрессивное влияние тербуталина на фагоцитарную активность нейтрофилов усиливалось, появлялся угнетающий (3-адренергический эффект на эозинофильный фагоцитоз. В этих условиях выявлены фазные изменения чувствительности разных типов фагоцитирующих клеток к эффекту адреналина in vitro, зависящие от дозы вводимого тироксина.

Заключение. Таким образом, изменения фагоцитарной активности клеток периферической крови при экспериментальном тиреотоксикозе зависят от дозы вводимого гормона. В условиях введения тироксина существенно модифицируются эффекты адренергических соединений in vitro на функции фагоцитирующих клеток.

ПРОЛИФЕРАТИВНЫЕ ЭФФЕКТЫ ЭНДОГЕННЫХ ФРАГМЕНТОВ ГЕМОГЛОБИНА: РОЛЬ В ТКАНЕВОЙ РЕГУЛЯЦИИ

Леонтьев К.В.. Сазонова О.В., Блищенко Е.Ю., Карелин А.А., Иванов В.Т.

Институт Биоорганической Химии им. М.М Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Москва, Россия

Эндогенная деградация гемоглобина приводит к образованию фрагментов этого белка, детектируемых в тканях млекопитающих в количествах, достигающих 1 нМ на грамм ткани. Их состав и содержание стабильны в норме и являются тканеспецифическими характеристиками, но изменяются при некоторых патологиях, связанных с изменением пролиферативного статуса ткани, например, в связи с канцерогенезом. Тестирование биологической активности фрагментов гемоглобина, выделенных из мозга млекопитающих, а также лизата эритроцитов человека и супернатанта переживающей культуры этих клеток, показало для большинства из них способность влиять на пролиферацию клеточных культур, причем среди идентифицированных пептидов были как стимулирующие, так и ингибирующие пролиферацию. Это дало основание постулировать для них роль в регуляции соотношения клеток в тканях, то есть в поддержании тканевого гомеостаза.

Пептиды группы неокиоторфина, - фрагменты, образующиеся из участка альфа-цепи гемоглобина (133-141), являются одними из самых активных стимуляторов пролиферации. Неокиоторфин, (а-(137-141)), изучен наиболее детально; он отличается наиболее высоким содержанием в тканях и секретируется эритроцитами. Независимо от содержания в среде сыворотки, неокиоторфин стимулирует на 30-50% пролиферацию опухолевых клеток - трансформированных фибробластов мыши Ь929 и меланомы мыши М3, а также эмбриональных фибробластов мыши (МЕР). Наиболее выражен эффект пептида в случае нормальных клеток. Детальное изучение эффекта неокиоторфина в зависимости от содержания сыворотки в среде показало, что наибольший эффект для клеток 1^929 наблюдается при ее содержании, не превышающем 0,5%. В присутствии 10% сыворотки эффект зависит от плотности клеток, что было показано для клеток фибробластического происхождения (Ь929 и МЕР) и мела-ноцитов (М3).

При долговременной депривации по сыворотке показана способность неокиоторфина поддерживать пролиферацию клеток тех же линий по крайней мере 96 часов. В тех же условиях, неокиоторфин поддерживал пролиферацию в гетерогенных переживающих культурах клеток красного костного мозга и селезенки мышей по крайней мере 72 часа. Это позволило охарактеризовать неокиоторфин как пептид с поддерживающей функцией. Цитометрический анализ подтвердил способность неокиоторфина вызывать прогрессию клеточного цикла, и таким образом поддерживать пролиферативный статус клеток. Параллельно с анализом ДНК было выявлено уменьшение объема клеток приблизительно на 30%, что свидетельствует о наличии у неокиоторфина механизма действия, отличного от ростовых факторов.

Согласно литературным данным, при совместной культивации преадипоцитов с неокиоторфином детектировалось увеличение внутриклеточной концентрации Са2+, сопряженное с пролиферацией этих клеток. При этом пептид не вызывал повышения уровня диацилглицерола, что указывает на его возможное участие в поздних этапах активации кальциевых каналов. Также известно, что неокиоторфин усиливает

ионные токи через кальциевые каналы L-типа. Основываясь на этих данных, было проведено изучение влияния антагонистов кальциевых каналов L-типа, верапамила и нифеди-пина, на пролиферацию клеток L929, индуцированную нео-киоторфином. Оба вещества доза-зависимо подавляли пролиферацию, индуцированную неокиоторфином; что подтверждает кальциевый механизм стимуляции пролиферации неокиоторфином.

Полученные результаты указывают на способность нео-киоторфина, присутствующего в тканях, влиять на пролиферацию клеток. Действуя аналогично факторам роста, он обладает другим механизмом действия, связанным, возможно с проникновением пептида в клетку и активацией ионных токов через кальциевые каналы L-типа. In vivo в условиях дефицита ростовых факторов он может компенсировать их недостаток, а в норме участвовать в поддержании нормального соотношения клеток в тканях. В то же время, изменение уровня неокиоторфина может способствовать канцерогенезу, на что косвенно указывает накопление этого пептида в легочной ткани при мелкоклеточном раке легкого.

Работа поддержана Российским Фондом Фундаментальных Исследований, грант #00-04-48639.

РОЛЬ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА В ПОДДЕРЖАНИИ ВЫЖИВАНИЯ КЛЕТОК ЛИНИИ CTLL-2 АУТОКРИННЫМИ ФАКТОРАМИ ПОСЛЕ ХОЛОДОВОГО СТРЕССА

Луценко Г.В.. Гапон М.В., Дьячкова Л.Г.

Институт биоорганической химии им.М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН, Москва, Россия

Введение. В последнее время появляется все больше данных, указывающих на то, что выживание клеток млекопитающих находится под строгим контролем факторов роста и аутокринных факторов выживания. Ранее нами была описана экспериментальная модель с переносом клеток IL-2-за-висимой линии CTLL-2 из культуры высокой плотности (ВП) в культуру низкой плотности (НП), в результате которого наблюдалась массовая гибель клеток по механизму некроза (Биол. Мембраны, 2001, Т. 18, N4, с.312-319). Внесение в НП-культуру кондиционированной среды (КС), содержащей аутокринные факторы, полностью предотвращало гибель клеток. Было установлено, что наиболее вероятной причиной такой гибели является нарушение контроля энергетического метаболизма клеток CTLL-2 аутокринными факторами, вызванное резким изменением их концентрации при переносе клеток из ВП-культуры в НП-культуру. В более поздних экспериментах нами было обнаружено, что непременным условием некроза клеток в указанной выше модели является их холодовая инкубация (0°С,10 мин.) перед внесением в НП-культуру.

Целью работы было исследование роли энергетического метаболизма в поддержании выживания клеток линии CTLL-2 аутокринными факторами после культивирования клеток в ВП-культуре, Холодовой инкубации при 0°С и переноса в НП-культуру.

Материалы и методы. Бессывороточная среда для проведения экспериментов, приготовленная на основе RPMI-1640, содержала 2мМ L-глутамина, 0,5 мг/мл Р-циклодекст-рина, 0,5 мг/мл БСА, 5 мг/мл инсулина, 25 мг/мл трансфер-рина, 5x10'7 М путресцина, 50 мкМ 2-меркаптоэтанола и 100 Ед/мл 1L-2. Выживание клеток оценивали путем их прижизненного окрашивания трипановым синим. Уровень АТР в клетках оценивали с использованием биолюминесцентного

люциферин-люциферазного метода. В качестве КС использовали надосадочную жидкость культуры клеток CTLL-2, которые культивировали в концентрации 1x106 клеток/мл в течение 24 часов.

Основные результаты. Было показано, что после культивирования клеток CTLL-2 в высокой плотности (в виде плотного осадка 1 х 106 клеток) в течение 14-16 часов и переноса в свежую среду уровень АТР в них падает в 4-5 раз за 1-2 мин. При добавлении к клеткам вместо свежей среды КС уровень АТР в них оставался неизменным и составлял 4,5-5 нМ/106 клеток. Было установлено, что холодовая инкубация (0°С, 10 мин.) клеток, полученных из ВП-культур, никак не влияет на обнаруженный эффект падения уровня внутриклеточного АТР. Однако, при длительном культивировании опытных клеток в НП-культурах (2x104 клеток/лунку) предшествующая ему холодовая инкубация оказывала значительное влияние как на уровень внутриклеточного АТР, так и на выживание клеток. Так, если в клетках, которые не подвергались холодовому стрессу, уровень АТР восстанавливался до нормальных значений уже ко 2-му часу культивирования, то в клетках, которые инкубировали 10 мин. при 0°С, уровень АТР оставался сниженным в течение всего времени культивирования и к 6-му часу не превышал 40% от уровня контроля. Выживание клеток, подвергнутых холодовому стрессу также оказалось сниженным: к 6-му часу культивирования жизнеспособность клеток, перенесенных из ВП-культуры в НП-культуру, и подвергнутых Холодовой инкубации, составляла 32,3%, в то время как жизнеспособность клеток, перенесенных в НП-куль-туру без Холодовой инкубации, - 78%. Показано, что внесение в НП-культуры вместо свежей среды КС приводит к сохранению содержания АТР в клетках на нормальном уровне и поднимает выживание клеток до 75-80% несмотря на наличие Холодовой инкубации клеток.

Заключение. Полученные результаты показывают, что при переносе клеток CTLL-2 из ВП-культуры в НП-культуру, содержащую свежую среду, происходит резкое снижение уровня АТР в клетках, которое после перенесенного клетками хо-лодового стресса приводит к их гибели по механизму некроза. Аутокринные факторы, внесенные в НП-культуру в составе КС, предотвращают снижение уровня внутриклеточного АТР, что препятствует гибели клеток несмотря на перенесенный ИМИ ХОЛОДОВОЙ стресс.

ИССЛЕДОВАНИЕ ОТВЕТА МЫШЕЙ ЛИНИИ SJL/J НА ИММУНИЗАЦИЮ ТИРЕОГЛОБУЛИНАМИ ЧЕЛОВЕКА И КРЫСЫ

Львова О.А.. Руденко И.Я., Пиневич А.А., Климович В.Б.

Центральный научно-исследовательский рентгенорадиологический институт М3 РФ, Санкт-Петербург, Россия

Одной из моделей, на которых исследуют патогенез аутоиммунных заболеваний щитовидной железы (ЩЖ) у человека, является экспериментальный аутоиммунный тиреоидит (ЭАТ), индуцируемый у мышей линий СВА или SJL/j с помощью иммунизации препаратами тиреоглобулина (ТГ) разной степени чужеродности. При изучении специфичности полученных в лаборатории мышиных моноклональных антител (МКАТ) против ТГ человека с помощью метода иммунофер-ментного анализа (ИФА) были выявлены реагенты, взаимодействующие с ТГ разных видов животных, в том числе с ТГ мыши. При исследовании парафиновых срезов ЩЖ мышей методом иммунофлуоресцентной микроскопии установлено,

Табл. СРЕДНИЕ ГЕОМЕТРИЧЕСКИЕ ЗНАЧЕНИЯ ОБРАТНЫХ ТИТРОВ АТ К ТГ ЧЕЛОВЕКА И КРЫСЫ У ПОДОПЫТНЫХ И КОНТРОЛЬНЫХ МЫШЕЙ.

