Молекулярные и клеточные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунокоррекции (экспериментальные модели) Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Медицинская Иммунология 2004, Т. 6, № 3-5 © 2004, СПб РО РААКИ

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И КЛЕТОЧНЫЕ ОСНОВЫ ИММУНОРЕГУЛЯЦИИ, ИММУНОДИАГНОСТИКИ И ИММУНОКОРРЕКЦИИ (ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ)

ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ мРНК ЦИТОКИНОВ В ЦНС И СЕЛЕЗЕНКЕ КРЫС С ЭАЭ В УСЛОВИЯХ ВВЕДЕНИЯ БЛОКАТОРОВ NMDA-РЕЦЕПТОРОВ ГЛУТАМАТА

Абдурасулова И.H.. Тарасова Е.А., Житнухин Ю.Л., Гмиро В.E., Клименко В.М.

НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

Рассеянный склероз (PC) является воспалительным, демиелинизирующим заболеванием ЦНС. Экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ) моделирует патологические процессы, происходящие при PC, и широко используется для изучения патогенеза и поиска эффективных путей лечения этого тяжелого заболевания.

Понимание разнонаправленное™ действия про- [фактор некроза опухоли а (TNFa), иптерлейкин-lß (IL-lß)| и противовоспалительных [ IL-10, рецепторный антагонист IL-

1 (IL-lp.a.)| цитокинов и необходимости их сбалансированной продукции ставит вопрос о поиске путей коррекции дисбаланса цитокинов. Существующие на сегодня методы с применением препаратов на основе иптерферонов- недостаточно эффективны и имеют ряд ограничений.

В последние годы выявлено модулирующее действие глутаматергической системы на продукцию и/или высвобождение цитокинов, которая может стать основой новых подходов для коррекции активности цитокиновых систем.

Целью данной работы явилось исследование экспрессии мРНК цитокинов (TNFa, IL-1, IL-10 и IL-lp.a.) в спинном мозге и селезенке крыс с различной тяжестью ЭАЭ после введения блокаторов ионных каналов NMDA-рецеп-торов глутамата.

ЭАЭ вызывали однократной подкожной инокуляцией гомогената гомологичного спинного мозга (ГГСМ) в

полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) у самок крыс Вистар весом 170-190 гр. Блокаторы NMDA-рецепторов глутамата - амантадип и мемаптин вводили внутрибрюшипно в дозе 20 мг/кг со 2 по 16 день после индукции ЭАЭ (д.п.и.). Экспрессию мРНК цитокинов определяли методом обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией на 7, 14 и 30 д.п.и.

Инокуляция ГГСМ вызывала у крыс Вистар развитие заболевания различной тяжести, которая снижаласьпосле введения блокаторов NMDA-рецепторов глутамата (таблица).

Исследование экспрессии мРНК цитокинов в клетках селезенки животных с индуцированным ЭАЭ после курсового введения амантадина или мемаптина показало наличие экспрессии мРНК всех цитокинов независимо от наличия заболевания и его тяжести, как и у животных без введения препаратов. Ранее нами показано, что в этих условиях уровень циркулирующих в крови цитокинов подавляется. То есть, в клетках иммунной системы протектив-ное действие блокаторов NMDA-рецепторов может осуществляться па уровне трансляции. В спинном мозге больных крыс на пике заболевания (14 д.п.и.) мы также выявили картину аналогичную той, что наблюдалась у животных без введения блокаторов: при наличии легкого течения заболевания выявлялась экспрессия мРНК только одного провоспалительного цитокина, при более выраженной симптоматике - обоих нровоспалительных цитокинов. Кроме того, в спинном мозге мы обнаружили экспрессию мРНК TNF у животных без клинических симптомов как в индуктивную фазу (7 д.п.и.), так и у пеболевших и выздоровевших животных па 33 д.п.и. Этот факт согласуется с имеющимися в литературе данными о двойственной роли TNF . Экспрессия мРНК TNF , выявленная нами в спинном мозге крыс при отсутствии клинических симптомов ЭАЭ, позволяет предположить, что блокаторы NMDA-рецепторов глутамата модулируют переключение внутрикле-

ТАБЛИЦА. ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО ТЕЧЕНИЯ ЭАЭ В УСЛОВИЯХ БЛОКАДЫ NMDA-ГЛУГАМАТНЫХ РЕЦЕПТОРОВ АМАНТАДИНОМ И МЕМАНТИНОМ (20 МГ/КГ)

Показатели тяжести заболевания ЭАЭ+физ. р-р ЭАЭ+амантадин ЭАЭ+мемантин

Количество заболевших крыс (%) 91,3% 64,3 % 78,8 %

Число тяжело болевших крыс (%) 52,9 % 44,4% 42,7 %

Летальность (%) 14,8 0 8,3

Латентный период (сут) 10,6±2,4 14,2+3,6** 14,0±3,4*

Максимальный КИ (баллы) 3,4±0,3 1,8±0,2** 2,2±0,4*

Суммарный КИ (баллы) 28,6±0,7 16,7±0,6* 23,4±0,8

Длительность заболевания (сут) 21,4±1,8 10,6±0,4* 11,1 ±0,6*

Число животных в группе 90 90 60

* - Р<0,05; ** - Р< 0,01

точных путей сигнальной транедукции, опосредуемых TNF , с иейротоксичсских на нейропротективные.

Работа поддержана грантом РФФИ №02-04-49595

ИЗМЕНЕНИЕ АНТИБАКТЕРИАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КРОВИ ПОД ВЛИЯНИЕМ ЭЛЕКТРОЛИЗНЫХ РАСТВОРОВ СЕРЕБРА

Авакимян С.Б.. Север И.С., Вологина Н.И.

Кубанская государственная медицинская академия, Краснодар, Россия

Значительное повышение интереса к бактерицидным свойствам серебра в последние годы обусловлено ростом резистентности микрофлоры к антибиотикам н, как следствие, непрекращающимся поиском новых антибактериальных препаратов.

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния электролизных растворов серебра (ЭРС) на функциональную активность нейтрофильпых лейкоцитов и бактерицидную активность сыворотки крови как одного из первых звеньев песпецифической защиты организма.

Материалы и методы. В экспериментах по изучению фагоцитоза кроликам внутривенно вводили ЭРС в дозах 0,025, 0,05 и 0,1 мг серебра на 1 кг веса животного. Функциональную активность пейтрофилов после выделения их из крови в градиенте концентрации фиколла, оценивали по пх способности фагоцитировать St.aureusno эксперимента и через 30, 60 и 120 мин после введения ЭРС. При этом подсчитывали фагоцитарное число, фагоцитарный индекс и процент переваривания бактерий. Определение степени активности и функционального резерва пейтрофилов проводили на основании оценки спонтанного и стимулированного HCT-теста. Для исследования бактерицидной активности сыворотки крови кролика в пробы, содержащие суспензию бактерий (1-2 ■ 108 клеток E.Coli в 1 мл), добавляли сыворотку крови кролика в концентрациях 5, 10 и 15% и ЭРС до концентрации 0,7 мкг/ мл. Указанная концентрация серебра обусловлена тем, что при внутривенном введении ЭРС в дозе 0,05 мг/кг веса, такая концентрация серебра создается и крови из расчета на объем циркулирующей крови. После инкубации смеси при 37”С в течение 90 минут бактерии высевали на МПА для определения титра.

Результаты. Все исследованные нами дозы ЭРС уже через 30 минут индуцировали увеличение степени активации пейтрофилов, но наибольший эффект наблюдался при введении серебра в дозе 0,05 мг/кг. Функциональный резерв пейтрофилов в спонтанном HCT-тесте возрастает в 1,84 раза, а в стимулированном HCT-тесте в 1,17 раз. Отмечается также значительное возрастание фагоцитарного числа, фагоцитарного индекса и процента переваренных бактерий, при этом уровень большинства из названных показателей достигал максимума, как правило, через 60 минут.

Исследование бактерицидной активности сыворотки крови показало, что ЭРС усиливает ее бактерицидное действие при всех рассмотренных концентрациях. Так, в среде с 5%-м содержанием сыворотки, в присутствии ЭРС подавление роста бактерий было в 1,3 - 2,5 раза более сильным, чем в отсутствие серебра. В среде с 10% содержанием это различие возрастало в 9,5 - 16,5 раз, в то время как при содержании в среде 15% сыворотки - в 2,3 -

3,4 раза, т.е. максимальный бактерицидный эффект наблюдали при содержании в среде 10% сыворотки.

Таким образом, влияние ЭРС на бактерицидную активность цельной крови, с одной стороны, обусловлено усилением фагоцитарной активности нейтрофильных грапулоцитов, а с другой - усилением бактерицидной активности сыворотки крови.

ИММУНОКОРРИГИРУЮЩЕЕ ДЕЙСТВИЕ ПОЛИКОМПОНЕНТНОЙ ВАКЦИНЫ ВП-4 НА ФОНЕ ИММУНОСУПРЕССИИ, ВЫЗЫВАЕМОЙ ЦИСПЛАТИНОМ

Ахматова Н.К.. Киселевский М.В.,*

Курбатова Е.А., Семенов Б. Ф.

ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва, Россия;

* Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН, Москва, Россия

В настоящее время большое внимание уделяется им-муномодулирующим препаратам, которые зарекомендовали себя как эффективные средства для профилактики и лечения иммунодефицитных состояний при различных патологиях. С помощью иммуномодуляторов делаются небезуспешные попытки и в поддержании активного функционирования иммунной системы у онкологических больных. В НИИВСим. И.И. Мечникова разработана терапевтическая бактериальная полнкомпонентная вакцина ВП-4, обладающая выраженными иммуномодулирующими свойствами [Егорова Н.Б. и др., 1997].

Цель работы - изучение влияния поликомпонентной вакцины ВП-4 на пролиферативную и цитотоксическую активность мононуклеаров периферической крови (МНПК) здоровых допоров и сплепоцитов мышей при коинкубации с цитостатическим химиопрепаратом циенлатином.

В работе использовали МНПК 15 здоровых доноров, спленоциты 10 мышей линии СВА, однократно иммунизированных ВП-4, и спленоциты интактных животных. Пролиферативную активность МНПК и сплепоцитов мышей оценивали в колориметрическом тесте с использованием витального красителя alamarBlue (US) [Page В. et al., 1993; Fields R., Lancaster M., 1993]. Цитотоксическую активность МНПК доноров определяли на линии клеток эритробластного лейкоза человека К-562, а сплепоцитов мышей на NK-чувствительной линии клеток мышиной лимфомы Yac-1 с помощью теста восстановления 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ-тест), являющегося одним из основных перадиомет-рических методов оценки жизнеспособности и пролиферативной активности клеток [De Maria R. et al., 1996].

Присутствие вакцины ВП-4 в культуре МНПК в 2,1 раза усиливало их пролиферативную активность (с 0,738±0,28 до 1,572±0,043 у.е.) (Р<0,05) и в 9,3 раза увеличивало пролиферативную активность этих клеток, суп-рессированпую цисплатином в дозе 1 мкг/мл (с 0,025±0,006 до 0,233±0,004 у.е.) (Р<0,05). После инкубации с ВП-4 цитотоксическая активность МНГ1К повышалась с 38,40± 1,58 до 60,10± 1,02% и усиливался цитоток-сический эффект цисплатина по сравнению с МНПК здоровых доноров (с 68,18±2,83% до 87,56±0,55)%.

Вакцина ВП-4 при однократном введении мышам стимулировала ex vivo пролиферативную активность спле-ноцитов (с 0,626±0,027 до 0,995±0,046 у.е.) и частично восстанавливала активность, подавленную цисплатином (с

0,079±0,047 до 0,287±0,015 (р<0,05) (табл.). Спленоциты иммунизированных мышей обладали в 2 раза большим

цитотоксическим действием иа клетки ЫК-зависнмой опухолевой линии Уас-1, чем спленоциты интактпых животных (с 42,85±4,09 до 85,01±2,П%), и потенцировали цитотоксическое действие циснлатииа (с 75,26+1,38 до 89,70±2,11%) (Р<0,05). Однако в данном эксперименте цитотоксичность спленоцитов, иммунизированных ВП-4 мышей, при прибавлении циснлатииа существенно не увеличивалась (Р<0,05).

Резюмируя вышеизложенное, можно сделать выводы

о том, что поликомпонентная вакцина ВП-4 обладает дозозависимым, стимулирующим эффектом па пролифера-

тивный потенциал клеток-эффекторов иммунитета, ослабляет ингибирующее влияние цисплатина на эти клетки, усиливает их цитотоксичпость по отношению к клет-кам-мишеиям К562 и Уас-1. Механизм усиления пролиферативной активности и цитотоксического эффекта клеток под влиянием вакцины ВП-4, очевидно, обусловлен синтезом цитокипов, влияющих на лимфокин-активиро-ванную цитотоксичность ЫК-клеток.

Эти данные свидетельствует о перспективности дальнейших исследований по влиянию вакцины ВП-4 па развитие опухолевых процессов.

ТАБЛИЦА. ПРОЛИФЕРАТИВНАЯ И ЦИТОТО КС И Ч ЕС КАЯ АКТИВНОСТЬ СПЛЕНОЦИТОВ МЫШЕЙ, ОДНОКРАТНО ИММУНИЗИРОВАННЫХ ПОЛИКОМПОНЕНТНОЙ ВАКЦИНОЙ ВП-4 НА ФОНЕ ИММУНОСУПРЕССИИ, ВЫЗВАННОЙ ЦИСПЛАТИНОМ

Концентрация цисплатина, прибавленного в среду культивирования, мкг/мл Пролиферативная активность спленоцитов мышей Цитотоксическая активность спленоцитов мышей в отношении NK-зависимой мышиной опухолевой линии Yac-1

Интактных, у.е. Иммунизированных ВП-4, у.е. Интактных, % Иммунизированных ВП-4, %

0 0,626±0,027 0,995+0,046** 42,88+4,09 85,01+2,11**

1,0 0,079±0,047 0,287±0,015** 75,26+1,38 89,70+2,11*

Достоверность разности между группами иммунизированных и интактных мышей, * - р<0,05 ** - р<0,01

ФЛУОРЕСЦЕНТНАЯ ВИЗУАЛИЗАЦИЯ РАКОВЫХ КЛЕТОК С ПОМОЩЬЮ AHTH-HER2/NEU МИНИАНТИТЕЛ И МОДУЛЯ БАРНАЗА- БАРСТАР

Баландин Т. Г.. Эдельвейс Э. Ф., Моисеева Е. С., Лебеденко E. H., Сапожников А.М., Деев С.М.

Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Раннее и высокоточное обнаружение злокачественных образований необходимо для постановки диагноза и выбора правильной стратегии лечения. HER2/neu - маркер распространенных групп злокачественных опухолей, таких как рак молочной железы, легких, желудка, яичников, простаты и др. Целью настоящей работы явилась разработка системы i |ден-тификации HER2/neu па раковых клетках человека.

Мы создали систему визуализации этого маркера на основе принципиально нового подхода, основанного на использовании модуля, образуемого бактериальной ри-бонуклсазой - барназой из Bacillus arnyloliquefaciens и ее природным ингибитором - белком барстаром. Бар-наза и барстар обладают уникально высоким сродством друге другом (KD=10'MM). Один из компонентов визуализирующей системы представляет собой рекомбинантный белок, состоящий из aHTH-HER2/neu-MHHH-aiiTH-тела и барстара. Показано, что этот белок связывается с поверхностью HER2/neu-no3HTHBHbix клеток и не связывается с ITER2/neu-neraTHBHbiMH клетками. Второй компонент визуализирующей системы получен слиянием бариазы с красным флуоресцентным белком (mRFP). Белки были наработаны в E. coli и очищены iiaNTA-Ni2+-сефарозе.

Клетки визуализировали с использованием флуоресцентной микроскопии с помощью пары anTH-HER2/neu-мини-аптитело-барстар и niRFP-барназа. Нам удалось обнаружить характерное красное свечение мембран

HER2/neu-нoзитивныx клеток человеческой аденокарциномы яичника 8КОУ-3, которое отсутствовало при аналогичном окрашивании HER2/neu-пeгaтивныx клеток СТЬЬ-2. Сам белок RFP-бapliaзa не проявляет песпеци-фпческого связывания с клетками.

Все компоненты, используемые в разработанном тесте, представляют собой генно-инженерные белки. Стандартность препаратов, получаемых в бактериальных штаммах-продуцентах, делает предложенный тест высокотехнологичным. Таким образом, разработана система, позволяющая детектировать раковый маркер НЕК2/пеи на поверхности опухолевых клеток человека.

Работа поддержана грантами РФФИ и МКНТ.

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ ПРИГОТОВЛЕНИЯ И ХРАНЕНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ НА ПАРАМЕТРЫ ГЕМОЛИТИЧЕСКОГО ПРОЦЕССА ПРИ АКТИВАЦИИ АЛЬТЕРНАТИВНОГО ПУТИ СИСТЕМЫ КОМПЛЕМЕНТА

Бельтюков П.П.

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П.Павлова, Россия

Результаты определения активности системы комплемента в сыворотках крови человека зависят от множества факторов, связанных с использованием в качестве клеток-мишепей гетерологичных эритроцитов. Традиционным объектом активации альтернативного пути системы комплемента (АПК) являются эритроциты кролика, обладающие способностью активировать АПК. Результаты определения параметров активности комплемента при использовании кинетических методов регистрации (скорость гемолиза, индукционный период и т.п.) находятся в зависимости от условий приготовления и некоторых других характеристик суспензий эритроцитов кролика.

Целью настоящей работы стало исследование влияния свойств суспензий эритроцитов кролика, полученных в различных условиях, на результаты комилсмент-опос-редованного гемолиза при активации АПК. На основании полученных результатов выработаны рекомендации по приготовлению суспензий эритроцитов кролика для анализа АПК в сыворотках крови.

В качестве источ н и ка komiltcmci на ист юл ьзовал и смешанные сыворотки крови, полученные от больных и здоровых лиц. Исследованы параметры гемолитического процесса при активации АПК в цельных сыворотках и в системе RC3+C3. Реагент для определения гемолитической активности компонента СЗ (RC3) получали путем обработки сыворотки крови монометиламином (ММА). Добавление очищенного препарата СЗ или разведенной сыворотки крови к этому реагенту приводит к восстановлению активности комплемента и позволяет оцепить гемолитические свойства компонента СЗ в исследованном образце сыворотки. Свежие эритроциты кролика после забора крови в раствор цитрата натрия трижды отмывали 0,9%-иым раствором NaCl. Для хранения крови использовали реактив Олсвера. В день опыта кровь, хранившуюся в реактиве Олсвера, также отмывали 3 paisa 0,9%-пым NaCl. Исследование активации АПК в системе RC3+C3 не требует применения хелатирующих агентов для связывания Са2\ т.к. в реагенте RC3 после обработки ММА разрушены СЗ и С4, поэтому в качестве основного буфера в опытах использовали стандартный мединаловый буфер (pH 7,4) с добавлением Са2+ и Mg2+. Исследованы четыре варианта

суспензий эритроцитов кролика: свежие эритроциты, полученные из надосадочной жидкости (1) и из осадка (2) при последнем отмывании эритроцитарной суспензии после центрифугирования при 1500 об/мин в течение 5 мин. Аналогично были получены суспензии из падосадка (3) и из осадка (4) эритроцитов, хранившихся в течение 30 сут. в реактиве Олсвера. Количество эритроцитов в смеси во всех случаях составляло около 1,2 • О7 эритроцитов.

Основные результаты определения параметров ком-племент-опосредованного гемолиза в системе НСЗ+СЗ, полученные при использовании четырех вариантов суспензий (п=4), представлены в таблице (в%% к значениям параметров для суспензии 2).

Таким образом, суспензии эритроцитов кролика в зависимости от условий хранения и способа приготовления существенно отличаются по способности активировать АПК. По параметру У( (скорость лизиса первой порции) суспензии эритроцитов 1 и 3, приготовленные из падосадка, достоверно отличаются от суспензий 2 и 4. В то же время суспензия, приготовленная по варианту 4 (эритроциты после длительного периода хранения из осадка), не отличаясь по параметрам гемолиза первой порции эритроцитов, достоверно отличается от свежеприготовленных эритроцитов из осадка (вариант 2) по параметрам гемолиза (Ц;ч,2 и У2) второй порции и по величине прироста скорости лизиса второй порции эритроцитов. Выявленные различия параметров комплемент-опосредованного гемолиза необходимо учитывать при кинетических исследованиях системы комплемента.

ТАБЛИЦА. КОМПЛЕМЕНТ-ОПОСРЕДОВАННЫЙ ГЕМОЛИЗ В СИСТЕМЕ RC3 + СЗ

Показатель Варианты суспензий эритроцитов

1 2 3 4

Индукционный период -1 (^1) 95,5+4,8 100 90,0+6,3 99,8+8,5

V, 117,4+3,8* 100 123,7+11,6* 100,6+4,8

Индукционный период -2 (^2) 101,5+8,7 100 107,6+9,4 82,8+6,4*

V, 108,3+9,1 100 112,7+13,0 117,7+5,2*

Прирост скорости (УД)* 100% 2,38+1,12 2,67+0,55 2,39+1,02 2,97+0,98*

* звездочками отмечены значения, достоверно отличающиеся от варианта 2 (р <0,05).

ПРОДУКЦИЯ TGFP РАЗЛИЧНЫМИ СУБПОПУЛЯЦИЯМИ ЕСТЕСТВЕННЫХ СУПРЕССОРНЫХ (NS) КЛЕТОК ПОД ДЕЙСТВИЕМ IL-2, IL-3 И ГИСТАМИНА

Беляев Н.Н.. Богданов А.Ю., Саввулиди Ф.Г., Тлеулиева Р.Т.

Институт молекулярной биологии и биохимии им. М.А. Айтхожииа, Алма-Ата, Казахстан

Некоторые авторы считают TGF(3 одним из главных возможных тригеров переключения продукции цитоки-нов с Thl-типа в сторону ТЬ2-типа. Мы предложили рассматривать NS-клетки как источник продукции TGF(3 в значительных количествах. NS-клетки являются гетерогенной популяцией костно-мозговых гемопоэтических предшественников, обладающих способностью неспецифически угнетать различные иммунные реакции in vitro. Их участие предполагается в супрессии NK-активности в ходе злокачественного роста опухоли. Можно предположить также их участие во многих случаях развития иммунологической недостаточности. Различные авторы по-

казали существование двух групп цитокинов, которые способны активировать ЫБ-клетки (1РЫу и 1Ь-2 или 1Ь-3 и СМ-С5Р), которые, по-видимому, отражают существование как минимум двух субпопуляций ЫБ-клеток. Ранее мы показали, что гистамин способен активировать одну из популяций ЫБ-клсток костного мозга. В дайной работе мы попытались доказать существование различных субпопуляций ЫБ-клеток и продукцию ими ТСРР под действием 1Ь-2, IЬ-3 или гистамина.

Клетки костного мозга (ККМ) мышей линии СВА культивировали в концентрации 2х106/ш1 при стандартных условиях культвирования в течение 48 ч. ^-активность оценивали по способности культурального супернатанта трех изоиикнических фракций ККМ, индуцированных в течение 3 ч 1Ь-2 (тЫЬ-2 - 50 МЕ/мл), 1Ь-3 (супернатант культуры клеток \VEHI-3b, 1/3 по объему) или гистамином (10'5М), угнетать пролиферацию клеток миело-мы, используя МТТ-тест. О продукции ТСР|3 ЫБ-клетка-ми судили по уменьшению супрессорной активности супернатанта в присутствии поликлональных апти-ТСрраи-

тител (40 и 80 мкг/мл). Нам удалось получить центрифугированием на градиентах перкола три отдельные клеточные фракции с плавучими плотностями 1,080 (NS1), 1,090 (NS2) и >1,090, но <1,100 (NS3) г/мл. Ни одна из фракций не показала спонтанной продукции супрессорных факторов, но каждая фракция продуцировала супрессорные факторы под действием того или иного индуктора. NS1-фракция отвечала только на IL-2 или гистамин, ЫБ2-фракция отвечала только на IL-3, ИБЭ-фракция отвечала только на IL-2, но не на гистамин. Фракции отличались друг от друга не только по плавучей плотности и чувствительности к различным индукторам, но также по продукции TGFß. Так, вся супрессорная активность NS1-клеток, индуцированная IL-2 и гистамином, была связана с TGFß. Супрессорная активность NS2-iuieTOK, индуцированная IL-3, лишь частично зависела от TGFß. NSS-фракция под действием IL-2 продуцировала супрессорный фактор иной, чем TGFß природы. Роль субпопуляций NS-клеток в различных иммунологических процессах предстоит выяснить.

КОМПЛЕМЕНТАРНО-АДРЕСОВАННЫЕ ПОЛИНУКЛЕОТИДЫ В КАЧЕСТВЕ СРЕДСТВ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ ИСКУССТВЕННЫЙ ИНФОРМАЦИОННЫЙ ИММУНИТЕТ В ОТНОШЕНИИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

Борисенко A.C.. Файзулоев Е.Б., Кривцов Г.Г., Никонова A.A., Океании A.A.

ГУ НИИ вирусных препаратов

им. О.Г. Анджапаридзе, РАМН, Москва, Россия

Несмотря на определенные успехи, достигнутые в лечении и профилактике вирусных инфекций, продолжаются поиски новых подходов к борьбе с заболеваниями, вызываемыми вирусами. К числу подобных подходов, несомненно, относится развитие технологии создания искусственного антивирусного иммунитета и генной терапии с помощью антисмысловых РНК, рибозимов. Особую ценность комплементарно-адресованным полинуклеотидам (КАП) как потенциальным профилактическим и терапевтическим агентам придает их практически абсолютная специфичность и нетоксичность. Кроме того, возможно создание рекомбинантных плазмид, обладающих аддитивностью и тканеспецифичностью.

Одним из актуальных направлений работ является ингибирование репродукции вирусов, представляющих определенную значимость с точки зрения медицинской и ветеринарной практики, с помощью КАП. Исходя из этого, в качестве объектов для воздействия КАП в процессе исследований были выбраны представители различных семейств вирусов, в частности:

- семейства Adenoviridae, аденовирус человека типа 5 и 8;

- семейства Retroviridae, вирус лейкоза коров, вирус T-клеточного лейкоза человека 1 типа (HTLV-1), вирус лейкоза кошек (FeLV);

- семейства Parvoviridae, вирус алеутской болезни норок (AMDV);

- семейства Heipesviridae, вирус простого герпеса человека (HSV-1, HSV-2), цитомегаловирус человека (HCMV).

Антивирусное действие КАП соединений анализировалось на клеточно-культуральных моделях. Для тестирования уровня репродукции вирусных частиц в клеточных линиях, содержащих гены КАП, учитывая стратегию репликации вирусных геномов, использовались следую-

щие методы: полимеразная цепная реакция, иммунофер-ментный анализ, анализ активности вирусной РНК-зави-симой ДНК-полимеразы, реакция синцитийобразования, электронная микроскопия клеточных линий, инфицированных вирусами и содержащих гены КАП.

Наличие рекомбинантных плазмид, содержащих гены КАП в анализируемых клеточных линиях, подтверждено методами дот- и блот-гибридизации ДНК. Присутствие транскриптов асРНК и рибозимов в трансфицированных клетках показано методом защиты от РНКаз. В результате проведенных исследований показано ингибирование вирусной репродукции от 70 до 99%.

В настоящее время проводятся работы по подавлению репродукции патогенных вирусов на моделях малых лабораторных животных.

ВТОРИЧНЫЙ ИММУННЫЙ ОТВЕТ НАТ-НЕЗАВИСИМЫЕ АНТИГЕНЫ 2-ГО ТИПА

Борисова Т.К.

Научно-исследовательский институт вирусных препаратов им.О.Г.Анджапаридзе РАМН,

Москва, Россия

К Т-независимым антигенам 2-го типа (ТН-2) относятся в основном растворимые полисахариды вирусной и бактериальной природы (пневмококковые полисахариды, фиколл, высокомолекулярные декстраны, леван и др.), а также конъюгаты их с гаптенами. В настоящее время достигнут значительный прогресс в понимании клеточных механизмов регуляции иммунного ответа на ТН-2. Однако при изучении процессов формирования В клеток памяти (Вп), специфичных к ТН-2, в ряде работ авторы отмечали трудности выявления Вп. Было показано, что при вторичной иммунизации мышей конъюгатами ТН-2 с динитрофенолом (Д НФ) наблюдалось угнетение вторичного ответа по сравнению с первичным ответом на эти антигены. Однозначного ответа на вопрос о причинах ингибирования вторичного иммунного ответа на ДНФ-конъюгаты с ТН-2 до сих пор нет.

Целью данной работы было выяснение причин ингибирования вторичного иммунного ответа на ТН-2 - ДНФ-фиколл и ДНФ-декстран. Мышей линии СВА иммунизировали внутривенно антигеном (5 мкг/мышь) и через 2-4 недели индуцировали вторичный ответ in vivo или in vitro (25 нг/мл). О величине иммунного ответа судили, определяя число антителообразующих клеток (АОК) на 4-е сутки после иммунизации антигеном методом локального гемолиза в геле. Для удаления из суспензии спленоцитов Т лимфоцитов клетки обрабатывали анти-Thy 1.2 антителами в присутствии комплемента морской свинки.

При иммунизации мышей ДНФ-декстраном in vivo с интервалом между первичной и вторичной инъекциями антигена в 2 недели наблюдалось угнетение вторичного ответа более чем в 3 раза (207 + 58 АОК/Ю6 спленоцитов) по сравнению с первичным ответом на антиген (760 + 159 АОК/106 спленоцитов). Аналогичные результаты были получены и в случае проведения вторичной иммунизации in vitro, а также при использовании в качестве антигена ДНФ-фиколла. Наблюдаемое угнетение вторичного ответа может быть обусловлено разными причинами: 1) образованием Т супрессоров; 2) анти-идиотипической регуляцией; 3) персистенцией гаптенспецифичных антител. Нами были экспериментально проверены все три возможные причины. Было установлено, что ингибирование вторич-

ного ответа па ДНФ-декстран и ДНФ-фиколл Т-пезави-симо (удаление Т клеток из суспензии спленоцитов не отменяло угнетения вторичного ответа) и обусловлено НС образованием анти-идиотипических антител (в ходе экспериментов не удалось выявить клетки, секретирующие анти-идиотипические антитела), а персистенцией антител к гаптену. Было исследовано влияние сыворотки иммунизированных ДНФ-декстраном мышей на индукцию первичного иммунного ответа in vitro на ДНФ-декстран. Добавление в культуру нормальной мышиной сыворотки не влияло на величину иммунного ответа. Напротив, внесение иммунной сыворотки (0,5%) приводило к значительному ингибированию иммунного ответа. При добавлении в культуру иммунной сыворотки, истощенной на ДНФ-сорбенте (CNBr-сефароза, конъюгированная с ДНФ) не наблюдалось ингибирования иммунного ответа. Можно заключить, что при вторичной иммунизации мышей нер-систирующие анти-ДНФ антитела взаимодействуют с антигеном и маскируют ДНФ-детерминанты, что приводит к снижению эффективности антигенной стимуляции. Со временем титр антител снижается и угнетение ответа исчезает. При интервале между иммунизациями более 4 недель угнетения вторичного ответа не наблюдалось.

В сыворотке мышей после примирования ДНФ-конь-югатами ТН-2 выявляются в основном ДНФ-снецифич-ные антитела IgM-изотипа и небольшие количества IgG-ангител. С целью выяснения роли изотипа антител в наблюдавшемся угнетении вторичного ответа на ДНФ-дек-стран было изучено влияние моноклональных гаптен-спе-цифичных антител (мАТ) разных изотипов на первичный иммунный ответ на ДНФ-декстран в культуре сплепоци-тов. Было показано, что анти-ДНФ мАТ IgG-изогипа вызывали наиболее сильное угнетение иммунного ответа на ДНФ-декстран - иммунный ответ практически отсутствовал. Добавление в культуру спленоцитов мАТ IgM-изотипа приводило к снижению иммунного ответа в 3-4 раза по сравнению с величиной иммунного ответа на антиген в контрольных культурах. Таким образом, ингибирование вторичного иммунного ответа на ДНФ-конъюгата ТН-2 обусловлено действием анти-ДНФ антител IgM-изотипа.

РОЛЬ РАЗЛИЧНЫХ МЕДИАТОРОВ ВОСПАЛЕНИЯ В ОТЯГОЩЕНИИ ИСХОДОВ КОМБИНИРОВАННЫХ РАДИАЦИОННО-ТЕРМИЧЕСКИХ ПОРАЖЕНИЙ

Будагов P.C.. Ульянова Л.П.,

Проскуряков С.Я., Скворцов В.Г.

Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск, Россия

В интересах выяснения вклада различных гуморальных факторов воспаления, таких как цитокины, метаболиты арахидонового каскада и N0' в патогенез комбинированных радиационно-термических поражений (КРТП), была сформулирована задача - оценить роль конкретных медиаторов системного воспаления в ухудшении исходов КРТП. Эксперименты выполнены на мышах-самцах (СВА х C57BL/6)F,. Животных подвергали общему однократному облучению в дозе 7 Гр или моделировали КРТП - облученным животным дополнительно наносили термический ожог 10% поверхности тела.

Установлено, что IL-6 - интегральный медиатор, выделяющийся во время реакции острой фазы на повреждение, коррелирует со степенью выраженности ранней ре-

акции (повышение содержания в крови в первые часы -сутки после КРТП) и вероятностью наступления неблагоприятных, в том числе - летальных, исходов. Введение моноклональных антител к 1Ь-6 за 1 ч до КРТП и в сроки через 1, 2, 3 сут. после КРТП обеспечивало 30-суточную выживаемость 60% животных каждой из этих групп при 100% гибели нелеченных мышей. В работе исследовано влияние ингибиторов продукции провоспалительных нитокинов (пентоксифиллин, глицин), ингибитора цик-лооксигеназы мелоксикама и блокатора клеток Купфера (хлорид гадолиния) на выживаемость, среднюю продолжительность жизни и вероятность гибели подопытных животных с КРТП. Установлено, что пентоксифиллин, глицин, мелоксикам и хлорид гадолиния не приводили к облегчению клинического течения патологии.

Исследовано влияние специфического ингибитора ин-дуцибельной синтазы N0' 5-этил- изотиомочевины (в виде препарата «дифетур») на содержание оксида азота в печени, на 30-суточную выживаемость, среднюю продолжительность жизни и вероятность гибели подопытных животных с КРТП. Выявлено, что КРТП вызывает достоверное, почти двукратное увеличение продукции N0' в печени экспериментальных животных. Обработка мышей препаратом «Дифетур» приводит к практически полному ингибированию синтеза N0'. В группе животных, которым па протяжении первых двух суток после КРТП вводили «Дифетур», выживаемость составила 60%, тогда как в группе «КРТП -КОНТРОЛЬ» выживало лишь 15% животных.

Таким образом, способностью защищать животных от летального действия КРТП обладают средства, ограничивающие активность самих провоспалительных цитокинов в системном кровотоке (в частности, моноклональные антитела к 1Ь-6) и препараты, ингибирующие наработку оксида азота. Данные о роли гиперпродукции N0' в периоде первичных реакций на комбинированное повреждающее воздействие позволяют предположить, что повышение синтеза N0* в раннем периоде КРТП увеличивает чувствительность животных к патологическим процессам, приводящим к гибели в более поздние сроки. Иными словами, увеличению уровня 1Ь-6 в системном кровотоке и продукции повышенного количества оксида азота, как гуморальным медиаторам реакции острой фазы и системного воспаления, принадлежит важная роль в отягощении исходов КРТП.

Полученные данные позволяют оптимизировать выбор средств для противовоспалительной терапии КРТП и свидетельствуют о перспективности поиска новых фармакологических средств терапии КРТП среди соединений, подавляющих продукцию оксида азота.

СПОСОБНОСТЬ Гс ФРАГМЕНТОВ 1дС БЛОКИРОВАТЬ РАЗВИТИЕ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО СТРЕПТОКОККОВОГО ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТА

Бурова Л.А.1. Гаврилова Е.А.1, Гупалова Т.В.1, Пигаревский П.В. , Селиверстова В.А.1,

Нагорнев В.А..1, Шален К. , Тотолян Артем А.1

1 НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия;

2 Институт медицинской микробиологии,

Лундский Университет, Лунд, Швеция

Согласно предложенной нами концепции патогенеза постстрептококкового гломерулонефрита о ведущей роли стрептококковых Рс связывающих белков в индук-

ции патологического процесса, усиленная продукция анти-^С, депозиция иммунных комплексов и СЗ ком-

понента комплемента на базальной мембране гломерул, в эндотелии и мезангиуме в процессе инфекции способны стимулировать продукцию провоспалительных цито-кинов ТЫР-а, 1Ь-1 и 1Ь-6 и приводить к развитию иммунного воспаления и дегенеративно-деструктивных изменений в почечных клубочках. Для подавления перечисленных процессов были отработаны условия введения кроликам препаратов очищенных Рс фрагментов человека и кролика, а также препаратов РаЬ фрагментов кролика на фоне инъекций стрептококков группы А, инициирующих гломерулонефрит.

Целью экспериментов являлось не только стремление подтвердить роль стрептококковых Рс связывающих белков в качестве патогенетического фактора развития гломерулонефрита, но и наметить пути терапии и профилактики данного заболевания.

Методы и материалы. Для индукции экспериментального гломерулонефрита были использованы убитые нагреванием и обработанные 1М раствором К5СК стрептококки группы А типа М1 и Т27 по разработанной ранее схеме (*).

Рс и РаЬ фрагменты были получены папаиновой обработкой по общепринятой методике коммерческих препаратов человека и кролика с последующей очисткой на БерЬагозе СЬ-4В, связанной с протеином в. Чистота препаратов контролировалась в реакции преципитации в геле и в иммуноэлектрофорезе с набором соответствующих иммунных сывороток. Гистологические и иммуноморфологические исследования с использованием разноуровневой микроскопии (световой и трансмис-сионно-электронной) были проведены по описанным раннее методикам (*).

Основные результаты. Схема эксперимента была следующей: в течение 4-х недель кроликам внутривенно вводили стрептококки группы А типа М1. В течение следующих 4-х недель на фоне продолжающегося введения стрептококков кроликам внутривенно инъецировали препараты Рс или РаЬ фрагментов в количестве 2мг/мл. По окончании инъекций кролики были обескровлены, почечная ткань использована для гистологических и имму-номорфологических исследований. Начало введения Рс и РаЬ фрагментов было обусловлено тем, что именно после этого периода введения Рс-позитивных стрептококков группы А определялись первые морфологические изменения в почечных клубочках. Всего в эксперименте было использовано 20 кроликов, из них по 4 кролика было в группах животных, которым вводили Рс фрагменты кролика или человека, по 5 кроликов было в контрольных группах животных, которым вводили РаЬ фрагменты кролика или физиологический раствор, 2-м кроликам вводили Рс-негативный стрептококк

типа Т27. Гистологический и иммуноморфологический анализ почечной ткани показал, что у трех из 4-х контрольных животных, которым на фоне введения стрептококков были инъецированы препараты РаЬ фрагментов кролика, и у всех животных, которым вводили физиологический раствор, наблюдалась картина деструктивно-дегенеративных изменений в почечных клубочках с выявлением депозиции и СЗ комплемента и продук-

цией провоспалительных цитокинов. Напротив, ни у одного из 4-х кроликов, получивших препараты Рс фрагментов человека, гломерулонефрит не развивался, только у одного из 4-х кроликов, получивших препараты Рс

фрагментов IgG кролика, наблюдались изменения, характерные для гломерулонефрита.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ. Введение кроликам только Fe фрагментов IgG человека или кролика на фоне инъекций стрептококков группы А полностью блокировало развитие у них гломерулонефрита, по-видимому, за счет связывания анти-IgG, а также подавления факторов иммунного воспаления в результате уменьшения депозиции IgG и СЗ комплемента и образования цитокинов. Такой активностью не обладали Fab фрагменты гомологичного IgG. Таким образом, полученные результаты подтверждают роль IgG Fe связывающих белков в индукции гломерулонефрита и открывают перспективы исследования терапевтического эффекта данных препаратов.

Исследования поддержаны грантом РФФИ № 02-04-49223 и грантом Президента России № НШ-2206.2003.4

* Burova L.A., Nagomev VA., Pigarevsky P.V. et al. «Triggering of renal tissue damage in the rabbit by IgGFc-receptor-positivegroup A streptococci.» APMIS1998; 106:277-87.

ВЛИЯНИЕ КОНДИЦИОННЫХ СРЕД, ПОЛУЧЕННЫХ ОТ МЫШИНЫХ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПЕЧЕНИ, НА КОЛОНИЕОБРАЗУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КИШЕЧНИКА.

Ведина Л.А.. Сенников С.В., Труфакин В.А.*, Козлов В.А.

ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, ГУ НИИ физиологии СО РАМН*, Новосибирск, Россия

В настоящее время показано, что стволовые клетки, кроме способности к самоподдержанию, пролиферации, дифференцировке и миграции, обладают свойством «пластичности», т.е. генерировать дифференцированные типы клеток других тканей. Изучение этой способности стволовых клеток взрослого организма имеет большое практическое значение при использовании в клеточной заместительной терапии. Показано, что стволовые элементы кишечного эпителия обладают самой высокой пролиферативной активностью. Также известно, что впервые в эволюции очаги кроветворения у позвоночных появляются в стенке пищеварительного канала у круглоротых, свидетельствуя о филогенетическом значении кишечника в процессе гемопоэза (Хрущев Г.К, 1966). Исходя из этого, мы предположили, что стволовые элементы кишечного эпителия могут в определенных условиях генерировать клетки кроветворного ряда. В наших предыдущих в работах было показано присутствие в кишечном эпителии клеток-предшественников гемопоэза, образующих селезеночные колонии на 8-е сутки (КОЕс-8). В настоящем исследовании мы изучали влияния кондиционных сред, полученных от эмбриональных мышиных клеток печени, на способность стволовых клеток кишечной стенки к образованию гемопоэтических колоний. Мы исходили из того, что в эмбриональной печени мышей в период активного гистогенеза кроветворной ткани, эти клетки продуцируют все необходимые ростовые факторы для дифференцировки кроветворных клеточных элементов. В нашей работе было продемонстрировано, что предварительная инкубация стволовых клеток тонкого кишечника мышей (самцов) в среде, содержащей 30% кондиционной среды, полученной от эм-

бриональных мышиных клеток печени, перед трансплантацией приводит к достоверному увеличению колониеоб-разования в селезенке на 9-е сутки у летально облученных мышей-реципиентов (самок). Таким образом, кондиционная среда от клеток эмбриональной печени в период активного гемопоэза содержит необходимые медиаторы, которые стимулируют способность стволовых клеток кишечника к образованию гемоиоатических колоний. Подтверждение происхождения полученных гемопоэтических колоний от клеток кишечного эпителия донора мы подтвердили с помощью маркера У-хромосомы ПЦР-анализом. Более того, потомки клеток кишечной стенки мы обнаружили через три месяца у мышей реципиентов в таких гемопоэтических тканях, как печень, селезенка, костный мозг. Полученные данные открывают новые механизмы участия гуморальных факторов в явлении «пластичности» стволовых клеток.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ЭКЗОГЕННЫХ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 С КЛЕТКАМИ-МИШЕНЯМИ НАТУРАЛЬНЫХ КИЛЛЕРОВ

Власкин П.А.. Коваленко Е.И.

Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Натуральные киллеры (ИК-клетки), важный компонент системы врожденного иммунитета, выполняют в организме цитолитическую функцию, направленную на быстрое уничтожение аномальных, в том числе опухолевых, клеток, и принимают участие в регуляции противоопухолевого иммунного ответа. Предполагается, что роль маркеров поврежденных клеток, распознаваемых натуральными киллерами, могут выполнять белки теплового шока (БТШ).

Ранее нами было показано, что индуцированная в определенных условиях экспрессия эндогенных БТШ70 на поверхности клеток линии К562, являющихся стандартными мишенями натуральных киллеров, сопровождается увеличением опосредованного ЫК-клетками цитоли-

за. Далее было предположено, что БТШ70 экзогенного пула также могут взаимодействовать с клетками-мишенями, что в свою очередь может привести к изменению их чувствительности к действию ЫК-клеток. Изучение механизма взаимодействия экзогенных БТШ70 с клетками К562 и функциональных последствий такого взаимодействия явилось задачей данной работы. Клетки инкубировали в присутствии 10 мкг/мл флуорссцентномече-ных БТШ70 в полной питательной среде в течение 30 мин при температуре 37°С либо 4°С с последующей двукратной отмывкой. Анализ клеточной флуоресценции проводили с помощью метода проточной цитофлуориметрии. Цитотоксичность оценивали с использованием фотометрического метода, основанного на регистрации уровня лактатдегидрогеназы, вышедшей из разрушенных клеток-мишеней. Источником ЫК-клеток служили свежевыде-леиные мононуклеары периферической крови здорового донора. Показано, что при 37°С происходит интернализация БТШ70 клетками К562. В то же время не было выявлено связывания БТШ70 с клетками при 4°С. Преин-кубация клеток К562 с БТШ70, выполненная при 37°С с последующей тщательной отмывкой, не вызывала изменения опосредованной ЫК-клетками цитотоксичности.

Таким образом, можно заключить, что интернализация экзогенных БТШ70 клетками-мишенями не приводит к увеличению их чувствительности к цитолитическому действию натуральных киллеров.

Исследования проводятся при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 04-04-49477).

МЕХАНИЗМ ВЛИЯНИЯ МИЕЛОПИДА, МИЕЛОПЕПТИДОВ МП-1, МП-3, МП-5 И МП-6 НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ

Гаврилова Т.В.. Гейн С.В., Погудина Т.А.*, Черешнев В.А.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН,

*Пермский государственный университет,

Пермь, Россия

Миелопептиды представляют собой группу биорегуля-торпых пептидов костномозгового происхождения, обладающую нейротропной, дифференцировочной и иммунокорригирующей активностью. Широкий спектр биологической активности смеси миелонептидов реализуется за счет наличия у отдельных пептидных фракций направленного действия на различные звенья иммуногенеза, опосредованного через взаимодействие с отдельными клеточными популяциями. Цель настоящей работы - изучение роли моноцитов в реализации эффектов миелопида, мие-лопептидов МП-1, МП-3, МП-5 и МП-6 на функциональную активность лимфоцитов периферической крови в реакции бласттрансформации. Лейкоциты и освобожденную от моноцитов фракцию мононуклеаров периферической крови здоровых мужчин-добровольцев в возрасте от 22 до 30 лет культивировали с различными концентрациями ФГА (конечная концентрация в культуре 20, 2.5, мкг/мл) в 96-луночных планшетах на среде 199 с добавлением 10 mM HEPES, 2 шМ L-глутамина, 100 мкг/мл гентамицина и 10% аутоплазмы в течение 72 часов. За 18 часов до окончания культивирования в каждую лунку вносили по 2 мкКи 3Н-метилтимидина. Миелопид (10 г/мл), МП-1 и МП-3 (10~6,10'8,10'10г/мл), МП-5 и МП-6 (10‘7 г/мл) вносили в культуры сразу с момента их постановки. Освобождения фракции мононуклеаров от моноцитов производили путем адгезии па чашках после выделения мононуклеаров на градиенте плотности фиколл-верографин. Установлено, что МП-1 в концентрации Ю'10 г/мл угнетал пролиферацию в присутствии оптимальной концентрации ФГА (20 мкг/мл). МП-3 в концентрациях 10 6, 10‘8, Ю'10г/мл и МП-6 также оказывали супрессивный эффект на бластт-рансформацию лимфоцитов, проявляющийся в культурах с субоптимальиой концентрацией митогена (2.5 мкг/мл). Миелопид и МП-5 на выраженность пролиферативного ответа не влияли. На спонтанную пролиферативную активность исследуемые пептиды влияния не оказывали. В случае удаления моноцитов из фракции мононуклеаров ингибирующие эффекты МП-1, МП-3 и МП-6 на ФГА-ин-дуцированную пролиферативную активность лимфоцитов нивелировались. В целом, полученные в работе результаты указывают на важную роль моноцитов в реализации эффектов мислопептидов МП-1, МП-3 и МП-6, что в свою очередь свидетельствует о возможности как их прямого, так и опосредованного регуляторного влияния на выраженность иммунных реакций.

СИНЕРГИЗМ В ИНДУКЦИИ ИНТЕРФЕРОНА САНОГЕНОМ, БЕТАЛЕЙКИНОМ И ЦИКЛОФЕРОНОМ

Гариб Ф.Ю.. Ризопулу А.П., *Арипова Т.У.,* Кахаров Б.А.

Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова, Россия; ООО НПП «Иммуномед», Россия;

* Институт иммунологии АН РУз (Ташкент), Узбекистан

Учитывая широкий спектр биологических эффектов индукторов 1БЫ и вовлеченность системы 1РЫ в сано- и патогенез не только вирусных, но и аллергических, аутоиммунных, иммунодефицитных заболеваний, а также перспективу их практического использования, стало очевидным, что поиск новых интерфероногенов, изучение механизмов их действия и обеспечение пролонгации синтеза эндогенного 1РЫ представляются весьма актуальными.

Цель исследования - оценить эффективность интер-фероногенеза под влиянием Саногена, Беталейкина, Цик-лоферона и их сочетаний в эксперименте.

Саноген - разработанный нами лечебный препарат -является низкомолекулярным синтетическим аналогом природного трипептида из фетального тимуса. Он обладает генатопротекторным, противовоспалительным, дезин-токсикационным и иммуномодулирующим действием. Бе-талейкин - лекарственная форма рекомбинантного интер-лейкина-1|3 человека. Циклоферон -низкомолекулярный индуктор эндогенного 1РЫ, из класса акридонов.

В классической модели изучена активность индукторов 1РИ на мышах с титрованием их сыворотки по подавлению цитопатического действия тест-вируса в культуре.

Показано, что Саноген обладает индуктивным действием на синтез ¡БЫ в организме интактных мышей. Комбинации Саногена с Беталейкином или с Циклофероном, или Беталейкина с Циклофероном индуцируют выраженный интерфероновый ответ, превосходящий ожидаемое аддитивное действие в десятки раз. Этот синергичный эффект оценен количественно по отношению фактического титра ШЫ к сумме титров для каждого препарата на конкретный срок наблюдения. Так, под влиянием Саногена с Беталейкином через 48 часов после введения активность 1РИ была выше в 64 раза по сравнению с его суммарной индукцией отдельными препаратами. Индекс синергизма разных комбинаций препаратов возрастал от 4 до 32 на 3- 5 сутки после введения. Под влиянием комбинаций препаратов увеличивается не только титр 1РЫ, но и продлевается его циркуляция в крови до 5 суток (срок наблюдения) при высокой антивирусной активности.

При одновременном введении Беталейкина и Саногена обнаружен выраженный синергизм интерфероногеп-ного действия, поскольку индуцируется усиленный синтез 1РЫ, активность которого регистрируется с 4 до 120 часов с достижением максимума 2048 ед. через 48 часов после инъекций, более чем в 3 раза превосходящего аддитивное действие по монопрепаратам.

При одновременном введении Саногена и Циклоферо-на обнаружен выраженный синергизм в индукции эндогенного 1РЫ, высокая активность которого регистрируется в крови с 4 до 120 часов с достижением максимума 2048 ед через 48 часов после инъекций, в 1,8 раза превосходящий аддитивное действие при их раздельном использовании.

Для количественной оценки активности интерферо-ногенеза под влиянием монопрепаратов и их сочетаний

мы рассчитали средние значения по срокам исследования за 5 суток наблюдения по каждому варианту. Установлено, что из монопрепаратов наиболее активен Циклоферон (295±36ед.). Все использованные сочетания препаратов оказались более сильными интерфероногенами по сравнению с ним. Под влиянием Саногена с Беталейкином средняя активность интерфероногенеза составила 457±45 ед., Саногена с Циклофероном - 805+56 ед., а Беталейкина с Циклофероном -1060±52 ед.

Полученные нами данные о достаточно выраженных интерферониндуцирующих свойствах Саногена и его комбинаций с Циклофероном и Беталейкином, могут иметь практическое применение при лечении инфекционной патологии, в особенности вирусных гепатитов, когда сочетание гепатопротекторного, противовоспалительного, противовирусного, иммуномодулирующего и дезин-токсикационного действий, при отсутствии токсичности и побочных эффектов, очевидно, обеспечат развитие са-ногенетических процессов в организме больного.