Дни опыта АТ к ТГ крысы АТ к ТГ человека

Иммунизация Контроль Иммунизация Контроль

ТГ человека ТГ крысы ТГ человека ТГ крысы

7 88±1,8 698±3,3 50±0,0 407±5,4 213±3,6 50±0,0

14 721 ±3,4 26480±3,3 54±1,4 24520±1,6 4985±2,5 50±0,0

21 3431 ±2,0 71174±2,4 53±1,4 64474±2,1 14002±2,9 50±0,0

28 9122±1,6 173297±2,2 54±1,4 51756±2,0 29881 ±3,6 50±0,0

35 7404±2,4 77713±2,3 61±1,6 83925±1,9 10070±2,1 50±0,0

42 6142±2,9 51756±1,8 73±1,7 69628±1,6 9744±2,3 50±0,0

49 18631 ±1,8 51756±1,9 56±1,5 55282± 1,4 11616±3,0 50±0,0

56 6142±1,8 75193±1,9 56±1,5 127408±0,0 11616±3,0 50±0,0

63 4046±0,0 109244±0,0 50±0,0 127408±0,0 20794±2,2 50±0,0

70 4046±0,0 109244±0,0 50±0,0 127408±0,0 36415±0,0 50±0,0

что эти МКАТ взаимодействуют с ТГ, локализованном в коллоиде фолликулов ЩЖ. Из этого следует, что ТГ человека может индуцировать у мышей синтез аутоантител. ТГ крысы является наиболее близким гомологом ТГ мыши. Подобие последовательностей аминокислотных остатков в этих белках составляет 97%. Это позволяет в ряде ситуаций рассматривать ТГ крысы как аналог мышиного аутоантигена.

Цель работы состоит в исследовании продукции антител (АТ) и аутоАТ к ТГ у мышей линии БЛ./] (Н-25), иммунизированных ТГ человека и ТГ крысы. Контролем служили интакт-ные мыши той же линии. Антигены в полном адъюванте Фрейнда вводили подопытным животным в подушечки стоп. На 14-й день такие же дозы антигенов вводили в неполном адъюванте Фрейнда подкожно. В течение 70 дней еженедельно у интакт-ных и подопытных мышей получали пробы крови. Титры АТ к ТГ человека и крысы определяли методом ИФА (таблица).

Таблица. Средние геометрические значения обратных титров АТ к ТГ человека и крысы у подопытных и контрольных мышей.

Сравнение полученных данных показало, что у мышей, иммунизированных как ТГ человека, так и ТГ крысы, средние обратные титры АТ к ТГ человека и к ТГ крысы достоверно выше, чем в контрольной группе на протяжении всего срока наблюдения (Р<0,001). У животных, иммунизированных ТГ, человека средние обратные титры АТ к ТГ человека были достоверно выше, чем у мышей, иммунизированных ТГ крысы (Р<0,001). Средние обратные титры АТ к ТГ крысы на всех сроках наблюдения были достоверно выше в группе животных, иммунизированных ТГ крысы, по сравнению с иммунизированными ТГ человека (Р<0,001). При иммунизации как гетерологичным, так и “аутоантигеном” возрастает титр АТ как к видоспецифичным, так и к консервативным участкам антигена. При иммунизации ТГ человека титры АТ достигают максимума на 56-й день. При иммунизации ТГ крысы уровень АТ изменяется волнообразно: титр достигал максимума на 28-й день, затем снизился и увеличился вновь к 63-70 дню.

Полученные данные свидетельствуют о том, что ТГ человека является более сильным иммуногеном по сравнению с ТГ крысы. В то же время они позволяют предполагать, что ТГ крысы проявляет себя как более эффективный индуктор аутоАТ.

Исследование выполняется при поддержке РФФИ (грант №01-04-49781)

ИММУНОГЕННОСТЬ ПЕПТИДОВ,

СООТВЕТСТВУЮЩИХ ДОМИНАНТНЫМ т И В КЛЕТОЧНЫМ ЭПИТОПАМ БЕЛКА ASP F 2, ЭКСПРЕССИРОВАННЫХ В СОСТАВЕ ДРОЖЖЕВЫХ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ Марченко А.Н..1 Алексеева Л.Г.,

Беневоленский С.В., 'Свирщевская Е.В.

НИИ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов,

Институт биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю.В. Овчинникова, РАН,

Москва

Для получения вакцин в последнее время все чаще стали использовать не полноразмерные белки, а их пептиды, соответствующие доминантным Т и/или В клеточным эпитопам белка. Использование пептидов позволяет решить ряд задач, таких, например, как усиление нужного ответа, изменение его типа, получение менее аллергенных конструкций, получение дешевых вакцин и пр. Поскольку пептиды являются слабыми иммуногенами, то для их использования необходим некоторый носитель, в качестве которого используют коньюгаты с крупными молекулами белка, например, с гемоцианином улитки, или получают полимеры на основе лейцина и пр. Одним из таких носителей являются дрожжевые вирусоподобные частицы (ВПЧ), размер которых составляет несколько мегадальтон. Частица состоит примерно из 300 копий белка р 1, N-конец которого экспонирован наружу частицы, а С-конец - внутрь. Экспрессия генно-инженерными методами чужеродных пептидов на С-и/или N-концах pi белка позволяет получать частицы большого веса, которые содержат 300 - 600 копий пептида, необходимого для иммунизации. Целью данной работы была характеристика ВПЧ, экспрессирующих на С-концер1 белка пептиды, соответствующие Т или В клеточным доминантным эпитопам белка из грибка Aspergillus fumigatus, который вызывает ряд тяжелых заболеваний, таких как аллергический бронхолегочный аспергиллез и инвазивный аспер-гиллез. Нами ранее были определены Т и В клеточные эпитопы белка из A.fumigatus Asp Г 2, распознаваемые в контексте H-2d генотипа. Для экспрессии этих пептидов в составе ВПЧ использовали синтетические олигонуклеотиды,

кодирующие последовательности пептидов. Необходимое для встраивания в вектор количество копий кДНК получено с помощью полимеразной цепной реакции. Мы создали две конструкции, содержащих по 2 Т- (ВПЧ-Т) или В-кле-точных эпитопа (ВПЧ-В), в качестве контроля использовали частицу, состоящую только из белка р]. Два линейных эпитопа встраивали через линкер. Мышей линии BALB/c иммунизировали 100 мкг частиц п/к в фосфатном буфере. Сыворотки крови использовали для определения наличия антител к белку Asp f 2 методом ИФА. Распознавание Т клеточных эпитопов определяли in vitro по пролиферации спленоцитов в ответ на Asp f 2 и ВПЧ конструкции. Было показано, что иммунизация ВПЧ-В приводит к появлению антител, распознающих белок Asp f 2. Тонкая специфичность этих антител отличается от антител, вырабатываемых у мышей при иммунизации белком Asp Г 2, так как последние распознавали не только белок, но и синтетические пептиды, соответствующие доминантным В эпитопам, тогда как антитела, выработанные на ВПЧ-В, синтетические пептиды не распознавали. Доминантные Т клеточные эпитопы распознавались как в составе ВПЧ-Т, так и в Asp f 2 белке. Т клетки, их распознающие, появлялись при иммунизации как ВПЧ-Т, так и белком.

ВЛИЯНИЕ АНГИОГЕНИНА НА НЕКОТОРЫЕ МЕХАНИЗМЫ ЛОКАЛЬНОГО ВОСПАЛЕНИЯ

Машков А.Е., Цумап В.Г., Пыхтеев Д.А., Плаксина Г.В., Щербина В.И., Камолова Г.С., Горевой А.А., Слесарев В.В.

МОНИКИ, Москва, Россия

Перспективным направлением в исследовании возможности модуляции воспалительного процесса является изучение влияния природного препарата ангиогенина (АГ) на иммунобиологическую защиту организма. Ангиогенин - активный фактор роста кровеносных сосудов, присутствует в тканях, сыворотке крови человека и животных (Bond M.D., Vallee B.L. 1988). Впервые ангиогенин был выделен в 1985г. Б. Велли в Гарвардском университете из культурной среды аденокарциномы толстой кишки человека (Vallee B.L., Riordan J.F., Lobb R.R., Higachi N., Fett J.W., Crossley G., and Buhler R. 1985). В последние годы в отечественной и зарубежной литературе АГ уделяется большое внимание как фактору (натуральному и рекомбинантному) влияющему на многие стороны гомеостаза. Однако, роль АГ в адаптационнозащитных реакциях организма и механизм его действия на воспалительный процесс исследованы недостаточно.

Целью настоящей работы явилось изучение действия АГ на формирование очага асептического воспаления

При этом был использован кристаллографический метод изучения морфологии раневого экссудата с места локального асептического воспаления. Проводилось кристаллооптическое исследование с помощью методик клиновидной дегидратации (открытая капля) и краевой дегидратации (закрытая капля) с последующим поляризационно-оптическим изучением препарата в скрещенных поляризаторах.

Оценка действия АГ природного происхождения на течение защитно-восстановительного процесса в очаге локального асептического воспаления было изучено с помощью модифицированной нами скарификационной пробы (функциональный тест “кожное окно”). По этой методике учитывались критерии состоятельности клеточной защиты и особенностей структурной характеристики сложно-белкового компонента раневого экссудата, участвующего в стимуляции

гранулоцитарной и моноцитарно-лимфоцитарной клеточной кооперации.

В 18 случаях из 20 обследованных пациентов обнаружена слабо выраженная макрофагально-лимфоцитарная фаза воспаления, что свидетельствует о снижении местной иммунной защиты. Гранулоцитарная фаза защиты (через 8 часов) была выражена у всех обследованных, при этом количество нейтрофилов в дермоцитограмме составляло более 80%. Сопоставление результатов определения спектра морфост-руктур (кристаллографического метода краевой дегидратации) и дермоцитограммы выявило их высокую корреляцию (г=0,89). Наличие анизотропных сферолитов в кристалло-граммах отражает присутствие в раневом экссудате слож-но-белковых комплексов, в том числе участвующих в стимуляции клеточного ответа на воспаление (кинины, ферменты, гормоны). Отсутствие анизотропных структур в раневом экссудате сочеталось со слабостью лимфоцитарно-моноцитар-ного ответа (2-я фаза воспаления) и увеличением продуктов катаболизма в дермоцитограмме.