РОЛЬ Р-ЭНДОРФИНА И ОПИОИДНЫХ ПЕПТИДОВ В РЕГУЛЯЦИИ ПРОЛИФЕРАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ И ИЗМЕНЕНИИ ТН1/ТН2 ЦИТОКИНОВОГО ПРОФИЛЯ

Гейн С.В.. Симоненко Т.А.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермский государственный университет, Пермь, Россия

Эндогенные оииоидные пептиды являются одними из важнейших посредников во взаимодействии нервной и иммунной систем, кроме этого они представляют собой группу факторов, играющих ключевую роль в процессах адаптации организма. Несмотря на то, что изучению влияния эндогенных опиоидных пептидов на процессы пролиферации, дифференцировки иммуиокомпетентных клеток, регуляции баланса Thl/Th2 и цитокиновый синтез в литературе уделено достаточно много внимания, вопрос о механизмах реализации их эффектов остается актуальным. Цель работы - изучение влияния Р-эндор-фина и селективных лигандов 5,ц.-опиатных рецепторов на пролиферативный ответ лимфоцитов здоровых доно-ров-добровольцев мужского пола, индуцированный ФГА, а также параллельный синтез IL-4 и y-IFN. Лейкоциты периферической крови здоровых мужчин-добровольцев в возрасте от 20 до 37 лет культивировали с ФГА 2,5 мкг/ мл в 96-луночных планшетах в течение 72 часов. За 18 часов до окончания культивирования в лунки вносили по

2 мкКи 3Н-метилтимидина. Радиоактивность проб определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Р-эндорфин 10'7, DAGO 10‘8, DADLE 10'7 М и налоксона гидрохлорид 10'8М вносили в культуры сразу с момента их постановки. Определение концентрации IL-4 и IFN-производили в супернатантах культур после 48 ч культивирования в присутствии ФГА 2,5 мкг/мл, а также в не-стимулированных митогеном культурах. Установлено, что Р-эндорфин и синтетические агонисты 8- и ц-опиат-ных рецепторов с разной степенью интенсивности оказывали стимулирующий эффект на выраженность реакции бласттрансформации лимфоцитов в культурах с ФГА. На фоне блокады опиатных рецепторов эффект Р-эндорфина не отменялся, а напротив усиливался, что связано с самостоятельным стимулирующим эффектом налоксона гидрохлорида. На спонтанную пролиферацию

исследуемые опиоидные пептиды влияния не оказывали. (3-эндорфин и налоксон значительно активировали синтез IL-4 по сравнению с контролем в присутствии ФГА. При совместном внесении их в культуры этого эффекта не наблюдалось. Самостоятельный стимулирующий эффект на продукцию IL-4 в присутствии ФГА оказывал селективный агонист 5-опиатных рецепторов DADLE. В культурах без митогена налоксон угнетал уровень IL-4. На синтез y-IFN исследуемые ониоиды влияния не оказывали. Таким образом, (3-эндорфин, налоксон и селективные агонисты 8- и ц-опиатных рецепторов стимулируют пролиферативный ответ лимфоцитов в присутствии митогеиа, при этом сдвигая баланс Т-хелперов в сторону Th2.

ВЛИЯНИЕ ОСНОВНЫХ РЕПРОДУКТИВНЫХ ГОРМОНОВ НА ФОРМИРОВАНИЕ КЛЕТОЧНООПОСРЕДОВАННЫХ, ГУМОРАЛЬНЫХ ИММУННЫХ РЕАКЦИЙ И ФАГОЦИТАРНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛЕЙКОЦИТОВ

Горбунова O.JI.. Ширшев С.В., Бахметьев Б.А.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Хорионический гонадотропин (ХГ) - один из наиболее важных гормонов, который продуцируется плацентой и нротектирует развитие беременности. Гормон регулирует секрецию половых стероидов, изменяя при этом эндокринное зеркало, и определяет иммупосупрессию в период беременности. Установлено, что некоторые эффекты ХГ могут перекрываться действием половых стероидных гормонов, поэтому необходимо учитывать роль последних в реализации иммуномодулирующего действия ХГ. Известно, что в период беременности происходит смещение типа иммунного ответа с клеточноопосредованного (Thl) в сторону гуморального (ТЬ2), поскольку Thl цитокины могут оказывать цитотоксические эффекты на клетки плода. Фагоцитирующие клетки играют центральную роль в иммунорегуляторных механизмах в период беременности, так как активно инфильтрируют ткани репродуктивного тракта и выступают в качестве мишени для ХГ. Целью работы явилось изучение влияния ХГ на одновременное формирование антителообразующих клеток (АОК), реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и фагоцитарной активности лейкоцитов.

Материалы и методы. Опыты проведены на половозрелых мышах-самках породы Swiss массой 20-22 г. Двум экспериментальным группам вводили подкожно через день инъекции ХГ в 2-х дозах, экстраполированных со средних концентраций гормона в сыворотке крови беременных женщин в I и II-III триместры, которые составили 200 и 20 МЕ/мышь, соответственно. Гормон вводили как до, так и после иммунизации курсом 5 инъекций. Контрольным животным инъецировали растворитель гормона. Гуморальные и клеточноопосредованпые иммунные реакции оценивались одномоментно, для чего мышей иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ) в концентрации 108ЭБ. Через 4 дня в стопу вводили разрешающую дозу ЭБ 5-107. Спустя 24 часа одновременно оценивали реакцию ГЗТ и уровень АОК в селезенке. Реакцию ГЗТ учитывали, измеряя величину отека стопы в сравнении с интактной стопой. Разница в толщине характеризовала выраженность реакции ГЗТ. Уровень АОК определяли прямым методом локального гемолиза в геле агарозы по

Ерне. Фагоцитарную активность лейкоцитов оценивали модифицированным методом Каплина В.Н., основанным на поглощении формалинизированных эритроцитов барана (ФЭБ). Рассчитывали процент фагоцитоза (ПФ), фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ) отдельно для всех типов фагоцитирующих клеток. Учитывая возможность опосредования эффектов ХГ в организме через половые стероидные гормоны и для контроля гонадотропного эффекта, было проведено определение Е2 и Рг в сыворотке крови животных методом ИФА. Достоверность различий оценивали при помощи непараметрических методов: и-критерия Манна-Уитни и корреляционного анализа по Спирмену.

Основные результаты. Инъекции ХГ до и после иммунизации статистически достоверно повышали уровень Е2 и Рг. Введение гормона на всем протяжении эксперимента статистически значимо повышало уровень ^М-АОК в селезенке, не оказывая влияния на реакцию ГЗТ. Выявленная отрицательная корреляционная связь в группе животных, которым инъецировали высокую дозу ХГ (200 МЕ), между уровнем Е2 и реакцией ГЗТ (Кя=-0,67, р<0,05) указывает на прямое участие Е2 в угнетении реакции ГЗТ. Полученные результаты позволяют считать, что ХГ и индуцированный им стероидный фон являются факторами, контролирующими процессы переключения ТЫ-ответ в ТЬ2-ответ при физиологически протекающей беременности. Параллельная оценка фагоцитарной активности лейкоцитов на фойе адаптивных иммунных реакций выявила, что ХГ в дозе 200 МЕ повышал количество (ПФ) и поглотительную активность (ФЧ) фагоцитирующих пейтрофилов, а также поглотительную активность моноцитов крови (ФЧ). Положительные корреляции между уровнем Е2 и поглотительной активностью нейт-рофилов крови (ФЧ), макрофагов перитонеальной полости (ИФ) (К5=0,65, р<0,05), а также уровнем Рг и количеством (ПФ), поглотительной активностью макрофагов (ФЧ) (1^=0,75, р<0,05) указывает на прямое участие половых стероидов в ХГ-стимулирующсй регуляции фагоцитарной активности лейкоцитов.

Заключение. Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что ХГ способен эффективно модулировать как специфические, так и неспецифические защитные реакции организма. Введение ХГ приводит к активации гуморальных иммунных реакций и не влияет на клеточноопосредованпые, которые могут оказывать негативные эффекты на процессы беременности. Стимуляция фагоцитарной активности лейкоцитов периферической крови ХГ на фоне адаптивных иммунных реакций, по-видимому, связана с гонадотропным эффектом хори-огонина, который проявляется в повышении уровня Е2 и Рг в сыворотке крови.

РОЛЬ АУТОКРИННЫХ ФАКТОРОВ В РЕГУЛЯЦИИ УРОВНЯ АТФ В НОРМАЛЬНЫХ И ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ Т-КЛЕТКАХ

Гречихина М.В.. Дьячкова Л.Г., Луценко Г.В.

Институт биоорганической химии им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Введение. В последнее время появляется все больше данных, указывающих на то, что выживание клеток млекопитающих находится под строгим контролем факторов

роста и аутокринных факторов (АФ) выживания. Ранее нами было показано, что АФ клеток цитотоксической 1Ь-

2-зависимой линии СТ1Х-2 способны контролировать их выживание в культуре (Биол. Мембраны, 2001, Т.18, С.312-319), а недавно мы получили свидетельство участия энергетического метаболизма в механизме такого контроля (Биол. Мембраны, 2003, Т.20, С.401-408). Было показано, что уровень АТФ в клетках СТЬЬ-2 зависит от содержания АФ в культуре. Эти данные были получены с использованием экспериментальной модели, включающей прекультивирование клеток СТЬЬ-2 в культурах высокой плотности (ВП-культуры), их перенос в культуры низкой плотности (НП-культуры) и последующее культивирование в таких культурах.

Целью работы было сравнительное исследование влияния АФ на уровень АТФ в нормальных активированных Т-лимфоцитах и трансформированных Т-клетках (клетках 1Ь-2-зависимой линии СТЬЬ-2 и клетках злокачественной линии ЕГ-4).

Материалы и методы. Нормальные активированные Т-лимфоциты получали из спленоцитов мышей ВАЬВ/с путем их стимуляции конканавалипом А (2,5 мкг/мл) в течение 3-х дней. Выживание клеток оценивали путем их прижизненного окрашивания трипановым синим. Уровень АТФ в клетках оценивали с использованием биолю-минесцентного люциферин-люциферазного метода. В качестве источника АФ использовали кондиционированную среду (КС), надосадочную жидкость культур клеток СТЬЬ-2 (1x10е клеток/мл), ЕЬ-4 (2х 106 клеток/мл) или нормальных Т-лимфоцитов (3x106 клеток/мл), которые культивировали в течение 24 часов.

Основные результаты. Было показано, что после культивирования в плотном осадке клеток СТЬЬ-2 (1x106), ЕЬ-4 (2х106) или нормальных активированных Т-лимфоцитов (ЗхЮ6) в течение 14-16 часов и их переноса в свежую среду уровень АТФ в них падает в 4-5 раз за 1-2 мин. Такое падение уровня внутриклеточного АТФ связано с возникновением дефицита АФ в культурах, поскольку при добавлении к исследуемым клеткам вместо свежей среды цельной КС уровень АТФ в них оставался практически неизменным. Зависимости уровня АТФ в исследуемых клетках от концентрации КС имели монотонный характер, что свидетельствует в пользу регуляторного действия АФ на энергетический метаболизм клеток. Факторы, продуцируемые нормальными Т-лимфоцитами и клетками линий СТЬЬ-2 и ЕЬ-4, не различались по эффективности предотвращения падения уровня внутриклеточного АТФ после переноса клеток из ВП-культур в НП-культуры. При культивировании нормальных активированных Т-лимфоцитов в течение 4-6 ч в условиях дефицита АФ при pH 7,3-7,4 наблюдалась их массовая гибель к концу культивирования. Показано, что это явление имеет отношение к так называемому «рН-парадок-су» и связано со сниженным уровнем АТФ в Т-лимфоцитах, вызванным дефицитом АФ в культуре. В то же время трансформированные Т-лимфоциты, клетки линий СТ1Х-2 и ЕЬ-4, несмотря на падение уровня внутриклеточного АТФ, вызванное нехваткой АФ в культуре, не подвержены эффекту рН-зависимой гибели.

Заключение. Полученные результаты показывают, что нормальные и трансформированные Т-клетки отвечают на нехватку АФ одинаковым образом- снижением уровня внутриклеточного АТФ. Аутокринные факторы нормальных и трансформированных Т-клеток не различаются по способности предотвращать снижение уровня

АТФ при переносе клеток из ВП-культур в НП-культу-ры. При длительном культивировании нормальные и трансформированные Т-клетки различаются по способности их выживания в условиях дефицита АФ при нормальном pH среды: в этих условиях нормальные Т-клет-ки в отличие от трансформированных Т-клеток претерпевают массовую гибель.

АНТИГЕННЫЕ И ИММУНОГЕННЫЕ СВОЙСТВА РЕАССОРТАНТНОГО ВАКЦИННОГО ШТАММА, СОДЕРЖАЩЕГО ГЕМАГГЛЮТИНИН ОТ АПАТОГЕННОГО ПТИЧЬЕГО ВИРУСА А(Н5№)

Дешева Ю.А.*. Рекстин А.Р.*, Лу X.**, Кац Д. **, Климов А.И.**, Руденко Л.Г.*

* НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия;

* * Центр по контролю заболеваемости,

Атланта, США

Введение. Постоянно циркулирующие среди диких и домашних птиц вирусы гриппа А представляют собой потенциальный источник возникновения новых пандемических штаммов. Вспышки птичьего гриппа в Юго-Вос-точной Азии, вызванные высокопатогенными вирусами А(Н5Ы1) в 1997, 2003 и 2004 годах приводили к заболеванию людей, часто со смертельным исходом. Обширное территориальное распространение инфекции во время последней вспышки с вовлечением нескольких стран региона подтверждает необходимость разработки мер и средств защиты людей от инфекции высокопатогепными вирусами птичьего гриппа. Основной профилактической мерой борьбы с гриппом является вакцинация с использованием инактивированных (ИГВ) или живых аттенуированных (ЖГВ) гриппозных вакцин. Современные ЖГВ включают вакцинные штаммы, полученные методом генетической реассортации и имеющие смешанный геном: гены, кодирующие гемагглютинин - НА, и нейрамини-дазу - ЫА, наследуются от актуального эпидемического вируса, а шесть генов, кодирующих пегликозилирован-ные белки, - от холодоадаптироваиного (ХА) донора аттенуации.

Целью настоящего исследования было изучение прививочных свойств реассортантного вакцинного штамма, полученного методами классической генетической реассортации в развивающихся куриных эмбрионах на основе ХА вируса А/Ленинград/134/17/57 (Н2Ы2) (Лен/17), применяемого для производства вакцинных штаммов вируса гриппа А для взрослых и детей, с апатогенным птичьим вирусом А/утка/Потсдам/1402-6/86(Н5М2), выделенным в 1986 году.

Материалы и методы. В исследовании использовался реассортант А/17/утка/Потсдам, унаследовавший ген, кодирующий НА от вируса Н5Ш, а гены, кодирующие нейраминидазу ЫА и негликозилированнные белки - от ХА Лен/17. Антигенные свойства реассортанта изучали в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) с набором хорьковых аитисывороток к различным вирусам подтипа Н5Ы1, в том числе к вирусам, выделенным от людей во время вспышек в Гонконге в 1997 и 2003 гг. Иммуно-генность оценивали на мышах линии ВАЬВ/с. Мышей иммунизировали интраназально (и/н) под легкой анас-тезией. В сыворотках крови, полученных через 4 недели после иммунизации, определяли уровень вирус-специфи-

ческих антител в РТГА, реакции микронейтрализации и иммунофермснтном анализе (ИФА).

Результаты. Показано, что антисыворотки, полученные против вирусов подтипа Н5Ы1 2003 года выделения, реагировали с реассортантом А/17/утка/Потсдам значительно слабее, чем антисыворотки против вирусов, выделенных в 1997 году. В то же время, хорьковая антисыворотка, полученная против самого реассортанта, хорошо реагировала с обеими группами вирусов (в пределах половины или удвоенного гомологичного титра). Изучение поствакцинального иммунитета с помощью РТГА и реакции микронейтрализации позволило выявить присутствие гемагглютипирующих и нейтрализующих антител только к гомологичному вирусу Н5Ы2. В ИФА показано наличие специфических поствакцинальных и ^А к антигенно отличающимся вариантам вируса гриппа подтипа Н5Ы1 как 1997, так и 2003 гг. выделения.

Заключение. Реассортантный вакцинный штамм А/ 17/утка/Потсдам проявлял более выраженную антигенную близость с вирусами подтипа Н5Ш, выделенными в 1997 году. Тем не менее, и/п иммунизация мышей реассортантом, содержащим только НА от апатогенного птичьего вируса А(Н5Ш), стимулировала развитие гуморального иммунитета к антигенно отличающимся вариантам вируса гриппа подтипа Н5Ы1.

ВЛИЯНИЕ ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ ПОЛИКОМПОНЕНТНОЙ ВАКЦИНЫ ВП-4 НА РОСТ МЕЛАНОМЫ В16 У МЫШЕЙ ЛИНИИ С57В1./6

Доненко Ф.В..* Ахматова Н.К.,

Киселевский М.В.,* Курбатова Е.А.,

Егорова Н.Б., Семенов Б. Ф.

ГУ НИИ Вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва, Россия;

* Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва, Россия

Более чем скромные успехи в лечении распространенных онкологических заболеваний приводят к тому, что наряду с общепринятыми методами лечения активно изучается возможность использования режимов иммунотерапии. Было показано, что введение различных

бактериальных препаратов усиливает такое звено противоопухолевой активности, как натуральные киллеры

и. ^УуЬгап е! а!.. 1989]. Вакцина ВП-4 состоит из антигенов 4-х условно-патогенных бактерий. Клиническая эффективность ВП-4 установлена при заболеваниях, сопровождающихся вторичной иммунологической недостаточностью (воспалительные заболевания дыхательного тракта, герпесвирусная инфекция и др.). Учитывая иммунологические механизмы действия ВП-4, включающие индукцию цитокинов, активацию макрофагов, опухольнекротизирующего фактора, было целесообразно изучить противоопухолевый эффект этого препарата. Объектом исследования была меланома В16, которую перевивали мышам линии С57В1/6 подкожно, в область подмышечной впадины в количестве 500 000 клеток. Вакцину вводили в дозах 200 и 400 мкг внутри-брюшинпо. Лечение начинали через 1 час после трансплантации опухоли и продолжали на 2 и 3 сутки. Визуально определяемые опухолевые узлы оценивали на 10, 15, 22 дни после инокуляции опухолевых клеток. При этом измеряли линейные размеры опухоли в двух взаимно перпендикулярных направлениях и выражали объем в условных единицах (у.е.). Терапевтическое противоопухолевое действие ВП-4 оценивали по торможению роста опухоли (ТРО). Терапию считали эффективной при торможении роста опухоли более чем па 50% (табл.). Видно, что на всех сроках наблюдения отмечалось торможение роста опухоли у животных, получивших вакцину ВП-4. При этом наблюдался дозозависимый эффект. У животных, получивших ВП-4 в дозе 200 мкг/мышь, торможение роста опухоли на всех сроках наблюдения колебалось в пределах 30,1 и 41,1%, что находилось несколько ниже достоверного терапевтического эффекта. В то же время у животных, получивших вакцину в дозе 400 мкг/мышь, процент торможения роста опухоли составлял от 61,5 до 69,3%, что свидетельствует о терапевтической эффективности вакцины в дозе 400 мкг. Достоверного влияния на продолжительность жизни леченных животных по сравнению с нелеченными в указанных дозах отмечено не было. Средняя продолжительность жизни контрольных животных составила 35,2±2,1 дня, в то время как у леченных животных —36,1 ±2,2 дня при дозе 200 мкг, 35,8± 1,8 дней - при дозе 400 мкг.

ТАБЛИЦА. ВЛИЯНИЕ ВАКЦИНЫ ВП-4 НА РОСТ МЕЛАНОМЫ В16 У МЫШЕЙ ЛИНИИ С57В1/6

Доза ВП-4 мг/мышь Размер опухоли меланомы В16

Через 10 дней Через 15 дней Через 22 дня

М±т у.е ТРО % М±т у.е. ТРО % М±т у.е. ТРО %

0 1032,0+71,2 - 3184,5±104,3 - 5025,0+173,8 -

200 мкг 721,3±81,8 30,1 1904,3± 175,6* 40,2 2961,0+175,4* 41,1

400 мкг 397,0±53,7* 61,5 1093,6±121,2* 65,6 1543,5+120,2* 69,3

* - статистически значимые различия по сравнению с контрольной группой (Р<0,05).

ИЗМЕНЕНИЕ ПРОЛИФЕРАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ ОБЛУЧЕНИЯ ПОЛИХРОМАТИЧЕСКИМ ВИДИМЫМ И ИНФРАКРАСНЫМ СВЕТОМ

Жеваго H.A.. Самойлова К.А., Григорьева Н.Б.

Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург, Россия

В последние годы в связи с публикацией большого количества работ, обосновывающих иммунодепрессивный характер эффектов У Ф радиации Солнца при ее действии на кожные покровы, особую актуальность приобретают исследования влияния на иммунную систему других видов солнечной радиации - видимого и инфракрасного (ИК) излучения, на долю которых приходится 95% ее энергии на поверхности Земли. Наши знания в этой области ограничиваются в основном результатами, полученными при изучении эффектов лазерного света, - т.е. когерентного, монохроматического и, как правило, поляризованного видимого или ИК света. Имеющиеся данные, однако, носят противоречивый характер, а механизмы иммуномодулирующего действия света на системном уровне остаются невыясненными.

Цель настоящей работы: изучить изменения спонтанного и митоген-индуцированного синтеза ДНК в лимфоцитах (Лфц) периферической крови практически здоровых добровольцев, облученных полихроматическим светом в условиях in vivo (транскутанно) и после облучения крови in vitro (в чашке Петри).

Материалы и методы: полихроматическим видимым + ИК поляризованным светом, близким по спектральному диапазону к естественному (480-3400 нм, 12 Дж/см2; фототерапевтический аппарат «Bioptron-2», Швейцария) облучали пояснично-крестцовую область (D=15cm) 20 добровольцев обоего пола (42+2 лет). Взятие крови для исследований проводили через 0,5 и 24 ч после воздействия. Контрольную группу составили необлученные лица (п=18), у которых гемоэксфузия проводилась в те же сроки и в том же объеме (65 мл за 1 сут.). Спонтанный и фитогемагглютинин (ФГА)-индуцированный синтез ДНК (2 и 4 мкг ФГА на 105 клеток) в Лфц периферической крови оценивали радиометрическим методом.

Основные результаты: Облучение стимулировало спонтанный и ФГА-индуцированный синтез ДНК в Лфц только у лиц с исходно сниженными показателями синтеза (в среднем в 2,5 и 2,7 раза соответственно), что регистрировалось через 24 ч после облучения добровольцев и культивирования выделенных мононуклеаров в течение 72 ч. В параллельных опытах кровь каждого добровольца облучали in vitro и, моделируя ситуацию in vivo, когда небольшое количество транскутанно фотомодифицирован-ной крови контактирует с ее гораздо большим циркулирующим объемом, смешивали облученные и необлученные образцы аутологичной крови в объемном соотношении 1:10. Спонтанный синтез возрастал при исходно сниженном уровне в 2 и 3 раза соответственно, а стимуляция ФГА-2 и ФГА-4 синтеза отмечалась только после добавления облученной крови к интактной (соответственно, в 2,2 и 1,6 раза). Выявлена высокая степень корреляции изменений исследуемых показателей при облучении крови in vivo и in vitro, что позволяет связывать стимулирующий эффект света на Лфц всей циркулирующей крови с транскутанной фотомодификацией ее небольших количеств и действием такой крови на весь остальной объем.

Установлена однонаправленность и аддитивность мито-генного действия света и ФГА.

Заключение. Полученные данные позволяют предполагать, что фототерапия с использованием полихроматического видимого + ИК света будет способствовать увеличению количества Лфц в периферической крови и усиливать их ответ на антигенный стимул.

ВЛИЯНИЕ АНТИБИОТИКОВ НА ХЕМОТАКСИЧЕСКУЮ ФУНКЦИЮ НЕЙТРОФИЛОВ

Злакоманова О.Н.. Чукичев А.В., Зурочка А.В., Елизарьева Е.А.

НИИ иммунологии ГОУ ВПО «Челябинская медицинская академия» М3 РФ, Россия

В последние годы иммунологические аспекты анти-биотикотерапии вызывают возрастающий интерес исследователей. Это связано прежде всего с важнейшими направлениями развития иммунологии, существенно обогатившей представления о механизмах иммунопатологии и предложившей широкий набор экспериментальных методов оценки отдельных звеньев иммунной системы, что позволило провести четкую лабораторную верификацию различных иммунодефицитных состояний, выявить их механизмы и наметить пути коррекции иммунных нарушений. Благодаря использованию иммунологических методов удалось убедительно продемонстрировать связь между показателями иммунитета и эффективностью лекарственной терапии.

Известно, что различные факторы, подавляющие нормальные функции иммунной системы (цитостатики, облучение, направленная иммуносупрессивная терапия, СПИД, инфекционные заболевания), значительно снижают результативность применения средств этиотропной терапии инфекционных заболеваний. В то же время включение в схемы комплексной терапии иммуномодуляторов повышает эффективность лечебно-профилактических мероприятий. В связи с этим изучение действия химиотерапевтических препаратов вообще и, антибиотиков в частности, на иммунную систему представляются особенно важным.

Одними из основных показателей влияния антибиотиков на процесс взаимодействия клеток иммунной системы с микроорганизмами являются хемотаксис, адгезия, фагоцитоз и внутриклеточный киллинг возбудителей. Антибиотики могут модулировать активность клеток иммунной системы двумя способами: воздействуя либо на микроорганизмы, либо на фагоциты.

Исходя из вышеизложенного, в работе была поставлена цель изучения влияния различных антибиотиков (амоксиклава, гентамицина, стрептомицина и цефатакси-ма) на хемотаксическую функцию нейтрофилов условно здоровых доноров.

Хемотаксис нейтрофилов периферической крови исследовали под агарозой по методу R.D. Nelson et al. (1975). Клеточную взвесь доводили до концентрации 5x108 клеток/мл и делили на 20 равных частей, которые размещали в лунках агарозного геля в объеме 0,02 мл. Четыре части клеток использовались для исследования хемотакси-ческой функции нейтрофилов к С5а-компоненту комплемента, лейкинферону, взвеси чистых суточных культур Staphylococcus aureus (штамм «209»), Escherichia coli (контроль). К другим добавляли антибиотики - амоксиклав, гентамицин, стрептомицин и цефатаксим. Концентрации

препаратов были определены, исходя из рекомендуемых лечебных доз и с учетом количества нейтрофилов.

В результате исследования установлено, что изучаемые антибиотики в той или иной степени снижают хемо-таксическую активность нейтрофилов периферической крови условно здоровых доноров к С5а, лейкинферону и взвеси суточной культуры Staphylococcus aureus. Оппозит-ный эффект был получен при изучении влияния вышеописанных препаратов на хемотаксис к взвеси суточной культуры Escherichia coli. Инкубация нейтрофилов с антибиотиками достоверно стимулирует хемотаксический ответ к Escherichia coli.

В целом полученные результаты позволяют предположить, что при применении антибиотиков снижение хе-мотаксической активности нейтрофилов на Staphylococcus aureus может являться одной из причин выживания стафилококков во внутренней среде организма и наоборот стимуляция хемотаксиса к Escherichia coli может приводить к элиминации нормальной микрофлоры и способствовать формированию дисбактериоза.

ИЗУЧЕНИЕ ЭПИТОПНОЙ СТРУКТУРЫ ПЕРОКСИДАЗЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Зубков А.В.. Яковлева И.В., Свиридов В.В., Кузьмина Н.С., Кузнецова Г.И., Кириллова Г.А., Лунин В.Г., Буркин М.А.

ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН, Москва, Россия

Введение. Ведущим патогенетически значимым аутоантигеном щитовидной железы (ЩЖ) является пероксидаза ЩЖ (ТПО). Антитела (АТ) к ТПО являются свидетелями аутоиммунного процесса в ткани ЩЖ и выявляются в сыворотке крови у 90-100% лиц при аутоиммунных заболеваниях щитовидной железы (АИЗЩЖ). В последние годы ведутся интенсивные исследования по изучению антигенной структуры ТПО и эпитопной специфичности аутоантител, основанные на совместном использовании моноклональных антител (МкАт) и рекомбинантных белков.

Целью работы являлось создание панели гибридом -продуцентов МкАт к ТПО и изучение их свойств.

Материалы и методы. Для получения МкАт мышей линии BALB/c иммунизировали аффинно очищенной ТПО (степень очистки 97%). Для слияния использовали спленоциты мыши и клетки миеломы мыши P3-X63-Ag 8.653. Слияние, селекция и ведение гибридом проводилось по стандартной методике. Скрининг клонов осуществляли методом непрямого иммупоферментного анализа (ИФА). Для сенсибилизации твёрдой фазы использовали 4 вида антигенов: препарат нативной и денатурированной ТПО, препарат нативного и денатурированного тиреоглобулина. Изотины МкАт определяли с помощью набора антиизотипических кроличьих Ig (Bio-Rad) и антител к иммуноглобулинам кролика, конъюгированных с пероксидазой хрена. МкАт к ТПО накапливали в асцитных жидкостях мышей линии BALB/c.

Результаты и обсуждение. Для получения МкАт было проведено несколько гибридизаций. Эффективность гибридизации составляла 80-90%. При первичном тестировании было выявлено 217 гибридом - продуцентов МкАт к ТПО. По результатам иммупоферментного анализа, дот-анализа на нитроцеллюлозпых мембранах и

иммуноблоттинга было отобрано 36 технологичных гибридом с высоким уровнем антителопродукции. Моноклональные антитела характеризовались высокой активностью в асцитных жидкостях мышей: титр антител варьировал от 1х105 до 1x106. Все отобранные МкАт относились к иммуноглобулинам класса IgG[. Из отобранных культур, наиболее активно реагировавших с ТПО, 5 - взаимодействовали как с нативной, так и с денатурированной ТПО, что свидетельствовало об их направленности к линейным эпитопам молекулы ТПО. По данным конкурентного иммупоферментного анализа было определено, что из 5 МкАт к стабильным эпитопам ТПО как минимум два направлены к двум удалённым друг от друга линейным детерминантам. В литературе описаны только два подобных МкАт: МкАт A4 к линейному эпитопу с 561-575 а.о и МкАт 47 к линейному эпитопу с 713-721 а.о. (Gardas A. et al, 1997; McLachlan S., Rapoport В.,1992).

Для изучения более тонкой специфичности МкАт были синтезированы химерные белки, содержащие последовательности, лежащие в иммунодоминантной области А и соответствующие 600-618 и 607-630 аминокислотным остаткам (а.о.) ТПО, присоединенные к N- и С - концевому участку домена эндоглюканазы из Anaerocellum thermophilum. Химерные белки, содержащие детерминанты ТПО 600-618

а.о. и 607-630 а.о., ингибировали связывание только МкАт 2Н7. Поскольку для данных химерных белков общим является участок от 607 по 618 а.о. молекулы ТПО, логично предположить, что именно он распознается антителами 2Н7. Моноклональные антитела были использованы для выделения высокоочищенной ТПО, свободной от примеси других аутоантигенов щитовидной железы.

Все отобранные анти-ТПО МкАт были протестированы на планшетах из иммуноферментных наборов реактивов для определения аутоантител к ТПО производства фирм «Алкор-Био» и «Orgentec». 88,9% культур, в том числе взаимодействующие с нативной и денатурированной формами антигена, реагировали с ТПО во всех вариантах. Полученные расхождения в отношении 4 клонов могут быть обусловлены как антигенной структурой ТПО, используемой для сорбции па поверхности лунок планшета, так и эпитонной плотностью иммобилизованного антигена. При анализе сывороток крови [п=40] больных АИЗЩЖ на наличие (отсутствие) антител к ТПО наборами этих фирм были получены аналогичные результаты: коэффициент корреляции составлял 0,86.

Таким образом, в результате проведенных исследований получена панель из 36 МкАт к ТПО, которая будет использована для эпитопного картирования антигена и изучения спектра аутоантител в сыворотках крови пациентов с АИЗЩЖ.

МОДУЛИРОВАНИЕ ЭКСПРЕССИИ АКТИВАЦИОННЫХ АНТИГЕНОВ ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ ИММУНОПАТОЛОГИЧЕСКИМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

Казимирский А.Н.. Терентьев A.A., Порядин Г.В., Салмаси Ж.М., Александрова И.А., Тагирова А.К., Молдогазиева Н.Т., Макаров Т.В., Рябинина З.В.

Российский государственный медицинский университет, Москва, Россия

Масштабное исследование активационного процесса в лимфоцитах больных иммунопатологическими заболе-

ваниями обнаруживает ряд изменений в популяционном и субпопуляционном составе лимфоцитов периферической крови, а также в отношении экспрессии активационных антигенов. В их числе: нарушение механизмов Fas-зависимого апоптоза лимфоцитов, что ведет к нарушению элиминации аутореактивных клонов клеток; нарушение Fas-зависимого апоптоза сопровождается значительным повышением количества активированных лимфоцитов непосредственно в очаге воспаления; при этом обнаруживается снижение функциональной активности Т-лимфо-цитов и их субпопуляций в связи с появлением в периферической крови дважды позитивных клеток (Т-лимфо-цитов с фенотипом CD3+4-8-) (Клиническая патофизиология №1,2004). Недостаточность активационного апоптоза лимфоцитов при иммунопатологических заболеваниях, обусловлена низким уровнем экспрессии реценто-ров CD95(Fas) и CD95L(FasL), что ведет к гиперпродукции иммуноглобулинов или циркуляции аутоагрессивных клонов.

Цель настоящего исследования состояла в определении механизма иммуносупрессорного действия пептидов, происходящих из фетоплацентарного комплекса. Исследовали влияние пептида из а-фетопротеина человека (АФП) и четырех пептидов - продуктов ограниченного протеолизатрофобластического бета-глобулина (ТБГ) на экспрессию рецепторов индукции апоптоза лимфоцитов Fas и FasL на клеточной модели лимфоцитов человека, активированных воспалительным процессом. Иммуномодулирующие свойства этих белков в нативном состоянии неизвестны.

Основной методический подход в работе состоял в определении экспрессии рецепторных антигенов на лимфоцитах с помощью непрямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител. Исследованию подвергали синтетический пептид LDSYQCT, соответствующий фрагменту АФП14_2о и пептиды А, Е, Q и V, которые получены ограниченным протеолизом ТБГ человека и имеют молеклярную массу около 0,7 кДа. Лимфоциты культивировали 16 часов с пептидами в конечной концентрации 10'8 М.

Исходный уровень содержания CD95+ лимфоцитов при исследовании лимфоцитов, полученных от 8 больных с воспалительными процессами, оказался сходным по сравнению с уровнем здоровых доноров. Под влиянием всех изучаемых пептидов обнаружено увеличение количества лимфоцитов, экспрессирующих рецептор запуска активационного апоптоза CD95 (Fas-антиген). Однако уровень этого количественного увеличения экспрессии был различным. В наибольшей степени (в 4 раза) увеличивал количество CD95+ лимфоцитов пептид АФП 14.20. Пептиды из ТБГ повышали количество CD95+ лимфоцитов, но не более чем в 2 раза.

Исходный уровень содержания лимфоцитов, экспрессирующих FasL-антиген (рецептор CD95L), был в 2 раза выше по сравнению со здоровыми донорами. Выявленные эффекты пептидов на экспрессию Fas-L антигена существенно различаются. Так, пептид V снижал в 2 раза содержание С095Ь+-клеток, а пептид Е увеличивал этот показатель более чем в 2 раза, в то время как пептиды А и Л не оказывали существенного влияния на этот показатель.

Результаты проведенного исследования ведут к заключению:

1. Исследованные пептиды из альфа-фетопротеина человека и трофобластического бета-глобулина различают-

ся по способности влиять на экспрессию рецептора CD95. Наиболее эффективен в отношении увеличения экспрессии рецептора CD95 пептид АФП14.2о-

2. Из трофобластического бета-глобулина человека выделен Е пептид, способный значительно увеличивать экспрессию рецептора CD95L.

Пептидная композиция, состоящая из АФП14„20 и Е-пептида из трофобластического бета-глобулина, может быть эффективной для усиления активационного апоптоза лимфоцитов, и предложена в качестве перспективного лекарственного препарата. Необходимость индукции активационного апоптоза лимфоцитов возникает при аллергических и аутоиммунных заболеваниях, характеризующихся недостаточностью экспрессии рецепторов запуска активационного апоптоза CD95 и CD95L, что ведет к недостаточности активационного апоптоза лимфоцитов и поддерживает воспаление.

СНИЖЕНИЕ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОРГАНИЗМА К РАЗЛИЧНЫМ ПАТОЛОГИЧЕСКИМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ РАЗЛИЧНОЙ ХИМИЧЕСКОЙ СТРУКТУРЫ И ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Кирилличева Г.Б., Соловьева М.С., Табунов B.C., Пронин A.B.

ГУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва, Россия

В ходе настоящего исследования впервые применен адаптационно - биоритмологический подход к изучению влияния иммуномодуляторов на чувствительность к различным патологическим воздействиям (бактериальные и вирусные инфекции, бактериальные интоксикации, действие ионизирующей радиации).

В работе использованы иммуномодуляторы различных структуры и происхождения, различающиеся механизмами иммуномодулирующего действия (сальмозан, пирогенал, миелопид, фоспренил и др.)

Эксперименты проведены на мышах инбредных линий с генетически четкими различиями в функциональных характеристиках иммунной и нейроэндокринной систем (СВА, C57BL/6, BALB/C, гибриды F1(CBA+ C57BL/6)).

Проведение экспериментов на мышах инбредных линий является оптимальным подходом для изучения различных сторон иммуномодулирующего эффекта, дифференциации его специфического и иеспецифического (адаптогенного) компонентов. Это связано с тем, что при одномоментном исследовании у мышей разных инбредных линий изучаемые показатели, как правило, находятся в разных фазах биологического ритма.

В результате проведенного исследования получены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что применение любого иммуномодулятора в качестве профилактического или лечебного средства может приводить не только к повышению неспецифической резистентности к различным патологическим воздействиям, но и к ее снижению.

Применение адаптационно - биоритмологического подхода позволило показать, что наблюдаемый отрицательный эффект заложен в механизме действия иммуномодулирующих препаратов и связан с проявлением не-

специфических (адаптогенных) изменений при применении препаратов. Неспецифические изменения - это стандартные однотипные изменения, возникающие в ответ на действие самых разнообразных раздражителей. Специфические изменения - это особые, присущие только данному воздействию изменения.

В работе экспериментально доказано, что дифференциация специфического и неспецифического компонентов иммуномодулирующего эффекта является необходимым условием для разработки оптимальных схем применения иммуномодуляторов, позволяющие до минимума уменьшить его отрицательный эффект.

Показано преимущество адаптационно-биоритмологического подхода но сравнению с традиционными методами исследования иммуномодулирующего эффекта.

VEGF - НЕ ТОЛЬКО АНГИОГЕННЫЙ ФАКТОР

Киселева Е.П.

НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

Ростовой фактор VEGF - один из основных ангио-генных факторов, вызывающих пролиферацию эндотелия in vitro и рост сосудов in vivo. VEGF также влияет на эндотелиальные клетки-предшсственники и является для них хемоаттрактантом, в результате чего стволовые клетки привлекаются к месту активного роста сосудов (Luttun, 2002.).

VEGF также способен взаимодействовать с гемопоэ-тическими костно-мозговыми клетками-предшественни-ками и изменять направление их дифференцировки. В частности показано, что в результате взаимодействия этого фактора с CD34T клетками через имеющийся у них рецептор первого типа (VEGFR1) происходит ипгибиция созревания дендритных клеток (Gabrilovich et al., 1996). В то же время, в условиях повышенного содержания VEGF в циркуляции происходит сдвиг гемопоэза в сторону образования незрелых гранулоцитарных Gr+ предшественников, содержание которых возрастает во всех органах иммунной системы (Gabrilovich et al., 1998). Кроме того, VEGF является фактором, способствующим выживанию гемопоэтических стволовых клеток (Gerber, 2002).

Недавно было показано, что VEGF влияет на созревание Т-лимфоцитов в тимусе (Ohm et al., 2003). Длительное введение VEGF интактным животным вызывает у них развитие инволюции тимуса с такой же динамикой и изменением клеточного состава тимоцитов, что и при росте опухоли. В наших экспериментах впервые было показано, что VEGF способен повышать чувствительность тимоцитов к развитию апоптоза в условиях in vivo и in vitro (Kiseleva, Gabrilovich, 2000).

VEGF влияет также и на систему монону клеарных фагоцитов. В частности, описано хемотаксическое действие этого фактора на моноциты крови человека (Clauss et al., 1996; Barleon et al., 1996). Привлечение макрофагов может способствовать усилению ангиогеиеза, поскольку клетки мононуклеарно-фагоци гарной системы способны продуцировать более 20 различных ангиогеиных молекул (Polvcrini, 1996).

В наших исследованиях было показано, что при инкубации макрофагов мышей в присутствии VEGF происходит усиление продукции нитроксид анионов (Крылов и др., 2002), которые способны оказывать ангиоген-

ное действие и усиливать пролиферацию эндотелия (Ziche, 1998). Кроме того, в перитонеальных клетках наблюдалось усиление экспрессии мРНК VEGF, а также мРНК VEGFR1. Следовательно, повышенный уровень содержания VEGF может не только привлекать к месту роста сосудов макрофаги, но и влиять на их ангиогенные свойства. Дополнительная продукция VEGF макрофагами и одновременное повышение их чувствительности к этому фактору за счет увеличения экспрессии рецепторов может оказывать влияние на происходящие процессы по типу дополнительной петли усиления.

Таким образом, VEGF - фактор, первоначально описанный как ангиогенный, имеет значительно более широкий спектр действия в организме: он влияет на гемопо-эз и обладает выраженными иммунорегуляторными свойствами. Тем самым этот фактор, кроме непосредственного воздействия на периферические эндотелиальные клетки и их костно-мозговые клетки-предшественники, индуцирует в организме еще и воспалительную реакцию, которая, как известно, является характерным признаком ангиогенеза. Поскольку уровень VEGF в циркуляции может значительно повышаться при беременности, раноза-живлеиии, опухолевом росте и других патологических состояниях, следует учитывать возможное системное воздействие этого фактора и его роль в патогенезе заболеваний, а также при проведении лечебных мероприятий.

Работа поддержана грантом РФФИ № 03-04-49186 и НШ №540.2003.4.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ЦИТОКИНОВ СЕМЕЙСТВА ИНТЕРЛЕЙКИНА-1 В ЗАЩИТЕ ОТ ПАТОГЕНОВ

Князькин И.В.. Бокованов В.Е., Минаева Е.Н., Синкевич И.Е., Симбирцев А.С.

ГНЦ НИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург, Россия

Одной из важнейших функций цитокинов является формирование и контроль развития защитных реакций организма при внедрении патогенов. Среди группы про-воспалительных цитокинов семейство интерлейкина-1 (IL-1) эволюционно сформировалось достаточно давно и в настоящее время насчитывает 10 индивидуальных белков, среди которых есть агонисты и антагонисты, а функции некоторых до сих пор не выяснены. Целью исследования стало изучение защитного противоинфекционно-го действия рекомбинантных IL-1 а и IL-1 р человека, а также регуляторной роли рекомбинантного рецепторного антагониста IL-1 человека (ralL) при различных экспериментальных бактериальных инфекциях у мышей, а также исследование влияния IL-1 на динамику различных иммунологических параметров. Защитный эффект IL-1 исследовался на беспородных мышах, инфицированных Y. pseudotuberculosis, К. pneumonia и Е. coli 026. Препараты IL-1 вводились внутрибрюшинно в различные сроки до и после заражения животных в дозах 2,20, 200 нг и 2 мкг па мышь. Иммунологические параметры исследовались в течение недели после введения IL-1. Согласно полученным результатам, препараты рекомбинантных IL-1 а и IL-1 (3, введенные за день до инфицирования, увеличивали выживаемость животных при инфицировании летальными дозами микроорганизмов. При введении инфицированным животным препарата рекомбинантного ralL не наблюдали изменений течения инфекционного

процесса и показателей выживаемости. Изменения иммунологических параметров наблюдали в основном в первые 24 ч после введения IL-1. Было отмечено достоверное повышение количества палочкоядерных нейтрофи-лов периферической крови, а также увеличение продукции кислородных радикалов и адгезии лейкоцитов. Таким образом, можно заключить, что IL-1 оказывает про-тивоинфекционное защитное действие, которое может быть связано со стимуляцией функциональной активности лейкоцитов.

ПРОТИВОГЕРПЕТИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ КОМПЛЕКСА ПРИРОДНЫХ ЦИТОКИНОВ И ПРОТИВОМИКРОБНЫХ ПЕПТИДОВ

Ковальчук Л.В.. Баркевич O.A.*, Ганковская Л.В., Лавров В.Ф.*, Лотте В.Д.*

Российский государственный медицинский университет, Москва, Россия;

*НИИ вирусных препаратов им. О.П.Анджапаридзе РАМН, Москва, Россия

В настоящее время герпетическая инфекция является одним из наиболее распространенных вирусных заболеваний человека. Легкость инфицирования, латентное и пожизненное течение, развитие вторичного иммунодефицита ставит задачу поиска новых иммуномодулирующих препаратов с противовирусным действием.

В данной работе изучено противовирусное действие комплекса цитокинов и противомикробных пептидов (препарат Суперлимф) в культуре клеток Vero, инфицированных вирусами простого герпеса 1 и 2 типа (ВПГ-1, штамм VR-3, и ВПГ-2, штамм MS). Результаты экспериментов были подсчитаны с помощью метода Рида и Мен-ча. Для выяснения причин снижения цитопатического действия вируса использовали метод электронной микроскопии.

В результате было выявлено, что комплекс цитокинов и противомикробных пептидов обладал герпесингибиру-ющим действием (особенно при внесении препарата до заражения вирусом) в оптимальной концентрации 100 мкг/мл. Методом электронной микроскопии было выявлено, что ингибирующее действие комплекса выражалось в продукции дефектной неинфекционной популяции. Это приводило к блокированию инфекционного процесса, снижению инфекционной активности вирусного потомства на 1,5-2 порядка.

Полученные данные по механизму противовирусного действия препарата Суперлимф послужили обоснованием для его локального применения в комплексном лечении генитального герпеса.

ВЛИЯНИЕ ЭКЗОГЕННОГО ТИРОКСИНА НА ФОРМИРОВАНИЕ ГУМОРАЛЬНОГО И КЛЕТОЧНООПОСРЕДОВАННОГО ИММУННОГО ОТВЕТА В ПЕРИОД АНТИГЕННЕЗАВИСИМОГО И АНТИГЕНЗАВИСИМОГО ЭТАПОВ ИММУНОГЕНЕЗА

Красных М.С.. Бахметьев Б.А., Ширшев С.В.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Тиреоидные гормоны играют важную роль в нейроэндокринной регуляции процессов иммуногенеза. В экс-

периментах in vivo к in vitro установлено, что трийодти-ронин и тироксин (Т4) способны изменять реакции как гуморального, так и клеточноопосредованного иммунитета. Установлено непосредственное участие Т4 в контроле процессов антигеннезависимого и антигензависимо-го этапов созревания иммунокомпетентных клеток при гуморальном иммунном ответе и определена зависимость данных эффектов от дозы гормона. Вместе с тем, влияние Т4 на поляризацию иммунных реакций в сторону гуморальных (Th2) или клеточноопосредованных (Thl) в период антигеннезависимого и антигензависимого этапов иммуногенеза до настоящего времени не исследовано. Поэтому целью данной работы явилось изучение влияния экзогенного Т4 на формирование антителообразующих клеток (АОК) и/или реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) в период антигеннезависимого и антигензависимого этапов иммуногенеза.

Материалы и методы. Эксперименты проведены на мышах-самцах породы Swiss. Животные были разделены на 3 группы. Одной из групп вводили Т4 подкожно в суточной дозе 0,04 мг/кг, другой - 40 мг/кг, а контрольной инъецировали растворитель гормона по аналогичной схеме. Эффекты введения Т4 на гуморальные и/или клеточноопосредованные иммунные реакции оценивали, используя несколько схем иммунизации: для одновременной индукции и гуморальной и клеточной составляющих первичного системного иммунного ответа животных внутрибрюшинно иммунизировали 1*108 эритроцитов барана (ЭБ), через 4 дня после сенсибилизации под апоневроз стопы этих мышей вводили 5*107 ЭБ. Спустя 24 часа оценивали число АОК в селезенке прямым методом локального гемолиза по Ерне и выраженность реакции ГЗТ по степени утолщения стопы. Для генерации первичного системного иммунного ответа животных внутрибрюшинно иммунизировали 1*10® ЭБ с последующей (через

5 суток) регистрацией числа АОК в селезенке. Для формирования первичного локального иммунного ответа проводили сенсибилизирующую (14108 ЭБ) и разрешающую (54 107 ЭБ) иммунизацию под апоневроз стопы мышей с интервалом в 4 дня. Оценивали выраженность реакции ГЗТ. Продолжительность введения Т4 в этих моделях составляла 5 дней. При анализе действия гормона на анти-геннезависимый этап формирования ответной реакции гормон инъецировали в течение 5 дней до иммунизации, а на антигензависимый этап - в течение 5 дней после иммунизации.

Основные результаты. Инъекции Т4 в период антигеннезависимого этапа формирования и гуморальной и клеточной составляющих иммунного ответа дозозависимо стимулировали выраженность реакции ГЗТ с наибольшим эффектом в условиях введения 40 мг/кг Т4. При этом гормон не влиял на численность АОК в селезенке. Несколько иные данные были получены при введении гормона на антигензависимом этапе иммуногенеза. В этих условиях Т4 не оказывал статистически значимого влияния на формирование иммунных реакций.

Введение Т4 в дозе 0,04 мг/кг на протяжении антигеннезависимого этапа формирования гуморального иммунного ответа сопровождалось повышением численности АОК в селезенке. С увеличением дозы гормона данные эффекты нивелировались. Напротив, инъекции Т4(40 мг/ кг) после иммунизации стимулировали формирование АОК в селезенке.

Введение гормона на антигеннезависимом этапе формирования клеточноопосредованного иммунного ответа

лозозависимо усиливало выраженность реакции ГЗТ, с максимальным эффектом в условиях инъецирования

0,04 мг/кгТ/г Напротив, на аптигснзависимом этапе стимуляция реакции ГЗТ наблюдалась только при введении 40 мг/кг гормона.

Заключение. Таким образом, в условиях формирования и гуморальной и клеточной составляющих иммунного ответа реализация стимулирующего действия Т4 па реакцию ГЗТ осуществляется через аитпгеннезависимую стадию дифферснцировки нммунокомнетентиых клеток из предшественников. При индукции либо гуморального иммунного ответа впутрибрюшинпой иммунизацией, либо клеточноо-носредованного - локальной иммунизацией эффекты введения низкой дозы гормона преимущественно реализуются на антигеннезависимом этапе, где «мишеныо» для действия гормона, по-видимому, являются наивные клетки (ТЬО), а эффекты введения высокой дозы Т4, преимущественно проявляющиеся на аптигснзависимом этапе, реализуются, очевидно, через зрелые Т- лимфоциты (ТЫ).

ЭКСПРЕССИЯ мРНК РЕЦЕПТОРОВ ДЛЯ VEGF В КЛЕТКАХ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ

Крылов A.B.. Киселева Е.П., Людыно В.И.

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

Клетки иммунной системы играют важную роль в ап-гиогепезе. Фактор роста сосудистого эндотелия VEGF является основным медиатором ангиогенеза, обладающим вместе с тем выраженной иммупорегуляторной активностью. В процессе неоваскулярпзации сывороточные концентрации VEGF могут существенно увеличиваться, однако реакция клеток иммунной системы на повышение уровня VEGF остается мало изученной. VEGF представлен в сыворотке в нескольких формах, основной из которых является VEGFA. Ои связывается с клетками через рецепторы двух типов (VEGFR1 и VEGFR2), опосредующих все основные проангиогенпые эффекты данного фактора.

Целью настоящего исследования явилось изучение распределения VEGFR1 и VEGFR2 на иммунокомпетентпых клетках, а также влияние VEGF па экспрессию мРНК собственных рецепторов. В качестве обьектов исследования были взяты изолированные тимоциты, стромальные клетки тимуса, клетки лимфатических узлов, клетки перитонеального экссудата и культура макрофагов мышей. В качестве положительного контроля использовали богатую сосудами ткань легкого мыши, поскольку известно, что в клетках эндотелия выявляются оба рецептора (FerraraN., 2002). Оценку экспрессии мРНК VEGFR1 и VEGFR2 оценивали методом ОТ-ПЦР со специфическими праймерами.

Результаты исследований показали, что изолированные тимоциты экспрессируют мРНК VEGFR2, но ие VEGFR1. При этом в стромальпых клетках тимуса, оставшихся после раздавливания и пропускания клеточной суспензии через фильтр, были обнаружены оба рецептора. В изолированных клетках лимфоузлов была обнаружена только мРНК VEGFR2. Клетки перитонеального экссудата экспрессировали мРНК обоих типов рецепторов. В суточной культуре макрофагов, полученной путем многократного отмывания мопослоя от пеирилипающих к стеклу клеток, также были обнаружены оба рецептора.