Воздействие АГ на течение асептического воспаления оценивалось путём нанесения его на скарифицированный участок эпидермиса. Сравнение дермоцитограмм и кристаллограмм по этапам воспаления выявило усиление активности клеточной защиты под влиянием АГ, что отмечено в 18 из 20 проведённых проб. Уже через 8 часов после постановки пробы отмечалось усиление макрофагально-лимфоцитарной реакции и появление в кристаллограммах типичных сферолитов.

Таким образом, полученные данные позволяют предположить, что АГ в определенной степени оказывает модулирующее влияние на воспалительный процесс, местную иммунобиологическую защиту и восстановительные процессы в очаге воспаления. Подобные свойства АГ открывают широкие перспективы его применения в клинической практике.

ДИФФЕРЕНЦИРОВОЧНЫЕ СВОЙСТВА МИЕЛОПЕПТИДА-4 И МИЕЛОПЕПТИДА-6

Михайлова А.А., Кирилина Е.А.

Институт биоорганической химии

им. М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской

Академии Наук, Москва, Россия.

Нормальное функционирование иммунной системы сопровождается процессами пролиферации и дифференциров-ки иммунокомпетентных клеток. Сбой в одном из этих процессов может привести к возникновению иммунодефицит-ного состояния, а также к развитию различных заболеваний, в том числе онкологических. Примерами нарушения нормальной дифференцировки клеток могут служить различные типы гемобластозов: миелобластные, лимфобластные и гемоблас-тные лейкозы. Перспективным подходом к лечению данных заболеваний является использование в комплексной терапии эндогенных индукторов клеточной дифференцировки.

Целью данной работы явилось определение способности эндогенных пептидов костномозгового происхождения миелопептида-4 (МП-4) - Phe-Arg-Pro-Arg-Ile-Met-Thr-Pro и миелопептида-6 (МП-6) - Val-Asp-Pro-Pro вызывать терминальную дифференцировку лейкозной линии клеток HL-60 по двум параметрам: по экспрессии дифференцировочных антигенов и по морфологии клеток. Оценка дифференцировки миеломонобластов проводилась по уровню экспрессии маркеров зрелых клеточных форм: CD14 и CD38. Цитометрию проводили на приборе EPICS ELITE Морфологию окрашенных Азур - эозином клеток (по Романовскому) анализировали под иммерсией на микроскопе Leitz.

Клетки линии НЬ-60 на 90% состоят из незрелых миеломо-нобластов и способны спонтанно пролиферировать. Эта линия клеток может дифференцироваться по двум разным направлениям, в зависимости от индуктора. Дифференцировку клеток линии НЬ-60 по моноцитарному ряду вызывает форболовый эфир (РМА), который использовался в экспериментах в качестве положительного контроля дифференцировки.

Инкубация клеток НЬ-60 с МП-4 (1 мкг/мл) в течение 72 часов приводила к увеличению экспрессии СО 38 антигена (моноцитов) в 5 раз, а экспрессии СО 14 антигена (макрофагов) в 8 раз. Дифференцировочные свойства МП-4 сравнимы с таковыми РМА, который увеличивал экспрессию С038 и СО 14 антигенов в 9 и 8 раз соответственно. Несколько иной результат был получен с МП-6, инкубация которого в дозе 10 мкг/мл с клетками НЬ-60 вызывала только двукратное увеличение клеток, экспрессирующих моноцитарный маркер С038+. Данные, полученные по экспрессии дифферен-цировочных маркеров, полностью совпали с результатами морфологического анализа.

Таким образом, факт индукции дифференцировки лей-козных клеток под влиянием миелопептидов открывает перспективу их возможного использования в комплексной терапии гемобластозов.

ВЛИЯНИЕ ИММУННЫХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ АСИММЕТРИЙ ПРИ ПАТОЛОГИИ ЦНС У САМОК-КРЫС НА ФОРМИРОВАНИЕ ИММУНОРЕАКТИВНОСТИ И ДВИГАТЕЛЬНЫХ РАССТРОЙСТВ У ПОТОМСТВА

Огурцов Р.П. Авалиани Т.В., Серякова О.Р., Пузырева В.П., Белобокова Н.К., Глазунова С.Г., Попов В.Г.

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

При травмах мозга формирование двигательных расстройств и протекание компенсаторных процессов у крыс зависит от латерализации травмы справа или слева, а также от исходной функциональной асимметрии (моторная преференция). Цель данного исследования состояла в выявлении взаимосвязи двигательных и иммунных нарушений самок-крыс правшей и левшей с удаленным участком сенсомотор-ной коры справа или слева и формированием иммунореактивности и двигательных нарушений у их потомства.

После определения моторной преференции у самок-крыс удаляли участок сенсомоторной коры справа или слева. На 7,14 и 30 сут определяли функциональную активность лейкоцитов (ФАЛ), активность естественных киллеров (ЕК) и ЭМГ-показатели мышц задних лап.

Спаривание проводили через месяц после операции. У одномесячного потомства регистрировали ЭМГ-показатели мышц задних конечностей, ФАЛ и активность ЕК.

У экспериментальных самок была увеличена спонтанная и вызванная ЭМГ в мышцах задних конечностей на контралатеральной лапе по отношению к удаленному участку мозга. У крысят асимметрия ЭМГ-ответов проявлялась на той же стороне, что и у их матерей. При этом травма доминантного полушария матери вызывала атонические реакции у крысят, а субдоминантного -гиперкинетические.

На 7-30 сут после операции усиление миграционной активности лейкоцитов переферической крови отмечали у всех опытных самок, кроме крыс-левшей с правосторонней травмой. У потомства данный показатель выявлен только у крысят, рожденных от правшей. Травма доминантного полуша-

рия вызывала у самок подавление способности Т- лимфоцитов реагировать на Кон-А на 7,14 и 30 сут, а субдоминантного полушария - только на 14 сут. Снижение способности Т-лимфоцитов реагировать на Кон-А выявлена во всех пометах, кроме крысят, рожденных от правшей с левосторонней травмой сенсомоторной коры.

У взрослых самок-левшей снижение способности Т-лим-фоцитов реагировать на ФГА проявлялась на 14 сут после операции, а у правшей - на ЗОсут, независимо от латерализации травмы. У потомства данный показатель регистрировался у крысят, рожденных от самок-левшей с левосторонней травмой сенсомоторной коры.

Функция ЕК была изменена у матерей и их крысят только при левосторонней травме сенсомоторной коры (у правшей активность ЕК возрастала, а у левшей- падала).

Поскольку выраженность и характер иммунных и двигательных нарушений у потомства зависит от индивидуального профиля асимметрии матери и стороны травмы сенсомоторной коры, можно предположить, что формирование асимметрии позы крысят обусловлено действием пептидных факторов, обладающих латерализованным действием (один из которых аргенин-8-вазопрессин). Данные пептидные факторы вызывают гиперактивацию гипоталамо-гипофизирно-надпочечниковой оси у матерей, что, по-видимому, приводит к иммунным нарушениям у потомства.

ВЛИЯНИЕ ПЕПТИДНОГО БИОРЕГУЛЯТОРА ВИЛОНА НА ФУНКЦИИ КЛЕТОК ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

Полякова В.О., Князькин И.В., Ярилин А.А., Кветной И.М.

Институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия,

Институт иммунологии М3 РФ, Москва, Россия

Цель. Выяснить влияние вилона на функционирование клеток иммунной системы и на апоптоз тимоцитов.

Материалы и методы. Исследования проводились в культуре клеток тимуса. Тимоциты выделяли из фрагментов тимуса эмбрионов человека около 20-недельного срока развития. В качестве тимусных эпителиальных клеток (ТЭК) использовали клетки суспензионной линии VTEC2.H/S. Клетки тимуса культивировали 1 сутки. Исследованные параметры определяли как без стимуляции, так и в условиях стимуляции. Пептид вводили в культуры на весь срок культивирования в концентрациях 2, 20 и 200 нг/мл. Пролиферацию оценивали радиометрически по включению 3Н-тимидина. Апоптоз оценивали путем определения процента гиподип-лоидных клеток цитофлуорометрически с предварительной окраской фиксированных клеток йодидом пропидия. Проточную цитофлуорометрию осуществляли на проточном цитометре FACS Calibur (Becton Dickinson). Экспрессию мембранных молекул, определяли методом проточной цитофлуо-рометрии с использованием наборов моноклональных антител. Для определения внутриклеточных цитокинов использовали общепринятый метод: клетки активировали смесью форболмиристатацетата и иономицина, через 18 ч. пермеа-билизировали сапонином, обрабатывали моноклональными антителами (МАТ) к интерферону у и 1L-4, мечеными фико-эритрином, и одновременно МАТ к CD3, мечеными ФИТЦ, и подвергали двуцветной проточной цитофлуоромтерии. Секрецию тимулина и цитокинов оценивали путем определения содержания в культуральных супернатантах исследуемых субстанций методом ELISA. Все пробы ставились в триплетах.

Основные результаты. Оценивали способность вилона, который вводили в 1-суточную культуру тимоцитов человека в избранных дозах, вызывали их активацию. Кроме того изучали влияние вилона на развитие апоптоза тимоцитов, индуцированного контактом с ТЭК в 1-суточной культуре. Действие вилона в указанных системах было конкордантным. Вилон усиливал экспрессию на тимоцитах двух изученных молекул активации - HLA-DR и CD54 и ослаблял экспрессию раннего активационного антигена CD69. Действие вилона на экспрессию CD54 выражено сильнее, а его действие на CD69 проявляется в более широком диапазоне доз. При действии в ко-культуре тимоцитов и ТЭК в ряде случаев эффект пептида оказывался несколько иным: вилон в высокой дозе усиливает экспрессию CD69 на тимоцитах.

Вилон ослаблял выраженность апоптоза тимоцитов, индуцированного контактом с ТЭК. Таким образом, обработка тимоцитов человека исследованным пептидом in vitro, влияет на проявления активации тимоцитов, индуцируемые контактом с ТЭК: вилон ослабляет экспрессию раннего маркера активации CD69 и усиливает экспрессию поздних маркеров активации CD54 и HLA-DR. Эффекты вилона выявленные в данных тест-системах, конкордантны по направленности, хотя отличаются по степени выраженности. Вилон защищает ти-моциты от апоптоза, индуцированного контактом с ТЭК. Усиление экспрессии CD54 означает повышение адгезивности клеток. Адгезивность может повышаться в отношении как стромальных клеток, так и самих тимоцитов, которые экспрессируют интегрин LFA-1, рецептором которого является молекула CD54 (ICAM-1). Несколько труднее оценить значимость усиления экспрессии на тимоцитах молекул главного комплекса гистосовместимости II класса. Лишь в последние годы начато изучение роли этих молекул в функционировании Т-лимфоцитов в качестве антигенпрезентирующих клеток. С положительной селекцией клонов тимоцитов связана также экспрессия на поверхности тимоцитов молекулы CD69. К селекции, особенно отрицательной, имеет прямое отношение апоптоз тимоцитов. Влияя на экспрессию названных молекул и на выраженность апоптоза, пептиды могут вмешиваться в селекцию клонов тимоцитов, контролируя и модифицируя его. Таким образом, они оказывают влияние на формирование антигенраспознающего репертуара.

Заключение. Вилон усиливает экспрессию активационных антигенов CD54, HLA-DR на поверхности тимоцитов человека и ослабляет ее на поверхности ТЭК, а также ослабляет экспрессию раннего активационного антигена CD69 на поверхности тимоцитов. Вилон также снижает количество тимоцитов, гибнущих в форме апоптоза, тогда как действия пептида на спонтанную и индуцированную пролиферацию лимфоцитов не обнаружено.

ВЛИЯНИЕ ВЕГЕТАТИВНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЫ НА ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА И ОСОБЕННОСТИ ИММУНОРЕАКТИВНОСТИ ЧЕЛОВЕКА

Рагииене И.Г., Камзалакова Н.И., Булыгин Г.В.

Красноярская государственная медицинская академия, г.Красноярск, Россия

Введение. Выраженность и особенности иммунного ответа в значительной степени обусловлены состоянием регуляторных систем организма Среди них важная роль принадлежит вегетативной нервной системе (ВНС): известно, что генетически закрепленное преобладание тонуса симпатического или парасимпатического отделов этой регуляторной системы определяют направленность многих процессов в

оганизме, особенности его реагирования на внешние воздействия. К настоящему времени получены убедительные под-твеждения, свидетельствующие об участии многих гормонов и нейромедиаторов в формировании иммунного ответа. Представляет интерес выяснение зависимости показателей иммунной системы у лиц, различающихся по тонусу отделов ВНС, а также установление связи параметров разнлич-ных функциональных отделов иммунной системы с клиническими проявлениями особенностей иммунореактивности индивида.

Материалы и методы. Обследованы 55 практически здоровых мужчин и женщин в возрасте 18-40 лет; исследования проведены у лиц, не имеющих какой-либо острой или хронической патологии на момент обследования, а также при отсутствии у них заболеваний в течение 2-х месяцев, предшествующих проведению исследований. Определялись показатели клеточного (CD3, CD4, CD8, CD4/CD8 ) и гуморального (CD19, IgA, IgM, IgG, IgE, ЦИК) звеньев иммунитета; функциональное состояние фагоцитоза характеризовалось показателями хемилюминограммы, наиболее информативным среди которых оказалось время выхода на пик кривой индуцированной хемилюминесценции. Все обследованные разделены на группы по клиническим признакам: наличию в анамнезе частых и длительных заболеваний (ОРВИ, острые риниты, трахеиты и другие - группа ЧДБ, 28 человек) или острых аллергических реакций (крапивница, аллергический ринит, отек Квинке и прочие - группа АС, 27 человек), которые расценены как проявления инфекционного или аллергического синдромов. Соотношение тонуса отделов ВНС оценивалось по индексу Керде (ИК), положительные или отрицательные значения которого характеризуют соответственно преобладание парасимпатического или симпатического отделов ВНС.

Результаты исследования. Анализ показателей обследованных, различающихся по данным анамнеза, характеризующим наличие у них инфекционного или атопического синдрома, показал, что в группе ЧДБ почти все параметры клеточного и гуморального звеньев иммунной системы (за исключением концентрации IgM) были ниже, чем в группе АС. При оценке уровня ИК этих групп установлено, что в группе ЧДБ этот показатель достоверно выше, чем в группе АС (8,02±0,84 и -4,17±0,34 соответственно; Р<0,001). Это свидетельствует о том, что у лиц, склонных к частым длительным заболеваниям, преобладает тонус симпатического отдела ВНС. Сравнение показателей иммунограммы у лиц, различающихся по тонусу отделов ВНС показало, что относительное и абсолютное количество лимфоцитов в крови, большинство показателей клеточного (за исключением числа CD8 ) и несколько параметров гуморального (абсолютное число CD 19 , концентрация IgG, IgE) звеньев иммунитета определялись на более высоком уровне в группе с преобладанием тонуса парасимпатического отдела ВНС. В то же время функциональная активность фагоцитоза была у них достоверно выше - время выхода на пик кривой хемилюминограммы меньше, чем у лиц с преобладанием тонуса симпатического отдела ВНС.

Заключение. Полученная в результате проведенных исследований информация позволяет утверждать, что преобладание тонуса одного из отделов ВНС является фактором, определяющим как особенности иммунного статуса человека, так и тип его иммунного реагирования на антигенную стимуляцию. Обследованные, у которых отмечается преобладание тонуса симпатического отдела ВНС, проявляют склонность к возникновению частых респираторных заболеваний. Последнее обстоятельство, по-видимому, можно объяснить ограничением у них возможностей иммунитета

за счет “истощения” адаптационных способностей иммунной системы на фоне повышенной надпочечниковой активности. Преобладание же тонуса парасимпатического отдела обусловливает более высокие митотическую активность лимфоцитов и их способность к синтезу цитокинов, иммуноглобулинов (в том числе и иммуноглобулина Е) и рецепторов, что формирует у этих лиц повышенную готовность к аллергическим реакциям.

ИНТЕРЛЕЙКИН-1 р И ЕГО МУТАНТ ДЭМ -СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СИГНАЛЬНОЙ И ИММУН0ФИЗИ0Л0ГИЧЕСК0Й АКТИВНОСТИ

Рыбакина Е.Г.. Корнева Е.А.

ГУ “Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН”, Санкт-Петербург, Россия

Множественность физиологических эффектов иммуномодулирующего цитокина Интерлейкина-1 (1Ь-1) привлекает особое внимание к проблеме соотношения его структуры и функций. Перспективным подходом к исследованию этого вопроса является использование мутантных молекул 1Ь-1, полученных в результате модификации его структуры. Одним из таких мутантов рекомбинантного Ш-1Р (р!Ь-1(3) человека является созданный в совместной работе со Стокгольмским Университетом (Швеция) под руководством проф. Т.ВаПГа) мутант ДБЫО, полученный при удалении трех аминокислот (серина, аспарагина, аспарагиновой кислоты - 8, N. О) в положении 52-54, в петле между 4-й и 5-й цепями р1Ь-1(3. Целью настоящей работы было сравнительное исследование особенностей связывания р1Ь-1Р, мутанта ДЗЫО и рецепторного антагониста 1Ь-1 (1Ь-1ра, Бостон, США) с рецепторами I и II типа на иммунокомпетентных клетках, их инициирующего влияния на трансдукцию сигнала 1Ь-1(3 по сфингомиелиновому пути в мембранах нервных клеток, оцениваемую по активации ключевого энзима этого пути нейтральной сфингомиелиназы (Н-СМазы), а также изучение влияния различия в их структуре на проявление наиболее характерных для цитокина биологических эффектов.

Установлена различная аффинность связывания р1Ь-1Р, 1Ь-1ра и мутанта ДSND с рецепторами I и II типа на линиях иммунокомпетентных клеток ЕЬ-4 и Ка]I. Показано, что ASND в концентрациях 10" - 10 |0М оказывал стимулирующее действие на активность Н-СМазы в мембранах клеток коры головного мозга мышей, которое было менее выраженным, чем при ее индукции р1Ь-1Р и отсутствовало при использовании 1Ь-1ра. Таким образом, как стимулятор активности Н-СМазы, мутант ДЗИВ проявляет свойства частичного агониста 1Ь-1р. Модификация структуры 1Е-1Э в его мутанте ДБКО приводила не только к изменению аффинности его связывания с интерлейкиновым рецептором I (но не II) типа и сигнальной активности в отношении инициации трансдукции сигнала Ш-1Р по сфингомиелиновому пути, но и к частичной утрате его ключевых эффектов: комитогенных, гшрогенных, кортикотропных, а также к появлению в его характеристике иммуномодулирующих свойств частичного антагониста 1Ь-1р. Полученные результаты позволяют заключить, что даже незначительная модификация структуры 1Ь-1Р, не приводящая к существенному изменению третичной структуры мутанта ДБЫВ по сравнению с Ш-1Р, оказывает выраженное влияние на эффекты его биологического действия. Результаты работы открывают перспективу создания препаратов цитокинов с ограниченным спектром физиологической активности.

КОМПОНЕНТЫ ТКАНЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ ПЕПТИДНЫХ КОМПЛЕКСОВ: ИНГИБИТОРЫ РОСТА ТКАНЕЙ

Сазонова О.В. Блищенко Е.Ю., Карелин А.А., Филиппова М.М., Калинина О.А., Яцкин О.Н., Хайдуков С.В., Шейкин Ю. А.*, Соколов Д. И.*, Фрейдлин И.С.*, Иванов В.Т.

Институт Биоорганической Химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, *Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия.

Анализ эсктрактов различных тканей млекопитающих показал, что все эти источники содержат в значимых количествах пептиды - продукты эндогенного протеолиза узкой группы белков с известной функцией, например, гемоглобина, актина, клеточных ферментов. Состав и содержание этих веществ отличаются высокой стабильностью в нормальных условиях и являются тканеспецифической характеристикой. Стабильные и тканеспецифичные наборы этих пептидов получили название тканеспецифических пептидных комплексов. Изучение биологической активности более 100 таких пептидов показало, что подавляющее большинство этих соединений ингибируют пролиферацию клеток в культурах.

Большинство ингибиторов пролиферации (80%) принадлежат к семействам фрагментов участка Р-цепи гемоглобина (32-41) - геморфинов, а также участков р-актина - (75-90) и (68-77).