При инкубации клеток перитонеального экссудата со 100пг/мл VEGF в течение 24 часов происходит усиление

экспрессии мРНК VEGFR1, а инкубация клеток лимфоузлов в тех же условиях стимулирует экспрессию мРНК VEGFR2.

Наличие на тимоцитах VEGFR2 показано нами впервые. Это указывает на возможность непосредственного взаимодействия VEGF с клетками тимуса. Ранее нами было показано, что VEGF влияет на пролиферацию и апоптоз тимопитов (Kisseleva,Gabrilovich,2000). В настоящей работе удалось установить экспрессию мРНК рецептора, через который, возможно, опосредованы эти эффекты. Данные по экспрессии мРНК VEGFR1 и VEGFR2 в клетках лимфоузлов соответствуют данным литературы: наличие VEGFR2 было показано на клеточной линии, полученной из лимфоузлов крыс (Мог et al.,2004). Нами впервые была показана экспрессия генов обоих типов рецепторов в перитонеальных макрофагах мыши. До сих пор рецепторы к VEGF были изучены только на моноцитах крови человека, хемотактический ответ которых был опосредован через VEGFR1 (Clauss etal, 1996). Полученные данные имеют важное значение для понимания механизмов взаимодействия ангиогенеза и клеток иммунной системы.

Работа поддержана грантом РФФИ №03-04-49186 и НШ №540.2003.4.

ВЛИЯНИЕ ГИП0ФИЗЭКТ0МИИ НА ПОКАЗАТЕЛИ ИММУНИТЕТА, ЭРИТРОПОЭЗА, СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ И ФИБРИНОЛИЗА У ЦЫПЛЯТ И СТАРЫХ КУР

Кузник Б.И.. Патеюк А.В., Данилишин Ю.Б., Люлькина Е.В., Джулай М.А., Баранчугова Л.М.

ГОУ В ПО Государственная медицинская академия, Чита, Россия

Институт биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия

Целью нашего исследования явилось изучение влияния гипофизэктомии па иммунитет, гемостаз и показатели эрит-ропоэза у пеоиаталыю оперированных цыплят и старых кур.

Эксперименты проведены на 50 цыплятах, только что вылупившихся из яиц, и 20 старых курах в возрасте 5 лет, у которых репродуктивный период закончился около 1 года назад.

У 40 цыплят в первые 6 часов жизни осуществляли гипофизэктомшо, 10 цыплятам делали ложную операцию. У 10 старых кур была проведена гииофизэктомия, а 10 служили контролем - им произведена ложная операция.

У всех цыплят и старых кур через 1,5 месяца после операции определяли показатели иммунитета и гемостаза.

За 10 и 5 суток перед выведением из эксперимента всех птиц иммунизировали эритроцитами барана. Через 5 дней вслед за последней иммунизацией определяли реакции гемагглютинации и гемолиза с эритроцитами барана, а в селезенке животных регистрировали количество антителообразующих клеток (АОК) и индекс антителозависимой клеточной цитотоксичпости (АЗКЦ). Кроме того, в периферической крови экспериментальных птиц подсчитывали содержание лейкоцитов и лейкоцитарную формулу по общепринятым методам.

Для оценки состояния свертывающей системы крови и фибриполиза использовали следующие показатели: время рекальцификации плазмы, активированное частичное тромбопластиновое время (АЧТВ), протромбиновое и тромбиповое время, концентрацию фибриногена, время растворения эуглобулиновой фракции плазмы, свернутой хлоридом кальция.

У всех птиц определяли также число эритроцитов, уровень гемоглобина, цветовой показатель и содержание гемоглобина в 1 эритроците (СГЭ).

У гипофизэктомированных цыплят значительные изменения выявлены в иммунных органах. У них резко уменьшалось число лейкоцитов за счёт уменьшения количества лимфоцитов. Масса бурсы у них увеличивалась почти в 3,6 раза, более чем в 2,5 раза возрастала плотность клеток в селезенке, хотя ее масса по отношению к массе тела снижалась в 4 раза. В селезенке падало число АОК в

3,4 раза, масса тимуса снижалась в 3,1 раза. У таких цыплят практически нельзя было обнаружить агглютинины и гемолизины и не удавалось оценить АЗКЦ.

После гипофизэктомии у старых кур изменения в иммунных органах значительно отличались от тех, которые были обнаружены у неонатально оперированных цыплят. Так, после удаления гипофиза у старых кур масса тнмуса уменьшалась всего на 15,2%, тогда как масса тимуса но отношению к массе тела снижалась приблизительно в такой же степени, как и у цыплят. Выраженных изменений массы бурсы и селезенки у старых кур, по сравнению с цыплятами после гипофизэктомии, не наблюдалось.

Изменение числа лейкоцитов, лейкоцитарной формулы, АЗКЦ, количества АОК в селезенке, титра гемагглютини-нов и гемолизинов у старых кур после гипофизэктомии было выражено в значительно меньшей степени, чем у цыплят.

Полученные данные свидетельствуют о том, что контроль гипофиза над развитием и функциями вилочковой железы, сумки Фабрициуса и селезенки у цыплят в первые часы жизни более выражен, чем у старых кур.

После гипофизэктомии и у цыплят, и у старых кур развивалась анемия и снижалось содержание гемоглобина в одном эритроците.

Гинофизэктомия у цыплят и старых кур сопровождалась гиперкоагуляцией, проявляющейся в сокращении времени свертывания крови и рекальцификации плазмы, АЧТВ, нро-тромбинового и тромбинового времени, а также угнетением фибринолиза. Сдвиги в системе гемостаза после гипофизэктомии были выражены в меньшей степени у старых кур по сравнению с неонатально оперированными цыплятами.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что при неонатальной гипофизэктомии но сравнению со старыми курами наблюдаются более выраженные сдвиги со стороны клеточного и гуморального иммунитета, показателей красной крови и системы гемостаза. Следовательно, иммуногенез, эритропоэз и свертывающая активность крови и фибринолиз в большей степени подвержены влиянию гипофиза на ранних этапах онтогенеза, которое практически не проявляется в старческом возрасте.

ГОРМОНАЛЬНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ ТИМОЦИТОВ ПРИ БЕРЕМЕННОСТИ

Куклина Е.М.1. Ширшев С.В.1, Шарова Н.И.2, Ярилин A.A.2

1 Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия;

2 ГНЦ - Институт иммунологии ФУ МБЭП М3 РФ, Москва, Россия

Исследование иммуномодулирующей активности репродуктивных гормонов необходимо для понимания механизмов, определяющих изменение иммунного статуса организма при беременности. Потенциальной мише-

ныо гормональной регуляции в этот период является тимический этап дифференцировки Т-лимфоцитов.

Целью настоящей работы было исследование влияния хорионического гонадотропина (ХГ), эстрадиола, прогестерона и их физиологических сочетаний, характерных для разных триместров беременности, на дифферен-цировку тимоцитов человека in vitro в присутствии тимических эпителиальных клеток (ТЭК).

Материалы и методы. Тимоциты выделяли из фрагментов тимуса человека, удаляемых в ходе сердечно-сосу-дистых операций в соответствии с общепринятой хирургической практикой. Фенотип клеток оценивали иммуно-флуоресцентным анализом с помощью моноклональных антител к мембранным маркерам CD3, CD4 и CD8, а пролиферацию - по включению 3Н-меченого тимидина.

Основные результаты. Показано, что ХГ в высокой физиологической дозе (100 ME/мл), соответствующей 1 триместру беременности, усиливает индуцируемое эпителием фенотипическое созревание тимоцитов, что регистрируется по повышению экспрессии CD3 и переходу С04+8+-клеток в CD4+8‘ и CD4'8+. Наряду с этим повышается и пролиферативный ответ тимоцитов на митоген, свидетельствуя о функциональном созревании клеток. Эстрадиол в дозах 1,0 и 10 пг/мл, характерных соответственно для I и III триместров беременности, обладает аналогичным действием, тогда как прогестерон не оказывает влияния на дифференцировку тимоцитов в присутствии ТЭК. Комбинация ХГ, эстрадиола и прогестерона, соответствующая I триместру, также усиливает фенотипическое и функциональное созревание тимоцитов, что обеспечивается, по-видимому, аддитивным действием ХГ и эстрадиола. Стимулирующее действие отдельных гормонов и их сочетаний на ТЭК-зависимую дифферепци-ровку тимоцитов опосредуется гуморальными факторами тимусного эпителия. Кроме того, ХГ в высокой физиологической дозе обладает собственной дифференциро-вочной активностью в отношении тимоцитов, стимулируя фенотипическое и функциональное созревание этих клеток в монокультуре. В последнем случае эффекты ХГ связаны с непосредственным действием гормона на тимоциты. Эстрадиол в высокой дозе также вызывает незначительные фенотипические изменения, связанные с повышением экспрессии CD3. Тем не менее, в комбинации с другими гормонами самостоятельные дифференци-ровочные эффекты и ХГ, и эстрадиола не проявляются.

Заключение. Тимический этап дифференцировки эффективно регулируется репродуктивными гормонами и является, по-видимому, важным механизмом гормонального контроля Т-клеточного звена иммунной системы в период беременности.

СОПОСТАВЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ CD34+ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК ПУПОВИННОЙ КРОВИ ДО И ПОСЛЕ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ

Куртова A.B.. Комарова Л.С., Зуева Е.Е., Бабенко Е.В., Эстрина М.А., Фрегатова Л.М., Афанасьев Б.В.Дотолян Арег А.

Государственный медицинский университет им. акад. И.П.Павлова, Санкт-Петербург, Россия

После первой успешной трансплантации клеток пуповинной крови, проведенной во Франции мальчику с

анемией Фанкони, гемопоэтические стволовые клетки пуповинной крови стали рассматриваться как альтернативный костному мозгу источник материала для аллогепных трансплантаций. Одним из главных критериев успешной приживляемое™ донорского материала является достаточное количество стволовых клеток в трансплантате. Обычно количественный учет гемопоэтических стволовых CD34+ клеток осуществляется до криоконсервирования. Целыо данной работы была проверка сохранности гемопоэтических стволовых CD34+ клеток пуповинной крови после процедуры размораживания.

Образцы пуповинной крови (п=6) были подготовлены к криоконсервировапию добавлением 10% диметил-сульфоксида и заморожены по методике 1 градус/мин до -40°С, затем 4 градуса/мин до -50°С, после чего помещены в жидкий азот (-196°С). Средняя длительность хранения составила 394 дня (380-401). Размораживание было проведено при температуре 37-40°С, после чего была проведена пробоподготовка по протоколу окрашивание-лизис-отмывка (CD45FITC/CD14PE,

CD45FITC/CD34PE (Becton Dickenson), CD45FITC(BD)/7AAD (Pharmingcn)) для учета количества гемопоэтических стволовых клеток на проточном цитометре. Во всех образцах до и после размораживания были оценены следующие параметры: количество ядросодержащих клеток (CD45 + ), мононуклеаров (CD45+CD14+), стволовых клеток (CD45+CD34+ клетки с низким и промежуточным уровнем гранулярности) и их жизнеспособность. Относительное содержание CD34T клеток было определено среди ядросодержащих CD45+ клеток и составило до криоконсервирования в среднем 0,51 ±0,04% (0,35-0,68), а после хранения и размораживания 0,31±0,01% (0,22-0,46). Отличие выборок достоверно при р<0,05.

Снижение содержания гемопоэтических стволовых клеток после криокопсервирования и проведения процедуры размораживания свидетельствует о необходимости введения дополнительных криопротекторов и усовершенствования процедуры размораживания образцов пуповинной крови.

АДРЕНЕРГИЧЕСКАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ФАГОЦИТАРНОЙ АКТИВНОСТИ НЕЙТРОФИЛОВ ПРИ ОСТРОМ СТРЕССЕ И ВВЕДЕНИИ ГИДРОКОРТИЗОНА

Ланин Д.В.*. Орлова Е.Г., Шилов Ю.И.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия;

*Пермский государственный университет,

Пермь, Россия

Известно, что глюкокортикоиды оказывают пермис-сивнос действие по отношению к катехоламинам, повышая экспрессию адренорецепторов на клетках-мишенях различных органов. Однако механизмы адренергической регуляции функций фагоцитирующих клеток при стрессе изучены недостаточно.

Цель работы - изучить влияние адренергических соединений in vitro на фагоцитарную активность пейтрофи-лов периферической крови крыс при остром стрессе и введении гидрокортизона.

Материалы и методы. Эксперимент выполнен на крысах-самцах популяции Wistar. Животные 1-й группы были подвергнуты острому 6-часовому иммобили-

зационному стрессу в сочетании с дозированной кро-вопотерей. Крысы 2-й группы подвергались аналогичному воздействию в условиях блокады |3-адренорецеп-торов (2 подкожные инъекции по 5 мг/кг массы тела пропранолола гидрохлорида с интервалом 3 ч, первая инъекция - за 30 мин до начала иммобилизации). Животные 3-й группы получали однократно внутрибрю-шинно гидрокортизона ацетат в дозе 50 мг/кг массы тела. Животным 4-й группы вводили гидрокортизон в той же дозе на фоне блокады (3-адренорецепторов (4 инъекции пропранолола по 5 мг/кг массы тела подкожно с интервалом 3 ч, 1-я инъекция - за 30 мин до введения гидрокортизона), крысы 5-й группы подвергались только блокаде (З-адрепорецепторов (по схеме, аналогичной 4-й группе). Влияние адреналина гидрохлорида (0,1 мкг/мл), агониста (3-адренорецепторов тербута-лина сульфата (10*6 М) и ингибитора фосфодиэстера-зы теофиллина на фагоцитарную активность нейтрофи-лов периферической крови по отношению к формали-низированным эритроцитам барана оценивали in vitro в условиях 60-минутной нреинкубации клеток крови с указанными соединениями у интактпых животных, а также через 6 и 24 ч от начала иммобилизации или введения гидрокортизона. Контролем служили пробы с преинкубацией без препаратов.

Результаты исследования. В системе in vitro у интак-тных животных выявлен угнетающий ((3-адрепергичес-кий) эффект адреналина на фагоцитарную активность нейтрофилов периферической крови. При этом агонист [3-адренорецепторов тербуталин и ингибитор фосфодиэ-стеразы теофиллин оказывали сходное действие, что подтверждает предположение об угнетающем влиянии стимуляции (3-адренорецепторов на фагоцитарную активность нейтрофилов.

При стрессе через 6 ч от начала иммобилизации адреналин in vitro не влиял па показатели фагоцитоза нейтрофилов, а через 24 ч отмечался угнетающий эффект. Поздние эффекты адреналина на фоне стресса, по-видимому, опосредованы пермиссивным действием глюкокорти-копдов, повышающих экспрессию (3-адрепорецепторов при стрессе, поэтому угнетающий ((3-адренергический) эффект становится доминирующим. Сходные закономерности выявлены в эксперименте, где при введении гидрокортизона in vivo угнетающее действие адреналина и тербуталина in vitro на фагоцитарную активность нейтрофилов усиливалось.

На фоне блокады (З-адреиорецепторов при стрессе адреналин in vitro, действуя через а-адренорецепторы, стимулировал показатели фагоцитоза нейтрофилов. При введении гидрокортизона па фоне блокады (3-адренорецепторов адреналин in vitro через 6 ч от начала эксперимента повышал фагоцитарную активность нейтрофилов, а через 24 ч не влиял на показатели фагоцитоза, что, возможно, связано с изменением экспрессии (3-адренорецепторов после отмены их блокады. При введении гидрокортизона на фоне блокады (З-адреиорецепторов (3-адре-номиметик тербуталин депрессивного эффекта не оказывал.

На фоне изолированного введения пропранолола in vivo наблюдалась отмена депрессивного эффекта адреналина in vitro через 6 ч от начала эксперимента, а через 24 ч угнетающее действие адреналина in vitro появлялось вновь, что связано с особенностями фармакокинетики пропранолола. Тербуталин в этих условиях эффекта не оказывал.

Заключение. В условиях стресса и введения глюко-кортикоидов выявлены фазные изменения чувствительности фагоцитирующих клеток к адренергической регуляции и направленности действия на них адреналина in vitro, что может быть связано с регуляцией глюкокорти-коидами функциональной экспрессии разных типов ад-ренорецепторов.

СОЗДАНИЕ МОДЕЛИ ПУЗЫРЧАТКИ НА МЫШАХ

Лысенко А.А..Коиарева О.Д.,Мушенкова Н.В.*, Дзуцева И.Р.*, Матушевская Е.В., Свирщевская Е.В

Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН;

* Российский государственный медицинский университет, Москва, Россия

В основе патогенеза аутоиммунной пузырчатки лежит индукция аутоантител к белкам десмосом кератиноцитов эпидермиса десмоглеинам 1 и 3 (дсг). На настоящее время нет модели этого заболевания на животных, что ограничивает возможности изучения патогенеза и поиск путей лечения пузырчатки. Целью данной работы являлось создание модели пузырчатки на мышах. Для индукции аутоантител был экспрессирован ген и получен белок, соответствующий двум дистальным доменам внеклеточной части молекулы дсгЗ человека (Д1-2). Белком Д1-2 иммунизировали мышей трех линий BALB/c, C57BL6 и СВА, что являлось необходимым для поиска чувствительной линии мышей, так как известно, что данное заболевание генетически детерминировано. В эксперименте использовали по две группы мышей, одну из которых иммунизировали только белком, а второй дополнительно вводили мышиный гамма IFN (IFN-y), что позволяет усилить участие клеточного ответа в патогенезе болезни. В результате двух циклов иммунизации были получены различные результаты для разных линий. У мышей линии BALB/c не было видимых проявлений болезни. Все мыши линии СВА, получавшие IFNy, погибли в течение двух недель после начала введения IFN-y с видимыми признаками истощения. У мышей линии C57BL6 в группе с IFN-y появилось характерное облысение в районе шеи. Гистологический анализ кожи мышей C57BL/6 показал наличие внутриэпидермального акантолиза, характерного для пузырчатки. Анализ дсгЗ, специфичных IgG в сыворотке мышей, показал, что у BALB/c мышей наблюдался низкий уровень продукции антител, тогда как у линий C57BL/6 и СВА титры антител были значительно выше и сравнимы между собой. Уровень продукции антител в группах с IFN-y был достоверно выше, чем в контрольных группах. Причем продукция антител у мышей разных линий в группах с IFNy практически сравнивалась. Таким образом, полученные данные показывают, что в зависимости от гаплотипа иммунизация мышей высоко гомологичным белком может вызывать формирование непатогенного аутоиммунного ответа на гомологичный белок (BALB/c), патогенного ответа, приводящего к гибели мышей без признаков акантолиза (СВА), патогенного ответа с выраженным акантолизом кожи (C57BL/ 6). Во всех случаях патогенные проявления сильнее всего наблюдались у мышей, которым дополнительно вводили IFNy, что подчеркивает ключевое участие Т-клеток в патогенезе пузырчатки.

ВЫЯВЛЕНИЕ АНТИНУКЛЕАРНОГО ФАКТОРА, АНТИКЕРАТИНОВЫХ АНТИТЕЛ И АНТИПЕРИНУКЛЕАРНОГО ФАКТОРА У БОЛЬНЫХ С РЕВМАТОИДНЫМ АРТРИТОМ.

Мазинг A.B.. Лапин С.В., Тотолян Арег А.

Научно-методический центр по молекулярной медицине МЗСР РФ, Санкт-Петербург, Россия

Введение. Антинуклеарный фактор (АНФ) является основным серологическим маркером системных заболеваний соединительной ткани и отмечается у значительной части больных ревматоидным артритом (РА). Среди специфичных для РА аутоантител самыми важными являются ревматоидный фактор (РФ) и антифилаггрино-вые антитела (АФА), которые могут быть выявлены в сыворотке 60-80% пациентов с РА.

Целью нашего исследования было изучение встречаемости АНФ, выявляемого методом непрямой иммунофлуоресценции с использованием в качестве субстрата клеточной линии НЕр-2, и его совместное определение с АФА и РФ у больных РА.

Материалы и методы. Нами были обследованы сыворотки 78 больных с ранним РА и 85 больных с поздним РА. Группу сравнения составили сыворотки 18 пациентов с реактивным артритом и 20 пациентов с остеоартрозом. В качестве контроля были использованы сыворотки 51 здорового донора, сопоставимые по полу и возрасту с исследуемой группой. АНА выявлялись методом непрямой иммупофлуоресцепции (РИФ) с использованием в качестве субстрата криосрезов печени крысы и монослоя клеточной линии НЕр-2. АПФ и АКА также выявлялись методом РИФ, используя клетки букального эпителия человека и криосрезы пищевода крысы соответственно. Анти-ССП выявлялись иммуноферментным методом с использованием коммерческой системы DIASTAT Anti-CCP(Axis Shield, Англия).

Результаты. Встречаемость АНА у пациентов с РА составила 38% (60/163), у больных реактивным артритом 5,5% (1/18), у пациентов с остеоартрозом 15% (3/20), в группе здоровых доноров они обнаруживались у 6% (3/ 51). АФА были выявлены в 61% случаев (101/163) РА, РФ обнаруживался в 42% случаев (69/163). Чувствительность метода выявления АНА с использованием клеточной линии НЕр-2 была в два раза выше, чем чувствительность метода при использовании в качестве субстрата криосрезов печени крысы. Пациенты, позитивные по АНА при использовании печени крысы, также были позитивны при использовании в качестве субстрата культуры клеток. У пациентов с поздним РА встречаемость АНА была достоверно выше, чем у пациентов с ранним РА. При использовании клеточной линии НЕр-2 у пациентов с РА мы выявили 4 типа флуоресцентного свечения: гранулярное, гомогенное, ядрышковое, цитоплазматическое. При этом частота выявления гранулярного типа свечения не зависела от длительности течения РА, в то время как частота выявления других типов свечения была значительно выше у пациентов с поздним РА. Большая часть АНА положительных пациентов также были АФА позитивными.

Выводы. Выявление АНА с использованием клеточной линии НЕр-2 является более чувствительным методом, чем использование для данного метода криосрезов печени крысы и позволяет обнаружить АНА у 40% больных с РА. При этом преобладает гранулярный тип свече-

ния. Частота и специфичность выявления аутоантител повышается с увеличением длительности заболевания. Высокая частота совместной встречаемости АНА и ЛФА, по-видимому, может быть объяснена наличием в ядре клеток цитруллинсодержащих белков.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ РОНКОЛЕЙКИНА И ГЛУТОКСИМА ПРИ ТЕРАПИИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА У ИММУНОСУПРЕССИРОВАННЫХ МЫШЕЙ

Митин Ю.А.. Буланьков Ю.И., Кацалуха В.В., Пак Н.В.

Воеппо-медицинская академия, Санкт-Петербург, Россия

В последние годы в качестве новых средств, используемых для терапии туберкулеза в эксперименте и клинике, активно изучаются иммунокоррскторы ронколей-кип и глутоксим (Соколова Г.Б. с соавт., 2002; Васильева С.Н., 2004). Ропколейкнн - рекомбинантный интерлейкин-2 человека, белок с молекулярной массой более 15000 Да. Глутоксим - низкомолекулярный химически синтезированный гексапептид со стабилизированной дисуль-фидной связью (М=676Да). Они обладают заместительным и/или индуктивным действием на иммунную систему.

Целью настоящего исследования явилась сравнительная оценка терапевтической эффективности препаратов ропколейкина и глутоксима, а также их сочетаний с изо-пиазидом при экспериментальной туберкулезной инфекции у иммунокомпетептпых и иммуно-супрессированпых животных.

Исследование проведено па 220 белых рандомбредпых мышах-самцах массой 20-22 г. Использовали рекомбинантный дрожжевой интерлейкин-2 человека (роиколейкип) производства ТОО «Биотех» (Санкт-Петербург) и глутоксим производства ЗАО «ФАРМА ВАМ» (Москва). Роиколейкип вводили внутрибрюшинно в суточной дозе 12,5 мг/кг; глутоксим - в дозе 25,0 мг/кг; изопиазид внутримышечно в дозе 10 мг/кг в течение 15 дней. Иммуно-дефпцитпые состояния вызывали тотальным облучением (5,5 Гр, за 3-4 сут. до заражения) либо с помощью гидрокортизона (125мг/кг трехкратно: за 2 ч до заражения и далее с интервалом в 2-3 дня). В предварительных экспериментах установлено, что эти режимы позволяют значительно подавить клеточный и гуморальный иммунитет. Для моделирования туберкулезной инфекции использовали штамм М. bovis-bovinus 8, чувствительный к противотуберкулезным препаратам (из музея бактериологической лаборатории НИИ фтизиопульмонологии М3 РФ). Заражение проводили внутривенно в дозе 0,5 мг/0,2 мл. Эффективность лечения оценивали но уровню выживаемости животных (%) в опыте и контроле, величине средней продолжительности жизни (сут.), а также массе тела. Наблюдение за животными проводили в течение 45 сут.

При отсутствии иммуносупрессии и лечения через 45 суток после заражения наблюдалась гибель 70-100% белых мышей. При ионотерапии изониазидом летальность снижалась до 15-20%, ронколейкином, глутоксимом - до 30-40%. Комбинированное применение изониазида и им-мунокоррскторов дало такой же защитный эффект, как и применение одного изониазида - летальность 15%.

Из числа облученных мышей в течение первых 15 сут. после заражения погибло 100% не леченных животных.

В группе, получавшей изопиазид, гибель составила 60%. Назначение ронколейкина не повысило уровень выживаемости как при монорежиме, так и в комбинации с изониазидом - все 100% животных этих групп пали. Причем, подавляющее количество мышей погибли раньше животных контрольной группы - уже к 21-24 суткам после заражения. Комбинированное применение изониазида и глутоксима оказало такой же терапевтический эффект, как и один изопиазид - в этом случае летальность животных была равна 60%.

При иммунодефиците, вызванном гидрокортизоном, летальность полеченных животных составила 90%. Терапевтическая эффективность препаратов, как и у облученных мышей, также была снижена: при монотерапии ронколейкином пало 100% животных; в группе, получавшей изопиазид, - 60%. В то же время комбинированное применение изониазида и ронколейкина дало высокий терапевтический эффект - в этих группах до 90-100% животных выжили, что на 50-60% превышает эффект моноте-раиии изониазидом.

Таким образом, иммупокорректоры роиколейкип и глутоксим при экспериментальной туберкулезной инфекции обладают примерно одинаковой терапевтической эффективностью, однако при кортикостероидном иммуно-дефицитном состоянии их лечебное действие существенно выше.

ГИПОТЕЗА ПРОСТРАНСТВЕННО-ВРЕМЕННОЙ ОРГАНИЗАЦИИ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ.

Михайленко A.A.