Антипролиферативные эффекты пептидов этих групп были изучены в панели трансформированных клеток различного происхождения, включая первичные опухоли. Наиболее активные вещества - валорфин (УУ-геморфин-5) и фрагменты Р-актина (75-90) и (68-77) подавляют пролиферацию опухолевых клеток на 70-90%. Высокая активность указывает на вклад индукции клеточной гибели в наблюдаемый эффект. При этом показано, что активность всех пептидов в отношении нормальных клеток (первичные культуры клеток красного костного мозга и селезенки мыши) в несколько раз ниже, чем в отношении опухолевых клеток. Изучение динамики пролиферации при долговременной инкубации в присутствии пептидов показало, что все они действуют схожим образом: при первом добавлении индуцируют обратимую задержку пролиферации (приблизительно на 24 часа), с одновременной индукцией обратимой резистентности к последующему воздействию, по времени намного превосходящую задержку пролиферации. В разных линиях клеток резистентность может продолжаться 48-96 часов. При поочередном добавлении валорфина и фрагментов Р-актина была продемонстрирована перекрестная резистентность, индуцированная первым добавленным пептидом, что, несмотря на разные сайты связавания этих веществ, указывает на пересечение внутриклеточных путей, задействованных в реализации их активности. Схожим характером воздействия на клеточную пролиферацию обладают, по литературным данным, присутствующие в тканях трех-четырех членные Ы-моди-фицированные пептиды, обогащенные кислыми аминокислотными остатками. Это, а также их тканеспецифичность, дает возможность причислить их к компонентам тканеспецифических пептидных пулов, принимающим участие в негативной регуляции роста тканей, и, возможно, противоопухолевой защите организма.

Очевидная разница механизмов действия компонентов тканевых комплексов и стандартных цитостатических препаратов может обусловить эффективность этих пептидов в отношении опухолей с приобретенной резистентностью и обеспечить аддитивный эффект при совместном с цитостатиками

применении. Нами было показано, что после индукции резистентности к эпирубицину, клетки L929 становятся нечувствительны к действию валорфина; напротив, их чувствительность к действию фрагмента Р-актина (76-89). возрастает. Полученные результаты указывают, что данный фрагмент р-актина может использоваться в терапии опухолей с приобретенной резистентностью к хемиопрепаратам. Совместное применение цитостатиков - винкристина и эпирубицина с валорфи-ном и фрагментом Р-актина (76-89) показало наличие аддитивности при поочередном, но не совместном добавлении, что указывает на перекрывание эффектов цитостатиков и пептидов при одновременном добавлении. In vivo, на модели рака молочной железы мыши, валорфин снижал темп роста опухоли с одной стороны, и усиливал действие эпирубицина при совместном применении, с другой стороны: было показано уменьшение объема опухоли на 25% и увеличение выживаемости животных более чем в 2 раза по сравнению с животными, получавшими только эпирубицин. Полученные данные свидетельствуют о возможности применения ингибирующих компонентов тканеспецифических пептидных комплексов в качестве составляющих противораковых препаратов.

ВЛИЯНИЕ ФЛОГЕНЗИМА НА ОБРАЗОВАНИЕ КОЛЛАГЕНА ПРИ МЕТАБОЛИЧЕСКОМ ПОВРЕЖДЕНИИ МИОКАРДА

Скроманис М.Я., Пуле Э.А., Зейбартс М.В., Пурвиньш И.В., Скутелис А.П.

Институт фармакологии, Латвийская Медицинская академия (AML), Рига, Латвия

Введение. В зоне воспалительного процесса концентрируется большое количество иммунокомпетентных клеток. Цитокины оказывают влияние на миграцию фибробластов и синтез протеинов, а также способствует образованию колла-генных волокон и процесса рубцевания.

Цель и задачи. Целью наших исследований было изучение влияния флогензима на образование коллагенных волокон после повреждающего действия больших доз адреналина.

Материалы и методы. Животным (белым крысам) 14 дней вводили флогензим в дозе 100 мг/кг. На 15й день ввели адреналин в дозе 2,5 мг/кг, а затем ещё продолжали 14 дней введение флогензима. Потом крыс декапитировали для дальнейших морфологических и иммуногистологических исследований. Полученние образцы из сердечной мыщцы окрашивали гемотоксилином, эозином и модиффицированной окраской методом Вейгерта.

С иммунногистохимическим методом в образцах определяли Р тромбоцитарный фактор роста (TGFP) (Иммунногистологические исследования проводились в Онкологическом институте Венского университета (Австрия) и в клинике Иммунологии и радиологии Храдец - Краловской Военно

- Медицинской академии (Чехия).

Обсуждение результатов. Обнаружено, что флогензим в значительной мере тормозит развитие коллагенных волокон и склеротизацию миокарда после повреждающего действия адреналина. Выявлено достоверное уменьшение (р< 0,001) втромбоцитарного фактора роста (TGFP) по сравнению с контрольной группой.

Торможение образования коллагенных волокон может быть обусловлено уменьшением Р тромбоцитарного фактора роста (TGFP), элиминацией которого могут ускорить про-теолитические энзимы, которых содержит флогензим.

Заключение. Флогензим уменьшает образование колла-геных волокон и тормозит спаечный процесс.

ВЛИЯНИЕ ЦИТОКИНОВ НА ЛИМФОЦИТАРНО-ТРОМБОЦИТАРНУЮ АДГЕЗИЮ

Солпов А.В., Витковский Ю.А., Кузник Б.И.

ГОУ Читинская государственная медицинская академия, Россия

В настоящее время широко изучаются межклеточные взаимодействия, в основе которых лежат механизмы сигнализации, опосредуемые цитокинами. Кооперацию клеток с участием ряда интегринов, регулируют хемокины, цитокины, факторы роста, производные радикалов кислорода, вызывающие усиленную коагуляцию и репарацию тканей в месте их повреждения. Ранее нами была продемонстрирована способность лимфоцитов, несущих CD3 и CD4 маркеры спонтанно образовывать коагрега-ты с тромбоцитами. Показано, что культивируемые лимфоциты in vitro в присутствии интерлейкина 2 (IL-2) увеличивали в 4 раза свою способность адгезировать кровяные пластинки. Стимуляция лимфоцитов IL-2 повышала адгезивную активность CD4 несущих клеток и индуцировала у CD 16 лимфоцитов образовывать клеточно-тромбоцитарные коагрегаты.

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния про-воспалительных цитокинов интерлейкина (IL)-l бета, IL-8, фактора некроза опухолей (TNF) альфа, противовоспалительных 1L-4,1L-10, а также интерферона (IFN) гамма и установить роль молекул межклеточной адгезии-1 (ICAM-1) в лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии in vitro.

Материалы и методы. Выделенные в градиенте фикол-урографин (плотность 1,077) и отмытые лимфоциты в концентрации 2-3 х 106 клеток в 1 мл, а также цельную гепаринизиро-ванную кровь здоровых доноров инкубировали с рекомбинантными цитокинами. Конечная концентрация цитокинов составляла для IL-1Р— 2 нг/мл, 1L-2 - 2 нг/мл, IL-8 - 2 нг/мл, TNFa - 2 мг/мл, 1L-4-1 мг/мл, 1L-10- 1 мг/мл, IFNy- 1 мг/мл. Контролем служили интактные клетки, а также клетки, инкубируемые с моноклональными антителами (МкАТ) против 1L-2 или ICAM-1. Время инкубации культуры выделенных лимфоцитов с 1L-2, МкАТ против 1L-2 и 1САМ-1 составляло 4 часа, а цельной крови с цитокинами - 2 часа. К пулу интактных, а также предварительно инкубированных с цитокинами, МкАТ против 1L-2 или ICAM-1 лимфоцитов, добавляли аутологичную плазму, богатую тромбоцитами в объемном соотношении 2:1. Смесь инкубировали в течение 30 минут, после чего определяли процент коагрегатов лимфоцитов с тромбоцитами.

Результаты исследований. Обнаружено, что предварительная инкубация клеток с моноклональными антителами (МкАТ) против ICAM-1 практически полностью устраняла способность лимфоцитов вступать в контакт с кровяными пластинками. Так, выявлено, что после обработки моноклональными антителами только 1±0,1% клеток образовывали коагрегаты с тромбоцитами. Внесение в среду роста лимфоцитов интерлейкина-2 на фоне МкАТ против 1САМ-1 не повышало адгезивную функцию инкубируемых клеток. Также было установлено, что после 2-х часовой инкубации гепаринизированной цельной крови здоровых доноров с IL-1P в 2,5 раза увеличивалось число лимфоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов. Другие провоспалительные цитокины - 1L-8 и TNFa, не изменяли способность лимфоцитов образовывать коагрегаты с тромбоцитами. Однако, противовоспалительные цитокины 1L-4 и 1L-10 ингибировали лимфоцитарно-тромбоцигарную адгезию. Добавление этих цитокинов в культуру цельной крови, полностью предотвращало формирование лим-фоцитарно-тромбоцитарных коагрегатов. Подобный эффект наблюдался при добавлении IFNy.

Данные исследования показывают, что цитокины играют важную роль в регуляции лимфоцитарно-тромбоцитарного взаимодействия. Возможно, что их влияние имеет значение в

миграции лимфоцитов через поврежденную сосудистую стенку и в формировании тромба. Эти результаты также подтверждают гипотезу об участии тромбоцитов в иммунном ответе.

Таким образом, лимфоциты способны к образованию коагрегатов с тромбоцитами. Лигандом лимфоцитарно-тром-боцитарной адгезии выступают молекулы межклеточной адгезии-1 (1САМ-1). Адгезивную активность лимфоцитов по отношению к тромбоцитам стимулируют интерлейкины 1(3 и 2. Ингибиторами лимфоцитарно-тромбоцитарной адгезии являются 1Ь-4, 1Ь-10 и 1РЫу. Интерлейкин-8 и ТОТа не оказывают влияния на лимфоцитарно-пластиночный контакт. Антитела против 1Ь-2 и 1САМ-1 тормозят взаимодействие лимфоцитов и тромбоцитов.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЧЕЛОВЕЧЕСКИХ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЛИНИЙ ЕА.НУ926 И Ш04

Старикова Э.А.. Соколов Д.И., Амчиславский Е.И., Барышников А.Ю., Полосухина Е.Р., Фрейдлин И.С.

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

В последние годы большое внимание уделяется изучению участия эндотелиальных клеток (ЭК) в процессах воспаления, иммунного ответа, ангиогенеза. Изучение этих процессов осуществляется с использованием общепринятой модельной системы первичной культуры человеческих эндотелиальных клеток вены пупочного канатика (НиУЕС). Использование перевиваемых линий ЭК обеспечивает стандартизацию и упрощение модельной системы. В качестве такой модели наиболее широко используются клетки перевиваемых линий ЕСУ304 и ЕА.Ну926. Перевиваемая линия ЕСУ304 человеческих эндотелиальных клеток получена в результате спонтанной трансформации НиУЕС. Несмотря на наличие у клеток этой линии большинства функциональных и фенотипических характеристик ЭК весной 2000 года была выявлена генетическая идентичность клеток линии ЕСУ304 с клетками линии Т-24 карциномы мочевого пузыря человека. Перевиваемая линия ЕА.Ьу926 была получена в 1983 г. путем гибридизации первичной культуры Н1ГУЕС с клетками линии человеческой карциномы А549. Клетки этой линии были ранее подробно охарактеризованы на основании анализа их генотипа и фенотипа. Они экспрессируют основные поверхностные молекулы эндотелиальных клеток: С031, СБ34, СБЗб, Р- и Е-селектины, 1САМ-1,1САМ-2, УСАМ-

1, а так же фактор Виллебранда (у\¥1).

Целью настоящего исследования была сравнительная оценка влияния провоспалительных цитокинов на экспрессию адгезионных молекул 1САМ-1 человеческими эндотелиальными клетками вены пупочного канатика и перевиваемыми человеческими эндотелиальными клетками линий ЕСУ304 и ЕА.Ну926. Уровень экспрессии 1САМ-1 на поверхности клеток линий ЕА.Ну926 и ЕСУ304 определяли с помощью клеточной модификации иммуноферментного анализа (Се11ЕЫ5А).

Сопоставление собственных и литературных данных по адгезионным молекулам 1САМ-1 показало, что клетки линии ЕА.Ну926 отличаются очень низкой спонтанной экспрессией этих молекул, тогда как клетки линии ЕСУ304 имеют несколько более высокий уровень спонтанной экспрессии 1САМ-1 по сравнению с НиУЕС.

Форболмиристатацетат (ФМА) усиливает экспрессию молекул 1САМ-1 и у первичной и у перевиваемых линий, при этом его действие наиболее выражено у клеток линии ЕСУ304.

Фактор некроза опухолей-а (Т1МРа) усиливает экспрессию молекул 1САМ-1 у клеток линий ЕСУ304, ЕА.Ну926 и у НиУЕС. При этом максимальный уровень экспрессии молекулы 1САМ-1 у клеток линии ЕА.Ну926 достигается при действии более низких концентраций ТЫРа (25-50 ЕД\мл), чем у клеток линии ЕСУ304 (400-800 ЕД\мл).

Интерферон-у (1ЕНу) примерно в два раза усиливает экспрессию молекул 1САМ-1 и у первичной линии НиУЕС и у перевиваемых линий ЕСУ304 и ЕА.Ну926. Сочетание цитокинов ТОТсс и 1Р1Чу аддитивно усиливает экспрессию 1САМ-

1 на клетках линий ЕА.Ну 926, ЕСУ304 и НиУЕС.

Гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (вМ-СЭР) в широком диапазоне концентраций т не влияет на экспрессию молекул 1САМ-1 клетками НЦУЕС и клетками линии ЕА.Ну926, тогда как по нашим данным при действии на клетки линии ЕСУ304 ОМ-СЭР в высоких концентрациях достоверно снижал экспрессию молекул 1САМ-1.

Полученные нами данные, а также литературные данные свидетельствуют о некоторых функциональных и фенотипических особенностях клеток перевиваемых линий в отличие от человеческих эндотелиальных клеток вены пупочного канатика. При этом клетки перевиваемой линии ЕА.Ну926 имеют фенотипические функциональные и генетические характеристики, свидетельствующие об их эндотелиальной природе, что позволяет использовать их в качестве модели эндотелиальных клеток.

Работа поддержана грантом РФФИ №00-04-48064.

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РЕЗИСТЕНТНЫХ К СА2+-И0Н0Ф0РУ - ИОНОМИЦИНУ - С04+ Т-КЛЕГОК ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Хайдуков С.В.. Холоденко И.В., Литвинов И.С.

Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Резистентная к Са2+-ионофору - иономицину - популяция СЕ)4+ Т-клеток периферической крови человека (ПКЧ) представлена в основном покоящимися Т-клетками памяти. Сравнительное изучение функциональных свойств этой популяции и СЭ4+ Т-клеток ПКЧ является основной целью представленной работы.

В качестве неспецифических стимулов были использованы “классические” митогены: конканавалин А (КонА), фитогемаг-глютинин (ФГА) и смесь форбол-миристат-ацетата (ФМА) с иономицином. Пролиферативный ответ на КонА зарегистрирован только для Т-клеток ПКЧ. В тех же условиях иономи-цин-резистентные (ИР) Т-клетки не отвечают на КонА. Данное отличие, скорее всего, связано с различным связыванием этого лектина с поверхностью наивных Т-клеток и Т-клеток памяти. Ответ ИР Т-клеток на ФГА и смесь ФМА с иономицином, как правило, ниже, чем Т-клеток ПКЧ. Как и следовало ожидать, ответ ИР Т-клеток на антиген (РРО) в несколько раз выше, чем Т-клеток ПКЧ. Следовательно, выделенные ИР Т-клетки сохраняют способность к усиленному пролиферативному ответу на антиген, а эта популяция в значительной мере обогащена Т-клетками памяти. (Данное заключение хорошо согласуется с результатами фенотипического анализа.).

Способность к продукции цитоктнов является еще одной важнейшей характеристикой СЭ4+ Т-клеток. При стимуляции ФМА/иономицин в ПКЧ и в ИР популяции появляются СБ4+ клетки, продуцирующие 1Ь-2 и ШЫ-у. Ответ СЭ4+ Т клеток ПКЧ и ИР клеток на стимуляцию мАт к СОЗ-ТсЯ показал способность этих популяций продуцировать не только 1Ь-2 и ШЫ-у, но и 1Ь-4. Следовательно, выделенные ИР Т-клетки сохраняют способность к активации и продукции цитокинов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект 00-04-48800.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ФРАГМЕНТОВ МОЛЕКУЛЫ ИММУНОТОКСИНА У1.-БАРНАЗА ВЛИЯЕТ НА ЕЕ КОНФОРМАЦИОННУЮ СТАБИЛЬНОСТЬ

Цыбовский Я.И.. Кедров А.А., Одинцов С.Г., Кравчук З.И., Стремовский О.А.*, Баландин Т.Г.*, Деев С.М.*, Марцев С.П.

Институт биоорганической химии НАН Беларуси, Минск, Беларусь,

Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Введение. Иммунотоксины - агенты, которые все шире применяются для терапии рака, представляют собой “химерные” белки, содержащие как минимум два домена, гетерологичных по природе. Зачастую, узнающий, цитотоксический и другие фрагменты иммунотоксинов включают рекомбинантные домены белков, изначально экспрессируемых организмами, принадлежащим к разным биологическим царствам. С другой стороны, важнейшим требованием к структуре иммунотоксина является наличие функциональной активности всех его компонент, связанной с неизменностью их пространственной структуры в результате слияния нескольких доменов. Вопрос взаимодействия доменов в составе единой химерной молекулы в настоящее время изучен недостаточно.

Цель работы. Изучить эффеты, связанные с объединением двух гетерологичных доменов в составе единой молекулы белка, представляющей собой рекомбинантный иммунотоксин УЬ-барназу, сконструированный на основе узнающего УЬ домена антитела Р11 мыши, направленного к селезеночному ферритину человека, и барназы, бактериальной РНКазы из В. ату1оИцие/аает. Исследовать конформаци-онную стабильность составляющих доменов физико-химическими методами.

Материалы и методы. Рекомбинантный белок УЬ-барна-за экспрессировался в Е. соН и очищался при помощи афинной хроматографии. Вторичная структура доменов исследовалась при помощи метода КД. Изучение третичной структуры про-водилость по спектрам флуоресценции, собственной и связанного зонда АНС. С помощью дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) была изучена стабильность УЬ домена и барназы в составе молекулы УЬ-барназы.

Основные результаты. Вторичная и третичная структуры изученного потенциального иммунотоксина являются типичными для полностью фолдированных белков. Отсутствие связывания гидрофобного зонда АНС свидетельствует о полном фолдинге без экспонирования гидрофобных участков на поверхность молекулы. Однако данные КД в дальней ультрафиолетовой области, а также характер изменения флуоресцентных спектров и интенсивности связывания АНС в диапазоне pH 2.0-10.0 свидетельствуют об измененной конформации доменов-составляющих УЬ-барназы по сравнению с индивидуальными УЬ доменом и барназой. Температурная стабильность барназы в составе иммунотоксина по данным ДСК существенно снижена (с 55°С до 47°С), в то время как температура и энтальпия денатурации УЬ-домена не изменились. Стабильность молекулы в целом остается достаточно высокой (энтальпия денатура-циисоставляет 4.5 кал/г).

Заключение. В результате слияния двух гетерологичных доменов в составе молекулы УЬ-барназы произошла частич-

ная дестабилизация цитотоксического фрагмента, которая, с позиции конформационной стабильности, не лимитирует использование конструкции в целом в качестве иммунотоксина. Полученный эффект объясняется взаимодействием парных доменов барназы в составе димерной молекулы рекомбинантного белка.

ИММУНОФИЗИОЛОГИЯ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ РАЗВИТИЯ

Черешнев В.А., Юшков Б.Г.

Екатеринбургский филиал Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН

Уже давно в научной литературе распространено мнение, что функции иммунной системы значительно шире защитной и цензорной. Однако лишь в последние годы накоплены достаточно убедительные данные, позволяющие поставить вопрос о ее месте в регуляции, наряду с нервной и эндокринной, большинства физиологических функций организма. С этих позиций вполне оправдано выделение иммунофизиологии в качестве самостоятельного раздела физиологии.

В настоящее время уже общепризнанно, что иммунная и эндокринная системы перекрестно взаимодействуют, используя сходные или тождественные лиганды и рецепторы.

Вероятно в поддержании гомеостаза и при действии на организм различных экстремальных факторов все три системы действуют как единое целое, дополняя и дублируя друг друга. Однако, в зависимости от природы воздействия в регуляции адаптивных и компенсаторных реакций ведущей становится одна из них.

Для объяснения взаимодействия трех систем в условиях патологии предложена гипотеза, рассматривающая развитие реакции организма на повреждение в три фазы: немедленную или нервную, промежуточную или иммунную и позднюю или эндокринную. Такой подход дает основание авторам рассматривать реакции трех систем в качестве различных форм реагирования организма на повреждение, конечный результат которого всегда одинаков - воспаление (АПег М.А. е! а1, 2001).

В современной литературе сформировалось четкое представление о том, что нервная и эндокринная системы модулируют функции иммунной системы с помощью нейротран-смиттсров, нейропептидов и гормонов, а иммунная система взаимодействует с нейроэндокринной системой с помощью цитокинов, а также других иммунопептидов и иммунотрансмиттеров. Существует предположение, что одним из связующих звеньев между этими системами служат пептиды тимуса, индуцирующие развитие Т-клеток (ОевсЬаих Р. с! а1., 1987; Оагс1еппе М., Эаушо \¥. 1997).

В последние годы большие надежды возлагают на опиатные нейропептиды в качестве посредников между нервной, эндокринной и иммунной системами.