Тверская государственная медицинская академия, Тверь, Россия

В конечном счете, результатом деятельности иммунной системы является строго специфичное уничтожение (деструкция) ненужных и/или вредных для организма белковых молекул и пролиферативно-дифференцировоч-пый стимул для нужных и полезных белковых структур на основе строгой дифференциации собственного и чужого происхождения этих белковых структур. Специфичность является базисом реализации эффекторных механизмов иммунной системы и подразумевает строго конкретные и избирательные точки приложения действия этих механизмов. При этом считается, что сформировавшиеся конкретика и избирательность эффекторных механизмов достаточно постоянны во времени и распространяются на все пространство, курируемое данной иммунной системой. Именно это представление является основой имеющихся подходов к иммунодиагностике и иммунотерапии. Вместе с тем, накапливается все больше данных не в пользу этой стабильности, свидетельствующих об изменчивости силы и специфичности иммунного ответа в пространстве и во времени. Прежде всего следует сослаться па принцип мозаичности функционирования структурных компонентов, сформулированный Д. С. Саркисовым. Суть принципа заключается в том, что функциональная активность структурных компонентов неравномерна и это распределение функциональной активности структурных компонентов в пространстве и во времени зависимо от величины функциональной нагрузки. Следующим шагом явилось развиваемое О. К. Гавриловым и его последователями учение о системе регулирования агрегатного со-

стояния крови (система PACK), подразумевающее неоднозначность гсмостатического потенциала в разное время и в разных точках пространства на основе принципа мобилизуемое™, определяющего быстрое построение дробных комбинаций, в том числе противоположной направленности, обеспечивающих функциональной системе получение полезного приспособительного результата. Другими словами, у одного и того же человека в одно и то же время в разных точках его организма может быть разная активность свертывающей и противосвертывающей систем, так же как и в разное время в одной и той же точке может быть разная активность этих альтернативных систем, что не позволяет судить о состоянии гемостаза на основании его параметров, определенных только в венозной или капиллярной крови, взятых однократно. Особенно значимы работы H. Н. Кеворкова, Ю. И. Шилова, С. В. Ширшова, В. А. Черешнева, представленные в мопграфии «Гормоны репродукции в регуляции процессов иммунитета», показавших, что в процессе беременности активированная иммунная система на основе саморегуляции индуцируемой фетаплацентарной единицей, вычленяет позитивное иммунотрофическое воздействие на процесс эмбриогенеза, предотвращает агрессивные эффекторные воздействия, замещающиеся блокирующими и усиливающими рост плода. Важно подчеркнуть, что, по их данным, для всех белков и гормонов репродукции выявлена зависимость их синтеза и концентрации от срока беременности и наблюдалась строгая компартментализация, определяющая специфику иммуномодулирующего влияния, избирательно блокируя или активируя те звенья или клеточные клоны, которые определяли развитие событий в данном компартаменте. Складывается впечатление о том, что направленность, сила и специфичность эффек-торного деструктивно-продуктивного потенциала иммунной системы в разных точках пространства и в разные временные интервалы разная. Она зависит от потребностей в конкретных пространственно-временных характеристик эффекторного потенциала, обеспечивающих функциональной системе получение полезного приспособительного результата. Строго конкретный пространственно-временной эффекторный потенциал иммунной системы является следствием образования своеобразных регуляторных коктейлей, являющихся производным взаимодействия строго конкретных количественных и качественных характеристик регуляторных пептидов, продуцируемых активированными клетками иммунной системы в данном месте и в данное время.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ РЕПЛИКАЦИИ ВИЧ-1: РОЛЬ РАЗЛИЧНЫХ ТИПОВ АНТИГЕНПРЕЗЕНТИРУЮЩИХ КЛЕТОК

Мустафин И.Г..1 Бойчук С.В., 2 Миннебаев М.М., Романенко О.М.1

Республиканский центр по борьбе и профилактике СПИД М3 РТ;

2 Казанский государственный медицинский университет, Казань, Россия

Целью исследования явилось проведение сравнительного анализа репликации ВИЧ-1 в СБ4+-лимфоцитах (Лф) при их культивировании с различными типами ан-тигенпрезентирующих клеток (АПК): макрофагами (МФ), В-лимфоцитами (В-Лф), клетками эндотелия

(ЭК), а также фибробластами (ФБ). В ряде случаев ЭК и ФБ преинкубировали с IFN-удля индукции экспрессии молекул МНС II класса. К различным типам АПК вносили Лф, не экспрессирующие маркеры активации: CD25, 69,71 и HLA-DR Источником ВИЧ-1 являлась плазмида pNL4.3 (AIDS Res.Reagent&Ref.Prog.). Репликацию ВИЧ-

1 оценивали методом ИФА с определением p24gag в супернатантах клеточных культур, а также методом проточной цитометрии для подсчета количеств ВИЧ-позитив-ных клеток.

Выявлено, что культивирование В-Лф, МФ и активированных ЭК индуцирует активацию Лф, определяемую по уровню секреции IL-2 и экспрессии активационных маркеров. Уровень продукции IL-2 в супернатантах Лф, культивируемых с профессиональными АПК (МФ, В-Лф) достигал пика на 3 сутки культивирования и был значительно выше по сравнению с Лф, культивированными с ЭК (р<0.01). Активация Лф, культивированных с ФБ или не активированными ЭК, была минимальной. Активация Лф, культивированных без АПК, не регистрировалась. Инфицирование всех клеточных культур не приводило к достоверному увеличению продукции IL-2. Уровень репликации ВИЧ-1 в культурах ЭК/Лф был существенно выше по сравнению с Лф, культивированными с Мф и В-Лф (р<0.001) и достигал пика на 12 сутки культивирования. Репликация ВИЧ-1 в культурах ФБ/ Лф, а также в Лф, культивированных без АПК, не определялась.

Таким образом, несмотря на выраженную активирующую способность некоторых типов профессиональных АПК (МФ и В-Лф) их способность индуцировать репликацию ВИЧ-1 в С04+-Лф существенно ниже по сравнению с полупрофессиональными АПК- ЭК. Этот факт также свидетельствует об отсутствии прямой зависимости между уровнем репликации ВИЧ-1 в С04+-Лф и уровнем их активации, определяемой по секреции IL-2.

ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ЭФФЕКТ ИММУНИЗАЦИИ МЫШЕЙ ДНК И БЕЛКОМ МУЦИНОМ I

Мушенкова Н.В.. Моисеева Е.В..Чаадаева A.B., Свирщевская Е.В.

Институт биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и ЮЛ.Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Разработка противоопухолевых вакцин является одним из интенсивно развивающихся направлений. В основе таких вакцин обычно используют белки или кодирующие их гепы, гиперэкспрессированные в опухолевых клетках. Одним из таких белков является муцин I. Целью работы являлся анализ противоопухолевого ответа у двух линий мышей, иммунизированных либо ДНК, кодирующей муцин I под CMV промотором, либо ДНК и дополнительно белком муцина I для усиления CD4+ Т клеточного ответа. Ген мышиного муцина I выделили с помощью метода полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ПЦР-ОТ) из опухолевых клеток мышей линии BYRB. Участок гена с конца 2-го до конца 6-го экзона клонировали в вектор рЕТ22Ь(+), который использовали для трансформации клеток E.Coli и получения белка. Для получения ДНК под CMV промотором тот же участок гена муцина I вырезали из вектора рЕТ22Ь(+) и клонировали в вектор pBK-CMV.

Предварительные эксперименты показали, что трехкратная иммунизация плазмидой, содержащую геп муцина

I, в воде в дозе 5 мкг/мышь приводит к индукции слабого ответа на муции. Для усиления ответа далее плазмиду вводили в адъюванте Gerbu, что значительно повышало эффективность иммунизации. Дальнейшего усиления ответа добились введением в смесь для иммунизации белка муцина I в дозе 5 мкг/мышь. Показали методом ИФА, что при иммунизации мышей ДНК или ДНК+белок наблюдается преимущественная продукция IgG2a субкласса антител, характерного для формирования клеточного ответа. Однако титр антител был относительно низким (1:20 для ДНК и 1:100 для ДНК+белок), что может быть связано с неэффективной индукцией ответа на собственный белок. В дальнейших экспериментах проводили двухкратную иммунизацию мышей ДНК или ДНК+белок в адъюванте с интервалом в две недели. Через неделю после второй иммунизации мышам линий BALB/c и CBRB перевивали сингенпые опухоли молочной железы в дозе 106 клеток на мышь п/к. Клетки получали из спонтанной опухоли, обработанной коллагепазой. К этому моменту у мышей BALB/ с наблюдали низкие титры антител к муцину в обеих группах, а у мышей линии CBRB высокие титры IgG2a антител у мышей, иммунизированных ДНК+белок. У мышей линии BALB/c рост опухоли наблюдали, начиная с 15 дня после перевивки. У иммунных мышей опухоли росли достоверно быстрее. У мышей линии CBRB опухоли появились на 21 день. Рост опухоли в группе, иммунизированной только ДНК был быстрее чем в контроле. И только в группе, иммунизированной ДНК+белок и имеющей высокие титры IgG2a антител к муцину, наблюдали достоверный эффект торможения роста опухоли и увеличения продолжительности жизни.

ВЛИЯНИЕ ВИРУСОВ ГРИППА А НА АП0ПТ03 ЛИМФОЦИТОВ СЕЛЕЗЕНКИ И НАЗОАССОЦИИРОВАННОЙ ЛИМФОИДНОЙ ТКАНИ

Найхин А.Н.. Баранцева И.Б., Донина С.А., Рекстин А.Р., Григорьева Е.П., Петухова Г.Д., Чиркова Т.В., Руденко Л.Г.

НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

Апоптоз является одной из центральных проблем современной биологической науки, поскольку играет важную роль во многих физиологических и патологических процессах в организме человека. Установлено, что ряд вирусов, в том числе и вирус гриппа, являются индукторами апоптоза клеток, в которых происходит их репликация. Однако роль апоптоза в формировании иммунного ответа при естественной вирусной инфекции или вакцинации противовирусными препаратами практически не изучена.

Цель исследования: па модели экспериментальной гриппозной инфекции и вакцинации определить способность вирусов гриппа А индуцировать in vivo апоптоз лимфоцитов селезенки и назоассоциированной лимфоидной ткани (НАЛТ).

Материалы и методы исследования: мыши линии BALB/c были иммунизированы интраназально следующими вирусами гриппа А: 1) патогенным для них вирусом A/PR/8/34 (НINI); 2) аттенуированным виру-

сом А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) - донором аттенуации, использующимся при производстве российской живой гриппозной вакцины; 3) прототипом вакцинного штамма для живой гриппозной вакцины - аттенуированным генетическим реассортаптом R 6/2 (H1N1), имеющим гены поверхностных белков вируса (гемагглютинина и нейраминидазы) от патогенного вируса A/PR/8/34 (H1N1) и 6 генов внутренних белков вируса от донора аттенуации А/Ленинград/134/47/ 57 (H2N2). Через 12, 24, 48 ч и 7 дней после первичного и повторного заражения выделяли лимфоциты из селезенки и назоассоциированной лимфоидной ткани (НАЛТ). Апоптоз лимфоцитов определяли в аннексии V-FITC тесте с использованием проточной цитометрии. Пролиферативную активность лимфоцитов, стимулированных in vitro гомологичными вирусами гриппа, оценивали в реакции бластотрапсформации с использованием 3Н-тимидина.

Основные результаты. Заражение смертельной дозой патогенного вируса A/PR/8/34 (H1N1) приводило к значительному увеличению уровня апоптоза спленоцитов через 24-48 ч после иммунизации на фоне супрессии пролиферативной активности лимфоцитов селезенки На 7-й день мыши погибли от постгриппозной пневмонии. После введения реассортанта R 6/2 (H1N1) и донора аттенуации А/Ленинград/134/47/57 (H2N2) показатели апоптоза спленоцитов характеризовались кратковременным (24 ч) и менее интенсивным увеличением по сравнению с патогенным вирусом. Установлена обратная связь между уровнем апоптоза лимфоцитов селезенки и показателями пролиферативной активности спленоцитов при первичном иммунном ответе.

Патогенный вирус A/PR/8/34 (H1N1) вызывал увеличение уровня апоптоза лимфоцитов НАЛТ на 12-24 ч после введения. Живые аттенуированные вирусы не стимулировали апоптоз этих клеток. Повторная иммунизация не индуцировала апоптоз лифоцитов селезенки и НАЛТ.

Заключение. Полученные экспериментальные данные дают основание предположить, что регистрируемая из года в год повышенная частота поражения детей первых месяцев жизни тяжелыми формами гриппа (нередко с летальным исходом) может быть связана с развитием у них глубокого апонтотического дисбаланса иммунной системы при первичной встрече с возбудителем. В отличие от тяжелых форм гриппа противогриппозная вакцинация живой вакциной не индуцирует пролонгированную апонтотическую супрессию специфического иммунного ответа. По-видимому, проблема апоптоза иммунокомпе-тентных клеток при гриппе касается только детей раннего возраста, у которых отсутствует приобретенная иммунологическая память.

Основные выводы. 1) Вирусы гриппа А влияют на апоптоз лимфоцитов при первичном, но не вторичном иммунном ответе. 2) Характер запуска апоптоза лимфоцитов в процессе первичного иммунного ответа па вирус гриппа зависит, с одной стороны, от биологических признаков вируса (патогенность, аттенуация), с другой, от фенотипических особенностей лимфоцитов, преобладающих в разных лимфоидных органах и тканях (селезенка, НАЛТ). 3) Количественные характеристики вирусипду-цировапного апоптоза лимфоцитов и их пролиферативной активности имеют обратную зависимость, то есть эти два биологических процесса носят альтернативный характер.

НОВЫЕ МЕХАНИЗМЫ АНТИТЕЛООПОСРЕДОВАННОЙ ЦИТОТОКСИЧНОСТИ

Наумова Т.Е.. Огнева Е.А., Агеев В.А., Хитров А.Н., Алекберова З.С., Габибов А.Г., Сучков С.В.

МОНИКИ им. М.Ф. Владимирского, Москва, Россия; ММА имени И.М. Сеченова, Москва, Россия; Институт ревматологии РАМН, Москва, Россия; Отделение ревматологии ЦГБ № 3,

Астрахань, Россия;

Отделение терапии ЦРБ Павлово-Посадского района Московской области, Россия;

Институт биоорганической химии РАН,

Москва, Россия

В короткоживущих культурах лимфоцитов, выделенных из крови аутоиммунных мышей линии MRL-lpr/lpr и больных СКВ и РА, наблюдается высокий уровень апоп-тоза по сравнению с лимфоцитами от мышей линии BALB/c и здоровых доноров соответственно. Циркулирующие в крови аутоиммунных мышей и больных СКВ и РА CD4+- и С08+-лимфоциты экспрессируют большое количество растворимого Fas антигена, одна из функций которого заключается в защите клеток от апоптоза. Вместе с тем, усиленный апоптоз способствует развитию цитопении и высвобождению в кровоток циркулирующих нуклеосом, которые, в свою очередь, стимулируют аити-телогенез и аутоиммунный процесс в целом.

Процессы индукции и смены активных физиологических процессов в клетках со стороны внеклеточных стимулов в большинстве своем, включая процесс апоптоза, требуют обязательной стадии связывания промежуточного лиганда с определенным рецептором клеточной поверхности. Действие же АТ (в том числе, ДНК-связыва-ющих аутоАТ) как индукторов клеточной смерти указывает на наличие для таких АТ на клеточной мембране соответствующей молекулы-мишени. В работах последних лет продемонстрирована перекрестная специфичность ДНК-связывающих аутоАТ с целым рядом мембранных аутоантигенов, обладающих различной копформацион-ной структурой и различными функциональными свойствами. В том же ключе, но с иной группой мишеней нук-леопротеиновой природы внутри клетки показана перекрестная реактивность анти-ДНК аутоАТ с отдельными компонентами ядерного матрикса.

Ранее установлено, что ДНК-абзимы, выделенные от больных СКВ и РА, способны к индукции апоптоза в отношении целого ряда клеток-мишеней. В этой связи ДНК-гидролизующую и цитотоксическую активности ДНК-абзимов следует рассматривать исключительно как специализированную функцию аутоАТ, рожденную не случайной мутацией, а всем ходом эволюционного процесса rio созданию в организме системы контроля цитотоксичности, автономной от комплемента. При этом роль цитотоксических механизмов в регуляции иммунного гомеостаза настолько велика, что число таких механизмов, автономных от известных систем контроля, может быть неограниченным.

С учетом вышеизложенного, исследование свойств ДНК-абзимов с заданным дизайном и специфичностью, полученных методами рекомбинантной ДНК и па основе моноклональных АТ, позволит прояснить - какой из возможных механизмов гибели клеток доминирует при системных формах аутоиммунной патологии, и идентифи-

цировать ключевые компоненты сигнальных путей транс-дукции и мембранные мишени для связывания цитотоксических анти-ДНК аутоАТ.

Исследовали функциональные свойства ДНК-абзимов (анти-ДНК аутоантител с ДНК-гидролизующей активностью), полученных от больных системной красной волчанкой (СКВ) и ревматоидным артритом (РА), а также от аутоиммунных мышей инбредных линий МЯЫрг/ 1рг, ЖВ/Ы2\У Р1 и В клинической практике наи-

большей частотой встречаемости ДНК-абзимов отличаются больные СКВ (45-60%) и РА (25-35%), среди экспериментальных моделей - мыши линии МЯЬ-1рг/1рг (с СКВ и РА). У здоровых доноров и неаутоиммунных мышей линии ВАЬВ/с, в большинстве случаев, ДНК-абзи-мы отсутствовали. Вместе с тем, по механизму действия у больных с различными формами аутоиммунной патологии и у генетически разных аутоиммунных мышей ДНК-абзимы заметно отличаются. Выдвигается новая концепция механизма образования ДНК-абзимов, в основе которой лежит феномен перекрестной реактивности поликлональных ДНК-абзимов с белками ядерного матрикса, лишенных нативной ДНК. На экспериментальных моделях показано, что возникновение ДНК-абзимов при аутоиммунных формах патологии, по крайней мере, в случае линии БЦ/Х не связано напрямую с активным аутоиммунным процессом, а, видимо, имеет более глубокие причины, скрытые в дефектах иммуногенетического уровня. Предварительные результаты свидетельствуют о существовании комплемент-независимых механизмов цитотоксичности, опосредуемых ДНК-абзимами. Исследуемые в работе клинические и экспериментальные модели аутоиммунных состояний могут стать перспективными объектами для создания специфических абзимов с различными уровнями каталитической активности.

ВЛИЯНИЕ ФУКОИДАНА НА КЛЕТКИ ПЕРИТОНЕАЛЬНОГО ЭКССУДАТА ПРИ ВНУТРИБРЮШИННОМ ВВЕДЕНИИ БЕСПОРОДНЫМ БЕЛЫМ МЫШАМ

Незговоров Д.В.. Добродеева Л.К., Мокроусова Е.В., Меньшикова Е.А.

Институт физиологии природных адаптаций УрО РАН, Архангельск, Россия

Введение. Получен долговременный эффект применения сульфатированного полисахарида ламинарии - фу-коидана в комплексном лечении хронических воспалительных процессов, аутоиммунных и онкологических заболеваний.

Цель. Установить последовательность и длительность влияния фукоидана на функциональную активность клеток перитонеального экссудата и иммунокомпетентные клетки. Задачи. Определить характер клеточных реакций перитонеального экссудата при внутрибрюшинном введении фукоидана в условиях экспериментального внут-рибрюшииного введения препарата.

Материалы и методы. Исследование было проведено на 150 беспородных белых мышах весом 20-25 г, фукои-дан вводили однократно внутрибрюшинно в дозе 5 мг/кг массы; исследовали перитонеальный экссудат.

Основные результаты. Нейтрофильная экссудация начинается через 15-20 мин, спустя 1 ч содержание нейтро-фильных лейкоцитов достигает 21 Д3±0,67% с максималь-

ным повышением через сутки (24,60±0,96%;р<0,05) и повторными подъемами через 4 дня и месяц. Моноцитарная реакция выявлена через 72 часа с увеличением содержания моноцитов почти в 2 раза с 28,13± 1,67 до 51,26±2,36%. Появление тучных клеток (1,8±0,53%) в составе экссудата регистрируется на 4-е сутки одновременно с увеличением содержания лимфорстикулярных (2,74±0,37%). Плазматические клетки и лимфобласты выявляются через 20 дней после введения препарата, содержание лимфобластов в этот период достигает 21,61±0,94%, относительный уровень содержания плазматических клеток не превышает 3% (2,74±0,19%). Увеличение содержания функционально активных моноцитов и макрофагов выявляются через 1 ч после введения препарата до 71,24± 1,13% (р<0,05), содержание указанных клеток не претерпевает существенных изменений и держится на повышенном уровне до 30 суток, когда регистрируется максимальное формирование макрофагов. Максимальное развитие мопоцитарной экссудации идет на фоне появления в экссудате лимфоретикулярных клеток и формирования розеток из лимфоцитов вокруг моноцита, а реакция со стороны лимфоидных клеток совпадает с развитием местной плазмоклеточной реакцией. Изменения в структуре лимфоцитов не касаются лимфопролиферативной реакции, содержание больших лимфоцитов в течение всего периода наблюдения существенно не изменяется. Изменения происходят в уровне содержания средних но размеру клеток, с максимальным их увеличением на 20 сутки, т.е. в период более выраженной экссудации лимфоцитов.

Розеткообразование лимфоцитов па поверхности моноцитов происходит за счет малых лимфоцитов, максимальное содержание розеток выявляется через час после введения препарата, но повышенный уровень их содержания регистрируется в течение всего периода наблюдения.

Фукоидаи повышает фагоцитарную активность нейт-рофилов (с 46,28±9,48 до 87,26±8,56%) и моноцитов (с

36,54±7,64 до 85,37±9,73%) увеличивает интенсивность фагоцитоза нейтрофилами (с 3,57±0,58 до 9,26±0,68%) и моноцитами (с 0,94±0,87 до 7,13± 1,82%), обеспечивая повышенную активность и интенсивность фагоцитоза на протяжении 40 дней.

Заключение. Виутрибрюшинное введение фукоида-на увеличивает активность и интенсивность фагоцитоза иейтрофилов и моноцитов, стимулирует развитие макро-фагальной реакции и лимфопролиферации, а также миграцию нейтрофилов и моноцитов в ранние сроки после введения, обеспечивая длительные последовательно развивающиеся местные реактивные процессы пейтрофиль-ной инфильтрации, макрофагальной реакции, лимфопролиферации и плазмоклеточной реакции.

ПРОГНОЗ РАЗВИТИЯ ИММУННЫХ и ПСИХОЭМОЦИОНАЛЬНЫХ РАССТРОЙСТВ У ПОТОМСТВА МАТЕРЕЙ С ПСИХОГЕННОЙ ТРАВМОЙ

Огурцов Р.П.. Авалиани Т.В., Белобокова Н.К., Пузырева В.П., Попов В.Г., Цикунов С.Г.

ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

Витальный стресс, пережитый матерями как во время беременности, так и перед зачатием, приводит к нарушению иммунных и психомоторных функций у потомства. Цель данного исследования состояла в том, чтобы

характеризовать влияние межполушарпой функциональной асимметрии (МФА) мозга матерей с психогенной травмой (ПТ) на проявление иммунных и поведенческих реакций у потомства в зависимости от пола крысят.

МФА по моторной преференции у самок-матерей определяли по методу Пошивалова В.П. (1986). ПТ моделировали угрозой собственной жизни при переживании ситуации гибели партнера от действий хищника, для чего самок крыс помещали в террариум к гштону на 14 сутки беременности (потомство Б-14) или за месяц до зачатия (потомство 3-с1о). Функциональную активность иммунной системы одномесячных крысят оценивали по выраженности миграции лейкоцитов периферической крови, способности лимфоцитов реагировать на Т-клеточные митогены (ФГА и Кон-А) в тесте подавления миграционной активности лейкоцитов и активности естественных киллеров (ЕК) среди сплепоцитов в отношении культуры клеток К-562. Поведение исследовали в тесте открытого поля (ОП), оценивая двигательное, исследовательское и психоэмоциональное состояние, а также целостность поведения по вероятностям переходов одних актов в другие.

Результаты. Спонтанная миграционная активность лейкоцитов потомства 8-с1о, рожденного от самок - правшей и левшей, не отличалась от показателей интактных крысят. У самцов, рожденных от правшей, была нарушена способность лимфоцитов реагировать на оба Т-клегоч-пых митогена, у самок - только на Кон-А. У самцов, рожденных от левшей, нарушалась способность лимфоцитов реагировать па Кон-А, а у самок определялось нормальное реагирование. Активность ЕК была подавлена у самцов, рожденных от левшей.

У самцов и самок Б-14 спонтанная миграционная активность была достоверно ниже, чем в контроле, вне зависимости от функциональной межполушарпой асимметрии их матерей. У самцов, рожденных от правшей, подавление реагирования лимфоцитов выявлено на Кон-А, а у самок - па ФГА. У самцов, рожденных от самок левшей, отмечали способность реагировать на Кон-А. У самок-лимфоциты реагировали на оба Т-клеточиых митогена, однако активность ЕК у них была подавлена.

Исследования в ОП показали, что ПТ матерей за месяц до зачатия или во время беременности вызывает изменение двигательной активности, увеличение уровня тревожности, снижение исследовательского поведения, а также нарушение целостности поведения у крысят всех групп.

Особенности эмоциональных отклонений у потомства самок с ПТ в группах 5-с1о зависели от пола животного и от МФА матерей. У самцов, рожденных от правшей, снижались двигательное и исследовательское поведение, а у самок в большей степени страдала психоэмоциональная сфера, что проявлялось достоверным увеличением реакций страха. У самцов, рожденных от левшей, регистрировались гиперактивность и нарушение целостного поведения в ОП, у самок в большей степени была изменена исследовательская деятельность.

В группе Б-14 сравнение поведения не по полу в тесте «ОП» не выявило достоверных отличий. Сравнение поведения по МФА матерей показало, что более грубые психоэмоциональные нарушения проявляются у потомства, рожденного от самок-левшей.

Таким образом, результаты исследования показывают, что неонатальный стресс в большей степени нарушает поведение у потомства матерей с доминированием пра-

вого полушария, а стресс за месяц до беременности оказывает наиболее патогенное воздействие на функции иммунной системы у потомства матерей с левополушарным доминированием. Полученные данные позволяют прогнозировать характер и выраженность иммунных и психоэмоциональных расстройств у потомства матерей с ПТ в зависимости от сроков воздействия, МФА матерей и пола животного.