Признание иммунной системы в качестве равноценной с нервной и эндокринной регуляторной системами, обеспечивающими гомеостаз организма, неизбежно ставит вопрос об основных перспективных направлениях развития иммунофизиологии. Среди них в первую очередь видятся следующие: 1) дальнейшая расшифровка и детализация механизмов регуляции иммунной системой неиммунных функций организма, 2) не менее важным представляется вопрос соотношение между системами в возрастном аспекте, 3) вероятно ждет своего разрешения проблема становления трех систем в онтогенезе и значимость каждой из них в различные его периоды, 4) эволюционные вопросы формирования механизмов взаимодействия трех систем также могут представить интерес для исследователей, 4) для медиков особый интерес представляет взаимосвязь меж-

ду системами в условиях патологии и при адаптации к экстремальным воздействиям, 5) вероятно, вполне оправданным может быть введение понятия “иммунологическая конституция” и выделение ее отдельных типов.

ИММУНОЛОГИЧЕСКОЕ РАСПОЗНАВАНИЕ ПОЛИПЕПТИДОВ ИЗ БЕЛКОВ ASPERGILLUS FUMIGATUS, ПОЛУЧЕННЫХ ПР0ТЕ0ЛИ30М

Шевченко М.А.. Свирщевская Е.В.

Институт биоорганической химии

им.М.М.Шемякина и Ю.В. Овчинникова, РАН,

Москва

Целью данной работы являлось сравнение иммуноген-ности разных доз белка из грибка Aspergillus fumigatus Asp f

3, вводимого мышам без адъюванта, и полипептидов из этого же белка, полученных протеолизом. По шесть групп мышей линий BALB/c и СВА иммунизировали 500, 50 или 5 мкг на мышь белка Asp f 2 (группы 1-3) или его гидролизатом в тех же концентрациях (группы 4-6) внутрибрюшинно в фосфатном буфере. Иммунизацию проводили через день, всего пять инъекций по 100, 10 и 1 мкг на инъекцию, и забирали кровь раз в неделю в динамике иммунного ответа. Условия протеолиза подбирали таким образом, чтобы расщепить 95-98 % белка, что контролировали с помощью электрофореза. Протеолиз проводили трипсином или дуоденазой, ферментом, обладающим двойной активностью - трипсина и хемотрипсина. Как в том, так и в другом случае основную долю (80-90%) составляли пептиды размером меньше 2 кДа, около 2-10% составляли полипептиды, размером 7-10 кДа. По окончанию гидролиза реакцию останавливали коктейлем ингибиторов. Титр антител определяли методом ИФА, где в качестве подложки использовали белок Asp f 3. Аффинность антител определяли по константе диссоциации методом конкурентного ИФА. Через неделю после окончания иммунизации продукция антител к Asp f 3 появилась в группах 500, иммунизированных белком или полипептидами, причем ответ на гидролизат был лишь незначительно ниже, что выражалось в снижении доли высокоаффинных антител, но не титров сывороток. Через 2 недели антитела к Asp f 3 регистрировались в сыворотках мышей всех групп. Общим отличием иммунного ответа у мышей, иммунизированных полипептидами, явилось снижение доли высокоаффинных антител практически при равных титрах сывороток. Различие между группами 500, 50 и 5 состояло как в аффинности, так и в титрах сывороток и было прямо пропорционально дозе введенного антигена. Анализ тонкой специфичности проводили методом пептидного ИФА, где в качестве подложки использовали синтетические пептиды, перекрывающие 85 % последовательности белка Asp f 3. Было показано, что доминантный В клеточный эпитоп, соответствующий пептиду 5 белка Asp f 3, сохраняется при иммунизации гидролизатом, несмотря на потерю белком конформации после гидролиза. Анализ длительности ответа показал, что затухание продукции антител происходит обратно пропорционально интенсивности иммунного ответа и, соответственно, дозе введенного антигена. В группах 500 и 100 продукция антител наблюдалась спустя 4 месяца. Таким образом, показано, что белок, введенный без адъюванта, прекрасно распознается иммунной системой даже в очень низких концентрациях, по крайней мере, если он вводится несколько раз. Кроме того, пул низкомолекулярных полипептидов из белка также прекрасно распознается иммунной системой без адъювантов, в отличие от отдельных пептидов.

CXCL16 - ХЕМОКИН И СКЭВЕНДЖЕР РЕЦЕПТОР, ЭКСПРЕССИРОВАННЫЙ В АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ БЛЯШКАХ И РЕГУЛИРЕМЫЙ ИНТЕРФЕРОНОМ-у

Юрий Шейкин1'2. Дирк М. Вуттге1, Ксингхуа Чжоу1, Вероника Стемме1, Ульф Хедин1, Стен Стемме1, Горан Ханссон1, Аллан Сихо1

' Центр Молекулярной Медицины и Департаменты Медицины и Хирургии (У.Х.), Каролинский госпиталь, Каролинский институт, Стокгольм, Швеция,

Отдел Иммунологии, Институт Экспериментальной Медицины, Санкт-Петербург, Россия

Появляется все больше доказательств, что атеросклероз является воспалительным заболеванием. Это утверждение подкрепляется тем фактом, что активированные макрофаги и Т-клетки, рекрутированные при участии адгезионных молекул и хемоаттрактантов, являются важными компонентами атеросклеротических бляшек. На сегодняшний день нескольким хемокинам приписывается роль ключевых медиаторов атеросклероза. Недавно был описан новый хемокин из СХС семейства - CXCL16. Он экспрессирован как в секретирумой, так и в трансмембранной формах и регулирует миграцию активированных субпопуляций Т-клеток: Тх-1 и Те-1. CXCL16 связывается с рецептором CXCR6/Bonzo, который так же является корецептором для проникновения в клетку вируса иммунодефицита человека. Нуклеотидная последовательность CXCL16 высоко гомологична последовательности недавно клонированного скэвенджер рецептора SR-PSOX.

Целью нашего исследования было определить экспрессию CXCL16 в мышиных и человеческих атеросклеротических поражениях, исследовать регуляцию его экспрессии в моноцитомакрофагоподобных клеточных линиях и изучить его роль в накоплении липопротеинов этими клетками.

Полимеразная цепная реакция в реальном времени показала повышенные уровни CXCL16 и CXCR6 мРНК в атероскле-ротически пораженных участках аорт Аро-Е-дефицитных мышей по сравнению с нормальными участками у контрольных животных. Повышенные уровни CXCL16 и CXCR6 мРНК наблюдались так же в бляшках из человеческой сонной артерии, по сравнению с непораженными контрольными сосудами. Им-муногистохимическое окрашивание показало присутствие белка CXCL16 в участках бляшек от Аро-Е-дефицитных мышей, содержащих макрофаги (CDllb*) и Т-клетки (CD4+). Инъекция IFN-y Аро-Е-дефицитным мышам приводила к увеличению экспрессии CXCL16 в бляшках, что коррелировало с количеством макрофагов в тех же участках. При этом экспрессия CXCL16 не повышалась в непораженных участках сосуда.

Эксперименты in vitro показали повышенную экспрессию мРНК CXCL16 в мышиных (J774) и человеческих (ТНР-1) моноцитомакрофагоподобных клеточных линиях после их обработки IFN-y. В то же самое время обработка IFN-y увеличивала захват флюоресцентно-меченных окисленных липопротеинов низкой плотности (ок-ЛНП) клетками этих линий, что было оценено с помощью проточной цитометрии.

Наши данные позволяют предположить, что недавно идентифицированный хемокин CXCL16 выполняет не только хемотак-тическую функцию, привлекая Т-клетки в образующиеся бляшки, но так же и функцию скэвенджер рецептора, связывающего и интернализирующего ок-ЛНП. Эта находка особенно интересна если учесть тот факт, что экспрессия других макрофагальных скэвенджер рецепторов (SRA I, II и CD36) понижается при обработке IFN-y, что, в свою очередь, идет в разрез с установленной ролью IFN-y как проатерогенного цитокина. Наши данные, по крайней мере частично, объясняют это несоответствие, показывая что 1FN-у усиливает экспрессию CXCL16/SR-PSOX.

CXCL16 IS AN INTERFERON-GAMMA REGULATED CHEMOKINE AND SCAVENGER RECEPTOR EXPRESSED IN ATHEROSCLEROTIC LESIONS

Yuri Sheikine1,2. Dirk M. Wuttge1, Xinghua Zhou1, Veronika Stemme1, Ulf Hedin1, Sten Stemme1, Goran K. Hansson1, Allan Sirsjo1

Center for Molecular Medicine and Departments of Medicine and Surgery (U.H.), Karolinska Hospital, ^Carolinska Institutet, Stockholm, Sweden,

Department of Immunology, Institute of Experimental Medicine, St.-Petersburg, Russia

A growing body of evidence implies that atherosclerosis is an inflammatory disease. This statement is supported by the fact that activated macrophages and T cells, recruited by adhesion molecules and chemoattractants, are prominent components of atherosclerotic lesions. Several chemokines have so far been implicated as key mediators in atherosclerosis. A novel chemokine from CXC family - CXCL16 has recently been discovered. It is expressed both in soluble and transmembrane forms and guides migration of activated Th 1 and Tel T cell subsets. CXCL16 ligates CXCR6/Bonzo, which is also a co-receptor for the human immunodeficiency virus. CXCL16 is highly homologous in nucleotide sequence to recently cloned scavenger receptor SR-PSOX.

The aim of our study was to determine CXCL16 expression in mouse and human atherosclerotic lesions, to investigate the regulation of its expression in monocytic cell lines and to study its role in lipid accumulation by these cells.

Real-time polymerase chain reaction showed elevated levels of CXCL16 and CXCR6 mRNA in aortic atherosclerotic lesions from Apo-E-deficient mice, compared to control mice. Elevated levels of CXCL16 and CXCR6 mRNA were also observed in lesions from human carotid arteries, compared to non-atherosclerotic arteries. Im-munohistochemistry showed that CXCL16 protein is present in macrophage (CD1 lb+)- and CD4+ T-cell-rich regions of atherosclerotic lesions from apo-E-deficient mice. IFN-gamma treatment of Apo-E-deficient mice led to up-regulation of CXCL 16 expression in the lesions. This expression correlated with the number of macrophages in the lesions. Non-atherosclerotic parts of vessels showed no up-regulation of CXCL 16.

In vitro experiments revealed elevated expression of CXCL 16 mRNA in mouse (J774) and human (THP-1) monocytic cell lines after treatment with IFN-gamma. At the same time IFN-gamma treatment increased uptake of fluorescently labeled ox-LDL by these cell lines, estimated by flow cytometry.

Taken together our data suggest that newly discovered chemokine CXCL 16 does not only fulfill a chemotactic function by attracting T-cells to forming lesions, but also acts as a scavenger receptor, which is able to bind and take up ox-LDL. This finding is especially interesting, since other macrophage scavenger receptors (SRA I, II and CD36) are downregulated by IFN-gamma treatment. This, in turn, appears to contrast with the established, proatherogenic effect of IFN-gamma. Our finding may, at least partly, explain this by demonstrating that IFN-gamma upregulates CXCL16/SR-PSOX.

ИЗМЕНЕНИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ АДРЕНАЛИНОВОМ СТРЕССЕ НА ФОНЕ БЛОКАДЫ а- И Р-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ

Шилов Ю.И., Гилёва Н.А.. Таскаев В.П.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермский государственный университет, Пермь, Россия

Ранее нами было показано, что направленность изменений функций перитонеальных фагоцитирующих клеток в условиях

адреналинового стресса при блокаде с^-, ос2- и Р-адренорецепто-ров прямо зависит от типа блокируемых рецепторов.

Цель работы - анализ эффектов антагонистов а-, 0С2- и |3-адренорецепторов в условиях адреналинового стресса in vivo на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови.

Материалы и методы. Для экспериментального моделирования острого фармакологического стресса у крыс-самцов популяции Wistar использовали введение высокой дозы адреналина (1 мг/кг массы тела подкожно). Крысам 1-й группы вводили только адреналин. Животные 2-й, 3-й и 4-й групп были подвергнуты аналогичному воздействию в условиях блокады различных типов ад-ренорецепторов специфическими антагонистами, которые вводились за 1 ч до инъекции адреналина с интервалом 3 ч двукратно подкожно. Для блокады Р-адренорецепторов (2-я группа) вводили пропранолола гидрохлорид по 5 мг/кг массы тела на инъекцию, для блокады а2-адренорецепторов (3-я группа) - йохимбина гидрохлорид по 5 мг/кг, а о^-адренорецепторов (4-я группа) - празози-на гидрохлорид по 1 мг/кг. Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали в микротестах по отношению к формалинизиро-ванным эритроцитам барана. Контролем служили показатели объединенного исходного фона. Статистический анализ результатов проведен с использованием непарного /-критерия Стьюдента.

Основные результаты. Нейтрофильный лейкоцитоз развивался у животных во всех фуппах, достигая максимального значения через 6 ч после введения адреналина, но только у крыс 2-й и 3-й групп он сопровождался увеличением незрелых (палочкоядерных и юных) нейтрофилов. У животных, получавших только адреналин, достоверное увеличение нейтрофилов наблюдалось через 3 и 6 ч после его инъекции и к 24 ч возвращалось к исходному уровню. На фоне блокады всех типов адренорецепто-ров нейтрофильный лейкоцитоз был более выраженным и сохранялся через 24 ч. Изменения интегральных относительных показателей нейтрофильного фагоцитоза (фагоцитарного числа, процента фагоцитоза) в условиях изолированного введения адреналина (1-я группа) характеризовались их снижением с максимумом через 3 и 6 ч после инъекции гормона, в то время как абсолютные параметры (число захваченных объектов и участвующих в фагоцитозе нейтрофилов в расчете на 1 мм3 крови) повышались с максимумом через 6 ч. Изменения нейтрофильного фагоцитоза во 2-й, 3-й и 4-й группах зависели от типа блокируемых адренорецепторов. Через 1 ч после введения антагонистов (до инъекции адреналина) наблюдались противоположные эффекты. Блокада Р-адренорецепторов приводила к увеличению всех интегральных относительных показателей нейтрофильного фагоцитоза, а а(- и а2-адренорецепторов - к их снижению. В последующем эффекты блокады а2-адренорецепторов сохранялись и после введения адреналина весь период исследования, в то время как при блокаде с^-адренорецепторов относительные показатели нейтрофильного фагоцитоза через 3,6 и 24 ч не отличались от контроля. Введение адреналина в условиях блокады Р-адре-норецепторов приводило к нивелированию стимулирующего эффекта пропранолола с последующим снижением относительных параметров фагоцитоза через 3, 6 и 24 ч. Изменения абсолютных параметров нейтрофильного фагоцитоза во 2-й, 3-й и 4-й группах во многом повторяли изменения абсолютного числа нейтрофилов. С учетом ранее полученных данных о стимулирующем влиянии глюкокортикоидов на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови [Шилов Ю.И., Ланин Д.В., 2001] и выявленного в данном эксперименте увеличения массы надпочечников во 2-й, 3-й и 4-й группах через 24 ч можно предполагать, что изменения абсолютных показателей нейтрофильного фагоцитоза в этих группах после введения адреналина опосредуются через повышение продукции глюкокортикоидов.

Заключение. Таким образом, изменения фагоцитарной активности нейтрофилов в условиях фармакологического

стресса, вызванного введением адреналина, опосредуются как через р-, так и а-адренорецепторы.

КОМПЛЕКСНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА НА ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ, ФОРМИРОВАНИЕ АНТИТЕЛООБРАЗУЮЩИХ КЛЕТОК И ГИПЕРЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ЗАМЕДЛЕННОГО ТИПА IN VIVO

Ширшев С.В., Бахметьев Б.А., Горбунова O.J1.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Во время беременности иммунная система матери испытывает значительные влияния со стороны репродуктивных гормонов, в том числе и основного гормона беременности хорионического гонадотропина (ХГ). Известно, что наряду с регуляцией стероидогенеза плаценты и плода гормон активно участвует в контроле иммунных процессов. В то же время, его иммуномодулирующие эффекты прямо зависят от уровня женских половых стероидов.

Цель работы комплексное изучение влияния различных физиологических доз хорионического гонадотропина на фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови, формирование антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ).

Материалы и методы. Эксперименты проведены на мышах-самках породы Swiss массой около 20-22 г., которым вводили ХГ подкожно через день в течение 10 суток. ХГ вводили в двух дозах 20 или 200 ME / мышь, соответствующую среднему значению концентрации ХГ в крови беременной женщины на протяжении II -III триместров, и отражающую уровень ХГ на 70 день беременности, соответственно. Для оценки первичного иммунного ответа мышей иммунизировали эритроцитами барана ЭБ в концентрации 2 х 108 в 1 мл внутрибрюшинно на пятые сутки введения гормона. Через четыре дня проводили повторную (разрешающую) иммунизацию. В стопу вводили 2 х 109 ЭБ в 1мл. Через 24 часа животных забивали декапитацией, затем производили оценку уровня прямых АОК (IgM-продуценты) и измеряли толщину сенсобилизированной стопы конечности. Кроме этого, у данных животных определяли парциальный состав и фагоцитарную активность лейкоцитов периферической крови, селезенки и перитонеальной полости.

Основные результаты. Установлено, что инъекции гормона на фоне двойной иммунизации Т-зависимым антигеном приводят к снижению уровня лимфоцитов в крови, селезенке и повышению их в перитонеальной полости. При парциальной оценке лейкоцитов периферической крови наблюдается повышение относительного содержания нейтро-филов. Помимо этого ХГ повышает рост моноцитов в селезенке, с одновременным снижением их в перитонеальной полости. В дозе 200 ME ХГ стимулирует фагоцитарную активность периферической крови, преимущественно за счет активации сегментоядерных нейтрофилов. При этом фагоцитарная активность клеток селезенки и перитонеальной полости не претерпевает изменений. При исследовании процессов формирования АОК в селезенке установлено, что с возрастанием концентрации гормона усиливается его негативный контроль за процессами антителообразования. В то же время на реакцию ГЗТ гормон не оказывает достоверного влияния. Учитывая, что ХГ обладает стероид-регулирую-щей активностью, выявленные системные изменения можно интерпретировать как совместное действие ХГ с половыми стероидами яичников.

Заключение. Таким образом, ХГ и индуцированные им половые стероиды, в условиях одновременной индукции клеточно-опосредованных и гуморальных реакций приводят к системному перераспределению лейкоцитарного пула, сопровождающегося повышением фагоцитарной активности нейтрофилов, не влияя на формирование провосполительных реакций (ТЬ1), с одновременным угнетением гуморального иммунного ответа (ТЬ2).

ТКАНЕВЫЕ БАЗОФИЛЫ ЛИМФОЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОБРАЗОВАНИЙ ГЛОТОЧНОГО КОЛЬЦА

Шульженко Л.В.

Кубанская государственная медицинская академия, Краснодар, Россия

Литература располагает значительным объемом информации о клетках лимфоидного ряда и об эпителиальных структурах лимфоидного глоточного кольца как у человека, так и у лабораторных животных. Об особенностях тканевых базофилов, населяющих эти органы, сведения практически отсутствуют. Между тем, в 1998 г. появились сообщения, что именно тканевые базофилы являются модуляторами иммунного ответа: они сдвигают сообщество Т-клеток в сторону увеличения содержания Т-хелперов второго подтипа, активируют миграцию антигена в лимфоузлы и т.д. (Роїова, Сгігпі, 1998). Вышеизложенное определило цель настоящей работы: изучить у лабораторных животных - крысы и кролика -популяцию тканевых базофилов лимфоэпителиальных образований глотки, которые у этих животных сконцентрированы в мягком небе. Поэтому для достижения поставленной цели объектом исследования служило мягкое небо 15 кроликов и 40 крыс. В процессе исследования был использован комплекс методов цитохимического окрашивания по Шуби-чу. Фиксация материала - жидкость Карнуа.

Сравнительный анализ результатов настоящего исследования с данными ранее нами выполненной работы по изучению тканевых базофилов, расположенных в лимфоузлах крысы, и тканевых базофилов, локализованных в небных миндалинах человека, позволил прийти к следующему заключению.

-Структура лимфоидного образования мягкого неба кролика близка к структуре небных миндалин человека (имеются лимфоидные фолликулы и парафолликулярная лимфоидная ткань). На территории лимфоидных фолликулов у кролика как и у человека тканевые базофилы отсутствуют, обнаруживаются они только в парафолликулярной лимфоидной ткани, но цитохимическая характеристика тканевых базофилов парафолликулярной лимфоидной ткани кролика отличается от характеристики тканевых базофилов небных миндалин человека.

-Структура лимфоидного образования мягкого неба крысы отличается от структуры небных миндалин человека. У крысы определяется только диффузная лимфоидная ткань, лимфоидные фолликулы отсутствуют. На территории диффузной лимфоидной ткани имеются тканевые базофилы, совокупная цитохимическая характеристика которых имеет принципиальное сходство с характеристикой тканевых базофилов, расположенных в парафолликулярной лимфоидной ткани небных миндалин человека.

-По конкретной цитохимической характеристике белоксодержащего биополимера тканевые базофилы диффузной лимфоидной ткани мягкого неба крысы соответствуют тканевым базофилам, расположенным в ее брыжеечных лимфоузлах.