ВЛИЯНИЕ НЕОНАТАЛЬНОЙ ГИПОФИЗЭКТОМИИ И ПЕПТИДОВ ГИПОФИЗА НА МОРФОЛОГИЧЕСКУЮ СТРУКТУРУ ВИЛОЧКОВОЙ ЖЕЛЕЗЫ И СУМКИ ФАБРИЦИУСА У ПТИЦ

Патеюк A.B.. Кузник Б.И., Джулай М.А., Баранчугова Л.М.

Читинская государственная медицинская академия, Чита, Россия

В литературе прочно укоренилось мнение, что центральными органами иммунитета у млекопитающих и человека являются вилочковая железа и красный костный, а у птиц - сумка Фабрициуса. Вместе с тем, за последнее время стало известно, что на состояние центральных органов клеточного и гуморального иммунитета оказывает влияние гипофиз. Следует заметить, что в большинстве случаев исследования по изучению роли гипофиза в регуляции структуры и функции тимуса проводились на взрослых животных, т.е., тогда когда органы иммунитета уже сформированы. Более того, до сих пор практически отсутствуют наблюдения, в которых изучалась бы взаимосвязь гипофиза и центрального органа гуморального иммунитета у птиц - сумки Фабрициуса. Между тем, эти взаимосвязи нам представляются наиболее важными, так как в фолликулах бурсы В- лимфоциты приобретают гетерогенность по антигенной специфичности, что и обеспечивает разнообразие образующихся антител. Так же известно, что важнейшими регуляторами иммунной системы являются комплексы полипептидов, получившие наименование цитомедины.

Целью нашего исследования явилось изучение влияния неонатальной гипофизэктомии и роли цитомединов передней (ПДГ) и задней (ЗДГ) долей гипофиза на структуру тимуса и сумки Фабрициуса.

Гипофиз удаляли у цыплят породы «Родонит-2» в первые 6 часов после рождения. Цитомедины получали из гипофизов свиней в возрасте 1 года методом уксуснокислой экстракции. На основании аминокислотного анализа цитомединов ПДГ и ЗДГ были синтезированы олигопептиды. Цитомедины и олигопептиды вводили внутримышечно в дозе ОД мг/кг массы тела один раз в сутки в течение 40 дней. Забор органов осуществляли на 45 сутки жизни цыплят. Гистологические исследования органов животных осуществляли традиционным способом заливки материала в парафин и целлоидин, после предварительной фиксации в 10% нейтральном формалине и жидкости Карнуа. Срезы парафиновых и целлоидиновых блоков, толщиной 5 и 10 мкм соответственно, окрашивали гематоксилин-эозином. Также использовались морфометрические методы.

Нами установлено, что неонатальная гипофизэктомия приводит к инволютивным процессам, которые выражаются в снижении массы тимуса (Р<0,001), его жировой дистрофии и нарушении процессов пролиферации и диф-

ференцировки лимфоцитов. Введение цитомединов ПДГ (Р<0,001) способно частично восстанавливать структуру вилочковой железы, в то время как цитомедины ЗДГ не влияют на структуру, а, следовательно, и функцию тимуса.

При сравнении влияния исследуемых цитомединов и олигонептидов на структуру тимуса после гипофизэктомии эффект от применения цитомединов оказался выше, чем при введении олигопептидов, хотя эти изменения носили однонаправленный нормализующий структуру органа характер.

Масса бурсы относительно массы тела гипофизэкто-мированных цыплят на 45 сутки увеличивалась примерно в 9 раз (Р<0,001) по сравнению с таковым соотношением у интактных птиц.

Гипофизэктомия приводит к резкому накоплению в бурсе незрелых лимфоцитов, что, возможно, связано с нарушением дифференцировки и миграции лимфоцитов и снижением их выхода из бурсы, благодаря чему значительно увеличивается масса сумки Фабрициуса (Р<0,001). Установлено, что введение цитомединов ЗДГ в значительной степени восстанавливало строение (Р<0,001) и, следовательно, функциональную активность бурсы. В то же время инъекции цитомединов ПДГ не оказывали существенного влияния на структуру и функцию сумки Фабрициуса.

При исследовании олигопептидов установлено, что на структуру бурсы в большей степени влияли олигопептид ЗДГ (Р<0,001). Олигопептид ПДГ оказывал значительно меньший нормализующий эффект на данный орган при гипофизэктомии.

Итак, удаление гипофиза в первые часы жизни цыплят приводит к изменениям структуры тимуса и сумки Фабрициуса. При использовании полученных нами олигопептидов ПДГ и ЗДГ отмечались аналогичные изменения в структуре вилочковой железы и сумки Фабрициуса, как и при введении цитомединов гипофиза. Влияние олигопептида ПДГ в большей степени соответствовало цитомединам ПДГ, а олигопептида ЗДГ - цитомединам ЗДГ.

ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТА БЕСТИМ НА ПОЛЯРИЗАЦИЮ Т-ХЕЛПЕРНЫХ ЛИМФОЦИТОВ У МЫШЕЙ

Петров A.B.. Пигарева Н.В., Котов А.Ю., Колобов A.A., Симбирцев A.C.

ГНЦ ГосНИИ особо чистых биопрепаратов, Санкт-Петербург, Россия

Дифференцировка Т-хелперных лимфоцитов в Thl и Th2 клетки определяет особенности иммунного ответа и эффекторных механизмов, направленных на элиминацию антигена из организма. Важнейшее значение Т-хелперных клонов в патогенезе множества инфекционных, аллергических и аутоиммунных заболеваний не вызывает сомнения. В связи с этим разработка иммуномодулирующих препаратов, способных предсказуемо влиять на поляризацию Т-хелперов является актуальной проблемой, а подобные препараты могут стать высокоэффективными средствами в лечении различных форм иммуноопосредо-ванной патологии. Ранее нами было показано, что введение иммуномодулирующего препарата Бестим оказывает лечебный эффект при экспериментальной туберкулезной инфекции у мышей. Поэтому мы предприняли по-

пытку изучить влияние препарата на поляризацию Т-хел-перов у здоровых мышей.

Бестнм вводился мышам линий C57BL и Fl(CBAxC57BL) внутрибрюшинно в дозах от 0.001 до 10 мкг/кг веса три дня подряд. Оценивалась Конканава-лнп А(КонА)-нпдуцированпая пролиферация тимоцитов и спленоцитов, продукция ими интерлейкина(1Ь)-2 при стимуляции КонА и без, а также спонтанная и стимулированная продукция сплепоцитами IFNy и 1L-4.

После введения Бестима наблюдалось дозозависимое увеличение КонА-индуцированпой пролиферации тимоцитов и продукции ими IL-2 с максимумом в группе, получавшей 10 мкг/кг Бестима. Стимулированная продукция IL-2 сплепоцитами также усиливалась, однако максимум продукции был в группах, получавших 0,1-1,0 мкг/кг препарата. Стимулированная продукция IFNy и IL-4 имела противоположно направленную динамику: в группах, получавших 0,01-0,1 мкг/кг Бестима, продукция IFN-y значительно усиливалась, a IL-4 уменьшалась. При этом в группе, получавшей 10 мкг/кг, содержание этих цн-токинов в супернатантах стимулированных КонА спленоцитов не отличалось от контроля. Соответственно условный индекс, рассчитанный как частное концентраций IFNy и IL-4 в супернатанте и отражающий поляризацию Т клеток в сторону Т-хелперов 1-го тина, также был максимальным в группах, получавших 0,01-0,1 мкг/кг Бестима.

Полученные данные указывают на то, что Бестим является перспективным иммупомодулятором, влияющим на баланс Т-хелперов в организме, и позволяют рассчитывать па то, что па основе этого препарата возможна разработка схем иммунотерапии с целью сдвига поляризации Т-клеток в сторону Т-хелперов 1-го типа.

ВАКЦИНАЦИЯ ДЕНДРИТНЫМИ КЛЕТКАМИ ПРОТИВ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ТУБЕРКУЛЕЗА: УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ И СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ

Петровская С.Н.. Рубакова Э.И., Апт А.С., Кондратьева Т.К.

Центральный НИИ туберкулеза РАМН,

Москва, Россия

Индукция иммунитета к Mycobacterium tuberculosis во многом зависит от эффективности презентации их антигенов (АГ) антиген-презептирующими клетками, в результате которой возникает специфический иммунный ответ. Дендритные клетки (ДК) являются наиболее эффективными аптиген-нрезентирующими клетками, способными запускать специфический иммунный ответ против различных антигенов. Целью пашей работы явилось исследование возможности создания вакцины на основе ДК, «нагруженных» антигенами микобактерий (соиикат М. tuberculosis H37Rv).

Дендритные клетки выращивали из клеток костного мозга мышей в культуральной среде, содержащей эмбриональную телячью сыворотку (ЭТС) (или мышиную сыворотку (МС)) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор. Степень зрелости клеток определяли но экспрессии поверхностных маркеров методом проточной цитофлуоримстрии. Нагрузка Д К антигеном приводила к активации почти всей популяции клеток (>90% CD1 lb-позитивных клеток). Экспрессия CDllc на клетках, выращенных в присутствии МС, снижалась после нагрузки антигеном, в отличие от ДК, выращенных на ЭТС. Полученные клетки были охаракте-

ризованы как дендритные клетки миелоидного ряда, несущие маркеры CD1 lb, CD11с и F4/80.

Далее мы исследовали возможность премирования Т-клеток in vivo подкожным введением ДК, экспрессирующих антигены М. tuberculosis H37Rv, оценивая активацию но уровню пролиферативного ответа клеток подколенных лимфоузлов in vitro. Такая иммунизация вызывала развитие иммунного ответа разной степени специфичности. После введения ДК, выращенных в присутствии ЭТС, развивался неспецифический ответ, но-видимому, как результат наличия в среде чужеродных белков. Напротив, ДК, выращенные в среде, содержащей МС, при введении мышам вызывали выраженный антигепснсцифический клеточный ответ. Пролиферативная активность лимфоцитов мышей, иммунизированных ДК+МС+АГ, была выше по сравнению с ответом животных, иммунизированных ДК+МС.

Затем мы сравнили эффективность вакцинации при различных способах введения ДК, выращенных на МС: подкожном, внутривенном, интратрахеальном и внутри-легочном. По результатам высева микобактерий из органов зараженных животных (лёгкие и селезёнка) наиболее эффективным способом вакцинации оказался подкожный.

Таким образом, изменив условия культивирования и выбрав наиболее эффективный способ иммунизации, нам удалось выявить развитие специфического клеточного ответа на антигены микобактерий, презентируемые ДК.

ВЛИЯНИЕ ПРЕПАРАТОВ ВНУТРИВЕННОГО ИММУНОГЛОБУЛИНА НА АП0ПТ03 НЕЙТРОФИЛОВ

Пешняк Ж.В.. Космачева С.М., Гапанович В.Н.

ГУ «Научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови М3 Республики Беларусь», Минск, Беларусь

Полиморфиоядерные нейтрофилы играют важную роль в «неспецифической» защите организма от бактериальных инфекций. Компоненты клеточной стенки грамот-рицательных бактерий липополисахариды (ЛПС) ингибируют апоптоз пейтрофилов. С этим, вероятно, связан ряд осложнений в патогенезе многих заболеваний: активированные клетки более длительный период времени циркулируют в кровяном русле и атакуют собственные клетки и ткани организма. Изучение механизмов апоп-тоза пейтрофилов под действием препаратов внутривенного иммуноглобулина (ВВИГ) представляет значительный интерес.

Цель: изучить действие различных препаратов ВВИГ («Иммуноглобулин нормальный человеческий для внутривенного введения» производства Республиканской станции переливания крови и НИИ ГПК, коммерческие препараты «Venimmun» и «Gamma-Venin HS » («Behring-Werke», Германия) на спонтанный и ЛПС-индуцирован-ный апоптоз пейтрофилов.

Материалы и методы: нейтрофилы выделяли из периферической крови здоровых доноров на двойном градиенте фиколл-верографина и доводили до концентрации 1,5х105/мл. Исследуемые концентрации препаратов ВВИГ (1; 2,5; 5; 10 мг/мл), ЛПС (1 мкг/мл, серотип 0111 :В4, «Sigma»), вносили в культуру пейтрофилов и инкубировали 22 часа в 24-луночных планшетах при 37°С во влажной атмосфере с 5% С02. Контролем служили клетки без препаратов ВВИГ. Апоптотические клетки он-

ределяли по конденсации хроматина с акридиновым оранжевым под люминесцентным микроскопом. В каждом препарате считали не менее 500 клеток.

Результаты: спонтанный апоптоз нейтрофилов здоровых лиц был достоверно выше, чем под действием Л ПС (16,9±0,7 и 13,2±0,5%, соответственно). Исследуемые препараты ВВИГ вызывали дозозависимое увеличение относительного количества нейтрофилов, подвергшихся апоп-тозу как в спонтанном, так и в ЛПС-индуцированном тесте. Причем действие отечественного препарата ВВИГ было выражено несколько слабее, чем коммерческих препаратов. Достоверное повышение числа апоптотических клеток под действием отечественного препарата ВВИГ отмечалось при концентрации 2,5 мг/мл (22,4±0,5%, р<0,05), в то время как коммерческие препараты оказывали выраженный эффект на усиление апоптоза нейтрофилов при концентрации 1мг/мл. На ЛПС-индуцированный апоптоз нейтрофилов наиболее сильное действие оказывал препарат Gamma-Venin HS (5S), содержащий F(ab )2 фрагменты, проявляя свое действие с концентрации 1 мг/ мл (19,8+2,6, р<0,05). Достоверное повышение числа апоптотических клеток под действием отечественного препарата ВВИГ проявилось с концентрации 5 мг/мл (24,6±2,9, р<0,01), у препарата «Venimmun» (7S) - с 2,5 мг/мл (21,1 ±2,3, р<0,05). Как отечественный препарат ВВИГ, так и препарат «Venimmun» содержат цельные молекулы иммуноглобулина.

Выводы: препараты ВВИГ обладают свойством усиливать апоптоз нейтрофилов, что является основанием для их назначения с цслыо подавления патологического иммунного ответа при воспалительных и аутоиммунных заболеваниях.

КОНТРОЛЬ АПОПТОЗА Т-КЛЕТОК, СТИМУЛИРУЕМЫХ IN VITRO МИКОБАКТЕРИАЛЬНЫМИ АНТИГЕНАМИ, КОМПЛЕКСОМ Н-2

Пичугин A.B.. Апт A.C.

Центральный НИИ туберкулёза РАМН,

Москва, Россия

Комплекс Н-2 (главный комплекс гистосовместимости мыши) оказывает значительное влияние на течение экспериментальной туберкулёзной инфекции, в том числе на образование специфических гранулём, размножение микобактерий в лёгких и время выживания. В настоящее время роль длительного специфического Т-клеточного ответа в этих феноменах до конца не изучена.

Мы сравнили поликлональный Т-клсточный ответ в лимфатических узлах (выход клеток, пролиферация, экспрессия поверхностных маркеров, продукция цитоки-нов) на антигены микобактерий туберкулеза у конгенных по Н-2 мышей, отличающихся по чувствительности и резистентности к туберкулезу. Выяснилось, что способность сохранять специфический ответ при повторяющейся стимуляции микобактериальными антигенами зависит от гаплотипа Н-2. Клетки лимфоузлов мышей 4R (резистентная линия) постоянно отвечали на антиген in vitro после иммунизации соникатом М. tuberculosis H37Rv и после третьего цикла стимуляции/отдыха превращались в стабильную клеточную линию, состоящую из Т-хелперов I типа CD3+CD4+. Клетки мышей В6 (чувствительная линия) теряли свою способность к пролиферации после второго цикла стимуляции и погибали.

Кроме того, было показано, что клетки-хелперы при адоптивном переносе даже в низкой дозе достоверно увеличивают срок жизни мышей после заражения летальной дозой микобактерий туберкулеза, т.е. развитие ответа по пути длительного поддержания таких клеток в активном состоянии необходимо для защиты от инфекции.

Основываясь на разной выживаемости иммунных лимфоцитов в длительных культурах in vitro, мы предположили, что причиной этого феномена является индуцированная активацией клеточная гибель путем апоптоза. Мы обнаружили, что специфичная для апоптоза «лестница» фрагментированной ДНК характерна для культивируемых клеток мышей обеих линий. Апоптоз Т-лим-фоцитов также был проанализирован при помощи проточной цитофлуориметрии с применением анпексина V и йодистого пропидия. Большее количество специфичных к микобактериям клеток мышей линии В6 (30%) находилось в фазе раннего апоптоза после 48 часов стимуляции in vitro во втором цикле по сравнению с культурами клеток 4R. Экспрессия CD95 (Fas) была также выше в культурах клеток В6 (40%) по сравнению с клетками 4R (10%).

Аналогичные результаты были получены через 2 педели после внутривенного заражения летальной дозой М. tuberculosis H37Rv. Т-клетки из подмышечных лимфатических узлов мышей чувствительной линии В6 отличались высоким уровнем апоптоза и экспрессии CD95. Таким образом, мы показали, что индуцированный антигеном апоптоз Т-клеток связан с чувствительностью к туберкулёзной инфекции. Мы предполагаем, что микобактерии туберкулёза могли развить способность уклоняться от протективпого иммунного ответа, вызывая апоптоз Т-клеток хозяина.

ЭКЗОГЕННЫЕ БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА 70 КДА ИНГИБИРУЮТ ПРОДУКЦИЮ АКТИВНЫХ ФОРМ КИСЛОРОДА ФАГОЦИТАМИ

Пономарёв А.Д.. Семенков В.Ф., Сапожников А.М.

Институт биоорганической химии

им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН,

Москва;

Российский НИИ геронтологии М3 РФ, Москва

Продукция фагоцитирующими клетками активных форм кислорода (АФК) является важной составляющей сложного комплекса процессов, протекающих в очаге воспаления. Повышенная концентрация АФК как в межклеточной среде, так и во внутриклеточном пространстве является причиной окислительного стресса клеток. Универсальная реакция клеток всех типов в ответ на стресси-рующие воздействия связана с усилением экспрессии белков теплового шока (БТШ), в частности БТШ70. В предыдущих работах мы зарегистрировали и охарактеризовали феномен экзоцитоза БТШ70 активированными клетками иммунной системы. В этих же исследованиях было обнаружено, что внеклеточные БТШ70 интернали-зуются иммунокомпетентпыми клетками с сохранением функциональной активности данных протеинов. Литературные данные свидетельствуют о способности БТШ70 ингибировать активность NADPH-оксидазы, являющейся одним из основных источников супероксид-радикала

- предшественника других АФК. Это явилось основапи-

см для нашего предположения о возможной вовлеченности внеклеточных БТШ70, секретирусмых активированными клетками иммунной системы в механизм подавления нежелательной гиперпродукции АФК в очаге воспаления.

В данной работе, используя методы люминол-зависи-мой хемилюминесценции и проточной цитофлуоримет-рии, мы проанализировали влияние экзогенных БТШ70 на продукцию АФК нейтрофилами человека и на внутриклеточное содержание АФК в клетках лимфоидных органов мыши. Полученные результаты подтвердили наше предположение об ингибирующем продукцию АФК действии внеклеточных БТШ70. Так, преинкубация нейтро-филов с 1-5 мкг/мл экзогенных БТШ70 снижала обусловленную внесением зимозана амплитуду «кислородного взрыва» этих клеток в 3-5 раз. Присутствие таких же концентраций внеклеточных БТШ70 в краткосрочных культурах клеток, полученных из разных лимфоидных органов мыши, незначительно, но достоверно уменьшало внутриклеточную концентрацию АФК. Наиболее отчетливо это наблюдалось для популяции костномозговых предшественников. Содержание АФК в этих клетках снижалось примерно на 20% через 4 часа после внесения БТШ70 в клеточную культуру и оставалось сниженным на протяжении всего эксперимента, вплоть до 24 часов.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 03-04-49052).

ИЗУЧЕНИЕ ПРОТЕКТИВНОГО ДЕЙСТВИЯ ИНТЕРЛЕЙКИНА-2 НААПОПТОЗ И ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА В УСЛОВИЯХ ВОЗДЕЙСТВИЯ IN VITRO ЦИТОСТАТИКОВ ИЛИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК

Потапнев М.П., Вашкевич Е.П, Савицкий В.П., Белевцев М.В.

Республиканский научно-практический центр детской онкологии и гематологии, Минск, Беларусь

В клинической практике использование иммупомоду-ляторов (включая цитокины) часто связано с иммуносуп-ресспвпым состоянием пациента в результате заболевания или проводимой терапии. Целыо исследования была оценка в экспериментах in vitro иммунопротективного действия цитокнна иитерлейкипа-2 (IL-2) на витальность мопонуклеарных клеток периферической крови (МПК) in vitro в присутствии цитостатиков и/или клеток опухолевой линии M-HeLa, а также цитотоксическую активность лимфоцитов здоровых и онкологических больных.

Материалы и методы. Объектом исследования являлись МПК, полученные от здоровых людей (доноров крови) или детей с онкологическими заболеваниями. Клетки культивировали в полной питательной среде RPMI-1640 в присутствии цитостатиков карбонлатииа, вепезид или клеток опухолевой линии HeLa. IL-2 (препарат «Рон-колейкин») добавляли к МПК в конечной концентрации 10 или 100 ЕД/мл. Через 2 суток оценивали уровень апоп-тотических клеток методом проточной цитометрии с окраской пропидиумом йодидом (или JC-1). Дополнительно выявляли субпопуляцни лимфоцитов с помощью МКА к CD3, CD4, CD8, CD16+CD56, CD19. Цитотоксическую активность определяли с помощью окрашивания МПК (и опухолевых клеток) пропидиумом йодидом, образование

Thl клеток оценивали по количеству МПК, синтезирующих IFN-y.

Результаты. В проведенных исследованиях IL-2 в концентрациях 10 и 100 ЕД/мл вызывал слабое снижение процента апоптотических клеток среди МПК, культивированных совместно с карбоплатином или вепезидом по сравнению с культивированием с цитостатиком. Прс-инкубацияс IL-2 достоверно повышала устойчивость МПК к последующему воздействию цитостатика карбоц-латин. Среди МПК в наибольшей степени апоптозу в присутствии как карбоплатина, так и IL-2 были подвержены В-лимфоциты, ЕК, ЕКТ-клетки, CD8f Т-клетки. Под действием IL-2 (10 ЕД/мл) снижение уровня апоптоза наблюдалось для CD4T Т-клеток. В меньшей степени IL-2 влиял на апоптоз МПК, вызванный инкубацией с опухолевыми клетками линии HeLa. Отмечено выраженное стимулирующее действие IL-2 на цитотоксическую активность МПК здоровых и онкологических больных, а также образование Thl клеток в условиях воздействия цитостатика карбоплатин или клеток линии HeLa.

Заключение. IE-2 in vitro оказывает преимущественно иммунопротективное действие в отношении функционально активных лимфоидных клеток, в меньшей степени влияет на апоптоз МПК в присутствии цитостатиков или опухолевых клеток линии HeLa.

НОВЫЙ ПОДХОД К ЛЕЧЕНИЮ ВОСПАЛЕНИЯ. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ УЛЬТРАНИЗКИХ КОНЦЕНТРАЦИЙ АЛКИЛИРУЮЩИХ АГЕНТОВ

Пухальский A.JL. Шмарина Г.В., Соколов Е.И., Зыков К.А.

Медико-генетический научный центр РАМН; Московский государственный медико-стоматологический университет,

Москва, Россия

Алкилирующие соединения (циклофосфамид, мелфа-лан, хлорамбуцил и др.) применяются в современной медицине в качестве цитостатиков и иммуносупрессивных агентов. Их цитостатически й эффект связан с образованием сшивок и разрывов внутри молекул ДНК. При этом другие внутриклеточные мишени для алкилирования (РНК и белки) не играют существенной роли для реализации цитоста-тического эффекта в случае использования препаратов в концентрациях, достаточных для необратимого повреждения ДНК. В то же время, при последовательном снижении дозы число мишеней для алкилирующих агентов также снижается. Теоретически можно представить ситуацию, когда в клетке останется лишь один тин мишеней для алкилиро-вапия. Так, цитостатическая концентрация для лимфоцитов периферической крови составляет 300 мкг/мл и выше. При 10-кратном снижении дозы (30 мкг/мл) клетки не погибают, однако теряют способность отвечать на митогены за счет нарушения синтеза IL-2. При снижении дозы вЮО раз (3 мкг/мл и ниже) можно наблюдать парадоксальный эффект, выражающийся в усилении пролиферации в ответ па стимуляцию митогеном, что связано с нарушением проведения сигнала P-цепью рецептора для 1L-2, конститутивно экспрессированного на лимфоцитах CD8+. Рецептор для IL-2 не является единственной мишенью для ультранизких концентраций алкилирующих агентов. В частности, мафос-фамид защищает клетки фибробластоидной линии от ци-тостатического действия TNF-a за счет блокады рецептора

для этого цитокина. Эти результаты позволили выдвинуть гипотезу о возможности использования ультранизких доз алкилирующих препаратов для лечения заболеваний, в патогенезе которых существенную роль играет хроническое воспаление слизистых оболочек. Справедливость этого предположения была подтверждена на модели экспериментального колита у мышей, а также у больных тяжелой бронхиальной астмой. Было показано, что внутрибрюшинное введение мелфалана в дозе 25 мкг/кг веса тела мышам с экспериментальным колитом, индуцированным декстрансуль-фатом, замедляет развитие клинических проявлений колита у мышей, а также существенно увеличивает продолжительность жизни экспериментальных животных. Так, на 7-й день эксперимента величина клинического индекса у мышей, получавших мелфалан, составила 7,6+0,5 против 9,3+0,6 балла в контрольной группе. При этом смертность в контроле достигала 60%, тогда как в группе, леченной мелфала-ном, этот показатель составил 30%. Макроскопические признаки колита, а также снижение гематокрита и лейкоцитоз у животных, леченных мелфаланом, были выражены слабее. При гистологическом исследовании фрагментов толстого кишечника у нелеченпых животных были обнаружены многочисленные эрозии слизистой оболочки, деструкция крипт и эпителия, а также массивная инфильтрация клетками воспаления. У мышей, получавших мелфалан, архитектоника слизистой была в основном сохранена, воспалительные и деструктивные изменения кишечной стенки были выражены существенно слабее. В плацебо-контроли-руемое рандомизированное исследование были включены 42 пациента с тяжелой бронхиальной астмой. Половина больных получала стандартную терапию (контрольная группа), а другой половине дополнительно ингалировали мелфалан (ОД мг в день; основная группа). До начала лечения и через 10 дней после больным выполняли спирометрические, биохимические, гематологические и иммунологические исследования. Клинический эффект в основной группе был существенно более выражен, чем в контроле: существенно улучшились показатели функции внешнего дыхания, возросла толерантность к физической нагрузке, значимо снизились частота использования р2-агонистов и тяжесть астматических приступов (р<0,05). У 60% больных основной группы наблюдали гистоультраструктурные признаки регенерации эпителия бронхов, а в образцах бронхиального смыва имело место повышение содержания цитокинов, что также может быть результатом регенерации. Снижение содержания лимфоцитов СБ95+ в периферической крови больных основной группы свидетельствует о систем1 юм противовоспалительном эффекте ультранизких доз алкилирующих агентов.

ПРОДУКЦИЯ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ т У1УО ПОСЛЕ ИНФЕКЦИИ ЭПИДЕМИЧЕСКИМ ВИРУСОМ ГРИППА А/ЛЕНИНГРАД/134/57 (Н2Ы2) И ЕГО ХОЛОДОАДАПТИРОВАННЫМИ АТТЕНУИРОВАННЫМИ ВАРИАНТАМИ

Рекстин А.Р.*. Лу X.**, Кац Д.**, Руденко Л.Г.*

* НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия;

* * Центр по контролю заболеваемости,

Атланта, США

Введение. Гриппозная инфекция остается одной из серьезнейших глобальных медицинских проблем. Ееоснов-

ной профилактической мерой является вакцинация. Живые гриппозные вакцины имеют ряд преимуществ перед инактивированными вакцинами потому, что индуцируют сбалансированный гуморальный и клеточный иммунный ответ. Иммуногенность живых гриппозных вакцин может зависеть, с одной стороны, от их способности индуцировать ответ цитокинов на ранних стадиях инфекции, что предопределяет развитие эффективного адаптивного иммунного ответа, а с другой, от чувствительности аттенуированных вакцинных штаммов к антивирусному действию этих цитокинов. Роль провоспалительных цитокинов в патогенезе гриппозной инфекции в настоящее время изучена недостаточно.

Целью настоящего исследования являлось изучение продукции провоспалительных цитокинов при экспериментальной гриппозной инфекции у мышей, вызванной вирусами гриппа, отличающихся по степени вирулентности.

Материалы и методы. В работе были использованы следующие вирусы гриппа: исходный эпидемический штамм А/Ленинград/134/57 (H2N2), холодоадаптиро-вапные (ха) вирусы А/Ленинград/134/17/57 (H2N2) и А/Ленинград/134/47/57 (H2N2), полученные из исходного вируса в результате соответственно 17 и 47 пассажей на куриных эмбрионах при пониженной (25°С) температуре. Вирусы выращивали в аллантоисной полости 10-дневных развивающихся куриных эмбрионов в течение 48 часов. Мышей линии Balb/c иммунизировали ин-траназально под легкой анестезией. В различные сроки после иммунизации у животных получали гомогенаты легких, которые замораживали при -70°С. Инфекционный титр вирусов в пробах определяли титрованием на 10-дневных куриных эмбрионах. В гомогенатах определяли продукцию фактора некроза опухолей (TNF-a), ин-терлейкина-6 (IL-6), интерферона-у (IFN-y), интерлей-кина-12 (IL-12), и интерлейкина-1 (IL-1) с использованием коммерческих наборов R & D Systems для иммуно-ферментного анализа.

Результаты. Репродукция эпидемического вируса в нижних отделах респираторного тракта мышей в более 1000 раз превышала репродукцию холодоадаптировапиых вирусов, которая в легких была незначительной или вообще не регистрировалась. Инфекция эпидемическим вирусом стимулировала активную выработку TNF-a, IL-6, IL-12, а также IFN-y. Кинетика продукции цитокинов имела различный характер. После инфекции холодоадаптированными вирусами уровни TNF-a, IL-6, IL-12 и IFN-y были значительно ниже, чем при инфекции эпидемическим штаммом. При этом имелись различия в продукции цитокинов между двумя холодоадаптированными штаммами. Вирус А/Ленинград/134/17/57 характеризовался заметной продукцией IL-6 и IFN-y в легких мышей, по меньшей чем при инфекции эпидемическим вирусом. В то же время дополнительно ослабленный вирус А/Ленинград/134/47/57 индуцировал количества TNF-a и IFN-y не отличающиеся от величин у контрольных животных.

Выводы. Репродукция вирусов в легких мышей может служить одной из характеристик степени аттенуации вируса гриппа. Ответ провоспалительных цитокинов на ранней стадии инфекции в легких мышей коррелировал с уровнем вирусной репликации в легких и степенью аттенуации штаммов вируса гриппа. Холодоадаптированные аттенуированные вирусы вызывали лишь незначительное повышение уровней указанных цитокинов. На-

против, вирус дикого типа вызывал значительное увеличение синтеза IL-6, IL-12 и TNF-a. Для выяснения роли отдельных цитокинов в проявлении патофизиологических особенностей гриппозной инфекции и иммунном ответе необходимы дальнейшие исследования.

ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК С ФЕНОТИПОМ MDR1+ К ДЕЙСТВИЮ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ЛИМФОЦИТОВ, ИНДУЦИРОВАННЫХ С ПОМОЩЬЮ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК.

Родина A.B.1,2. Москалева Е.Ю.1’2,

Высоцкая О.В.2, Попова О.Н.2, Северин С.Е.2, Северин Е.С.1

Всероссийский научныц центр молекулярной диагностики и лечения , Москва, Россия;

Московский научно-исследовательский институт медицинской экологии, Москва, Россия

Введение. Одной из основных причин неэффективности лечения онкологических заболеваний с помощью методов современной химиотерапии является множественная лекарственная устойчивость (МЛУ) опухолевых клеток, связанная с функционированием трапсмембранного белка - Р-гликопротеипа (Pgp), гииерэкспрессия которого является результатом активации гена MDR1. Поэтому не прекращаются исследования, направленные на создание таких способов противоопухолевой терапии, которые были бы эффективны в отношении резистентных к химиотерапии опухолевых клеток. В частности, большие надежды связывают с развитием иммунологических методов. В настоящее время для индукции эффективного противоопухолевого иммунного ответа, усиленно исследуются вакцины на основе дендритных клеток (ДК), т.к. именно эти клетки обладают уникальной способностью оптимальным образом представлять антигены Т-лимфоцитам и индуцировать специфический иммунный ответ. Для получения вакцин функционально активные ДК инкубируют с антигенами, специфичными для опухоли (пептиды, белки, клеточные лизаты, РНК, кДНК и др.).

Целью данного исследования явилось изучение активности специфических противоопухолевых ЦТЛ, индуцированных иммуногеппыми ДК, в отношении чувствительных линий клеток аденокарциномы яичника и молочной железы человека и клеток тех же линий с индуцированной МЛУ в экспериментах in vitro.

Материалы и методы. Экспрессию белка Pgp на мембране чувствительных линий клеток аденокарципомы яичника линии SKOV3 и молочной железы человека линии MCF-7 и их резистентных вариантов, полученных с помощью селекции по устойчивости к доксорубицину -SKVLB и MCF7AdrR, соответственно анализировали с помощью метода проточной цитофлуориметрии. ДК получали из фракции мононуклеарных лейкоцитов периферической крови человека. Для исследования активности специфических противоопухолевых цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) в отношении исследуемых линий клеток их индуцировали иммуногеппыми ДК, нагруженными лизатами или суммарной РНК чувствительных опухолевых клеток. В качестве контроля использовали ЦТЛ, индуцированные интактными ДК. Количество ан-тигенспецифических лимфоцитов определяли с помощью ELISPOT-теста для IFN-гамма.

Результаты и обсуждение. Показано, что использование и лизатов опухолевых клеток, и суммарной опухолевой РНК в комплексе со зрелыми ДК, приготовленными из моноцитов периферической крови человека по стандартному методу, позволяет индуцировать опухолеспецифические ЦТЛ. Обнаружено, что специфические в отношении опухолевых антигенов ЦТЛ, индуцированные с помощью Д К, обработанных как опухолевым лизатом, так и суммарной опухолевой РНК, с высокой эффективностью ли-зируют не только чувствительные, но и резистентные опухолевые клетки, экспрессирующие ген множественной лекарственной устойчивости МОК1. Причем, в отношении резистентных линий ЙКУЬВ и МСР-7А‘|гК активность ЦТЛ была даже выше, чем в отношении чувствительных линий БКОУЗ и МСР-7. В отношении резистентных линий при этом отмечена более высокая неспецифическая ЦТА. По данным БОБРОТ-теста, количество окрашенных пятен, соответствующее количеству клеток, секретирующих ШЫ, в случае с лимфоцитами, индуцированными иммуноген-ными ДК, значительно выше, чем с контрольными лимфоцитами, индуцированными интактными ДК. Сравнивая уровень ШЫ-секретирующих лимфоцитов, индуцированных ДК, нагруженными суммарной опухолевой РНК и индуцированных ДК, нагруженными опухолевым лизатом, следует отметить, что более высокий уровень антигенспе-цифических лимфоцитов обнаруживается в последнем случае. Представленные результаты позволяют сделать вывод, что препараты зрелых ДК, нагруженных лизатами опухолевых клеток или суммарной опухолевой РНК, могут индуцировать высокий противоопухолевый иммунный ответ в отношении и высоко устойчивых к химиотерапии опухолевых клеток, что крайне важно для иммунотерапии онкологических заболеваний.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПРОТЕКТИВНОГО АНТИГЕНА В.АЫТНЯАСЯ

Романов М.Г.. Яковлева И.В., Кириллов Л.В., Свиридов В.В.

ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН, Москва, Россия;

ФГУ Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов МСХ, Москва, Россия

Совершенствование методов быстрой и точной идентификации возбудителя сибирской язвы и вырабатываемых им токсических субстанций актуально не только ввиду необходимости своевременной диагностики случаев заболевания животных и человека, существующей потенциальной угрозы применения этого возбудителя в террористических целях, но и для создания более эффективных и безопасных профилактических препаратов. Устойчивость к сибиреязвенной инфекции определяется антителами, нейтрализующими эффект факторов вирулентности возбудителя - летального (ЛФ) и отечного (ОФ). Каждый из этих компонентов проявляет свое действие лишь после взаимодействия с третьим компонентом, вырабатываемым возбудителем, - протективным антигеном (ПА), который после связывания с мембранным рецептором и протеолитической активации формирует на поверхности клетки гептамерную вставку, обеспечивающую

транслокацию в цитозоль токсических ферментов ЛФ и ОФ. ПА является ключевым звеном в этой «тройке», поскольку установлена прямая зависимость между титрами антител к ПА и выживаемостью после летального заражения спорами вирулентных штаммов возбудителя.

Создание инструмента для качественной оценки и количественного определения компонентов сибиреязвенного токсина представляет интерес для сравнительной характеристики токсинообразующей активности вакцинных, диких и конструируемых штаммов сибиреязвенного микроба и необходимо для совершенствования и оценки свойств новых профилактических препаратов.

С этой целыо нами были предприняты эксперименты по получению моноклональных антител (МкАт) к про-тективному антигену B.anthracis и созданию на основе их использования метода определения ПА.

Мышей трижды иммунизировали очищенным протек-тивным антигеном, сорбированным на геле гидроксида алюминия. Гибридизацию иммунных спленоцитов с клетками миеломы линии P3-X63-Ag8.653 проводили с помощью ПЭГ-1550 (Serva). Культивирование и клонирование гибридных культур проводили по общепринятому протоколу. Клоны гибридом отбирали по результатам тестирования в ИФА на планшетах сенсибилизированных ПА. Для дальнейшей работы отбирали культуры с наиболее интенсивным и стабильным синтезом антител. Технологичные клоны криоконсервировали и хранили в жидком азоте. МкАт выделяли сульфатным осаждением из среды культивировании гибридом in vitro и в препаративном количестве - из асцитной жидкости мышей с привитыми гибридомами.

Изотип МкАт, синтезируемых отобранными гибридомами 1А1; 2В2; 2G5; ЗА2; 3G12 - IgGl.

МкАт конъюгировали с пероксидазой хрена перйодат-ным методом по стандартной методике. Полученные конъюгаты, обозначенные как 2С5-ПХ, 1А1-ПХ, ЗА2-НХ, 2В6-ПХ; 3G12-nX, сохранили иммунохимическую и ферментативную активность в ИФА при их взаимодействии с антигеном. Для создания метода количественного определения ПА на основе двухсайтового сэндвич-ИФА были проанализированы все комбинации антител на подложке и их пероксидазных конъюгатов. Для адсорбции на твердой фазе наилучшими оказались МкАт ЗА2. Антитела 2В6 и 3G12 после сорбции на планшетах переставали связывать ПА. Наиболее активными оказались пе-роксидазные конъюгаты антител 2G5 и 1А10. Разработанный вариант ИФА позволяет определять ПА в концентрации от 25 нг/мл и выше.

При сравнительной оценке продукции ПА 6 вакцинными штаммами B.anthracis и типичными штаммами 5 видов сапрофитных бацилл (B.megaterium, B.subtilis, B.mucoides, B.pseudoanthracis, B.cereus) при культивировании на среде 199 с добавлением 10% сыворотки KPCripo-тективиый антиген выявлялся в культуральных-жидкостях только В. anthracis, но не в среде культивирования сапрофитов, а среди сибиреязвенных штаммов наибольшим уровнем синтеза ПА отличались штаммы «Ихтиман» и 34F2. Таким образом, разработанный тест позволяет оценивать как продуктивную способность штамма, так и идентифицировать возбудителя по этому признаку, а также выявлять штаммы, относимые по генотипическим признакам (по данным ПЦР) к В. anthracis, но утратившие по тем или иным причинам способность вырабатывать ПА.

ВАКЦИНА BCG НЕ ЗАЩИЩАЕТ МЫШЕЙ CBA/N ОТ ТУБЕРКУЛЕЗА: ВОЗМОЖНАЯ РОЛЬ В-КЛЕТОК В ФОРМИРОВАНИИ Т-КЛЕТОК-ПАМЯТИ К МИКОБАКТЕРИЯМ

Рубакова Э.И.. Петровская С.Н., Кондратьва Т.К., Капина М.А., Мищенко В.В., Апт А.С.

ЦНИИ туберкулеза РАМН, Москва, Россия

Ранее нами было установлено, что мыши CBA/N, несущие мутацию xid (дефект дифференцировки В-клеток), не отличаются от родительской линии СВА по устойчивости к первичной туберкулезной инфекции. С другой стороны, в отличие от мышей СВА, для мышей CBA/N вакцина BCG оказалась неэффективной при заражении вирулентным штаммом Mycobacterium tuberculosis H37R.V. Этот результат оказался совершенно неожиданным, поскольку протективный иммунитет при туберкулезе всегда связан с Т-клетками, функции которых у мышей СВА/ N всегда считали нормальными, за исключением обнаруженной нами сниженной пролиферативной активности (Nikonenko et al., 1996).

В настоящей работе мы исследовали степень активации и состав клеточных популяций лимфоидных клеток в легких, селезенке и лимфатических узлах у мышей линий СВА и СВА/N, вакцинированных М. bovis BCG и затем зараженных М. tuberculosis H37Rv.

В соответствии с ожидаемым, у интактных мышей СВА/N в регионарных лимфатических узлах обнаруживалось в два раза меньше В-клеток, несущих маркер CD40, по сравнению с мышами СВА. После вакцинации, и особенно после последующего заражения, у мышей СВА количество таких клеток возрастало в несколько раз, тогда как у мышей СВА/N их число не изменялось.

В легких (по не в лимфатических узлах) мышей обеих линий после вакцинации BCG обнаруживалась одинаковое количество Т-лимфоцитов CD4+, продуцирующих IFN-y, основной цитокин, участвующий в активации антимикобактериальной активности макрофагов. Таким образом, на фазе вакцинации мыши СВА/N мы не обнаружили серьезных нарушений в основном звене протек-тивиого иммунитета.

Через 1 неделю после заражения вирулентными микобактериями в селезенке вакцинированных мышей СВА число активированных CD4+ клеток (CD4+CD44+CD62L‘) возрастало в 3 раза. У мышей СВА/ N количество активированных клеток CD4+ практически не увеличивалось. Как и после вакцинации, IFNy-проду-цирующие клетки CD4+ и CD8+ в лимфоидных органах мышей обеих линий не обнаруживались, а в легких их число возрастало одинаково.

Через 3 недели после заражения (гибель первых иевак-цинироваиных мышей) у вакцинированных мышей отличий по маркерам активации Т-клеток в лимфоидных органах и легких не было. Однако при анализе методом ELISPOT отсортированной на магнитных микросферах популяции легочных Т-лимфоцитов CD4+ оказалось, что у вакцинированных и затем зараженных мышей СВА, происходит 3-кратный (!) прирост IFN-у-продуцирующих клеток но сравнению с невакципированными зараженными, тогда как у мышей СВА/N число IFN-Y-продуцирующих клеток CD4+ в легких после заражения остается низким даже, если мыши были предварительно провакцинированы BCG.

Считается, что В-клетки CD40+ принимают участие в формировании Т-клеток памяти. Дефицит В-клегок у

мышей CBA/N и, соответственно, корецсптора CD40, играющего существенную роль в активации Т-клсток, может быть причиной неэффективности вакцинации. Последовательный контакт с вакциной BCG и М. tuberculosis не вызывают у мышей CBA/N вторичной индукции специфических IFN-Y-продуцирующих клеток, что и может объяснять отсутствие нротективного эффекта вакцины.

ПРОТИВООПУХОЛЕВЫЙ ЭФФЕКТ ИММУНИЗАЦИИ МЫШЕЙ НЕ АССОЦИИРОВАННЫМ С ОПУХОЛЬЮ АУТОБЕЛКОМ ДЕСМОГЛЕИНОМ 3

Свирщевская Е.В.. Моисеева Е.В.,

Чаадаева А.В.,Мушенкова Н.В.,Коцарева О.Д.

Институт биоорганической химии

им. М.М.Шемякина и ЮЛ.Овчинникова РАН,

Москва, Россия

Разработка противоопухолевых вакцин является одним из интенсивно развивающихся направлений. В основе таких вакцин обычно используют белки или кодирующие их гены, гиперэкспрессированпые в опухолевых клетках. Однако все опухоль-ассоциированные антигены являются белками собственного организма. Индукция отве та против любого аутобелка, экспрессированного в oí [ухолевых клетках, может приводить к формированию противоопухолевого ответа. Целью данной работы явилось изучение возможности снижения противоопухолевого роста с помощью индукции аутоиммунного ответа па белок адгезии ксратиноцитов десмоглеип 3 (ДСГЗ). Известно, что аутоантитела к ДСГЗ являются патогенными у части людей, страдающих пузырчаткой. Однако в норме такие антитела выявляются и у здоровых людей, то есть могут быть не патогенными. У мышей иммунизация ДСГЗ вообще не приводит к формированию патологии кожи. Белок ДСГЗ экспрессируется на всех эпителиальных клетках, в том числе и па клетках рака молочной железы, что нами было показано методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (Г1ЦР-ОТ). Для индукции аутоиммунного ответа на ДСГЗ мышей линии BYRB иммунизировали рекомбинантным белком в адъюванте. Через педелю после иммунизации мышам перевивали сипгенную опухоль молочной железы в дозе 10(> клеток па мышь п/к. Клетки получали из спонтанной опухоли, обработанной коллагепазой. К моменту перевивки опухоли у мышей формировались преимущественно IgGl антитела к ДСГЗ в низком титре (1:50). Рост опухоли наблюдали, начиная с 15 дня после перевивки. Развитие опухоли наблюдали у всех мышей. Однако предварительная иммунизация ДСГЗ приводила к задержке роста опухоли, что выражалось в меньшем среднем диаметре опухоли у иммунных мышей по сравнению с контролем. Гибель мышей прямо зависела от размера опухоли и наблюдалась при среднем диаметре опухоли от 20 до 22 мм. Все животные контрольной группы погибли к 35 дню после перевивки опухоли. К этому времени у животных иммунной группы размер опухоли достиг 18 мм и стабилизировался. Несмотря на наличие большой опухоли (20-21 мм), гибель мышей иммунной группы началась только па 80-й день. Все животные этой группы погибли к 105 дню после перевивки опухоли. Анализ гуморалы юго о твета показал рост Д СГЗ-специфичсскпх IgG 1 антител (титры 1:1000), индуцированный ростом опухоли. Таким образом, иммунизация аутобелком, экспрессированным с нормальной плотпостыо на опухолевых клетках эпителиального происхождения, приводит к торможению роста опухоли.

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ЛЕКАРСТВ И ЦИТОКИНОВ В ЦИТОТОКСИЧЕСКОМ ДЕЙСТВИИ И ИНДУКЦИИ АП0ПТ03А В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ

Славина Е.Г.. Черткова А.И., Короткова О.В., Гуторов С.Л., Заботина Т.Н., Буркова A.A.

Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН, Москва, Россия

Химиотерапия, являющаяся основным методом лечения при злокачественных опухолях, осложненных метастазами, оказывается эффективной и обеспечивает значительное увеличение продолжительности жизни больных лишь в части случаев. Большинство метастатических вариантов рака или резистентны к химиотерапии, или становятся таковыми в процессе лечения. Повышение эффективности противоопухолевой лекарственной терапии в ряде случаев достигается совместным применением хи-миопрепарагов и различных иммуномодуляторов и ци-токинов. В настоящее время в клинике широко используются препараты цитокинов. В частности, IFN, интерлейкин-2, фактор некроза опухолей-а. Имеется обширная литература с описанием усиления интерферонами чувствительности опухолевых клеток к противоопухолевым лекарствам. Однако практически ничего не известно о механизмах этого усиления. В нашей работе мы поставили целыо изучить зависимость усиления цитоток-сичпости и апоптоз-индуцирующей активности противоопухолевых лекарств интерфероиом-а и фактором некроза опухолей-а от интенсивности экспрессии гена множественной лекарственной устойчивости MDR-1 и гена, сдерживающего апоптоз, Вс1-2. В работе были использованы культуры опухолевых клеток FIT-29 (адснокарци-пома толстой кишки человека) - иптактные и инфицированные геном MDR-1, а также клетки линии HeLa -иптактные и инфицированные геном Вс1-2. Эффективность цитотоксического действия доксорубицина и 5-фто-рурацила в отношении этих опухолевых клеток определяли с использованием высокочувствительного полуавтоматического колориметрического метода - МТТ-тес-та. Интенсивность процессов апоптоза оценивали проточной цитофлюориметрией клеток, окрашенных после спиртовой фиксации пропидиумом иодидом. Рекомбинантные препараты цитокинов - IFN-a (Roferon А, Hoffman la Roch, Швейцария) и фактор некроза опухолей- (отечественный препарат Альнорин) использовали в нетоксичных и пс индуцирующих апоптоз концентрациях. Показано, что как IFN, так и альнорин существенно усиливают цитотоксический эффект противоопухолевых препаратов в отношении панели опухолевых клеток. Это действие, по-видимому, пе зависит от модуляции экспрессии гена MDR-1, так как проявляется в равной мере против как неизмененных, так и гиперэкспрессирующих этот ген клеток. Кроме того, они усиливают также цитотоксичность 5-фторурацила, действие которого не регулируется механизмами множественной лекарственной устойчивости. IFN и фактор некроза опухолей (альнорин) также значительно повышают интенсивность цитотоксического действия доксорубицина и 5-фторурацила в отношении клеток IleLa и индукцию в них апоптоза, однако в большей степени этот эффект выявляется на клетках, гиперэкспрессирующих ген Вс1-2, чем па иптактных. Усиление цитотоксического действия цитокинами в большей степени проявляется в отношении доз противоопу-

холевых лекарств, убивающих клетки путем апогтгоза, и значительно слабее или вовсе не определяется в отношении высоких доз, вызывающих некротическую гибель клеток. Сопоставляя эти экспериментальные данные с результатами клинических исследований по использованию интерферона и альнорина для лечения онкологических больных, мы приходим к заключению о том, что в противоопухолевой терапии успешное применение интерферона и, вероятно, и фактора некроза опухолей связано не столько с их иммуномодулирующими свойствами, сколько с воздействием на процессы апоптоза.

ВЛИЯНИЕ БЕЛКА БЕРЕМЕННОСТИ PAPP-A/PROMBP НА ЭКСПРЕССИЮ АДГЕЗИОННОЙ МОЛЕКУЛЫ CD54 ЧЕЛОВЕЧЕСКИМИ ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫМИ КЛЕТКАМИ ЛИНИИ EA.HY926.

Соколов Д.И., Сельков С.А.

ГУ НИИ акушерства и гинекологии РАМНим.Д.О. Отта, Санкт-Петербург, Россия

Ассоциированный с беременностью гликопротеиновый комплекс РАРР-А/ргоМВР является неактивной формой белка РАРР-А, который регулирует активность инсулиноподобного фактора роста (IGF). Концентрация РАРР-А/ ргоМВР в плазме крови постепенно увеличивается в течение нормальной беременности. При гестозах его концентрация в плазме крови в несколько раз выше, чем при нормальной беременности. Одним из главных признаков в патогенезе гестоза является дисфункция эндотелиальных клеток. Поэтому целью исследования явилось изучение влияния РАРР-А/ргоМВР на спонтанную и индуцированную TNF и\или IFN экспрессию адгезионных молекул CD54 человеческими эндотелиальными клетками линии ЕА.Ну926. В экспериментах использовали высокоочищен-ный (электрофоретически гомогенный) белок РАРР-А/ ргоМВР, любезно предоставленный научным сотрудником НИИ АГ им.Д.О.Отта П.П.Хохловым.

РАРР-А/ргоМВР не влиял на спонтанную экспрессию CD54 эндотелиальными клетками. При повышенных концентрациях РАРР-А/ргоМВР дозозависимо снижал индуцированную TNF hVuhiIFN экспрессию адгезионных молекул CD54. Возможно, повышение концентрации РАРР-А/ргоМВР имеет протективное значение в патогенезе гестоза.

ВЛИЯНИЯ ЦИТОКИНОВ НА СВОЙСТВА ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ЛИНИИ EA.HY.926.

Старикова Э.А.. Фрейдлин И.С., Соколов Д.И.*, Сельков С.А.*

НИИ экспериментальной медицины РАМН,

*НИИ акушерства и гинекологии РАМН, Санкт-Петербург, Россия

Эндотелий сосудов играет важную роль в развитии и регуляции иммунного и воспалительного ответа. В процессе развития воспалительного ответа происходит последовательная смена экспрессии адгезионных молекул и секреции хемокинов эндотелиальными клетками сосудов, способствующая первоначальному выходу в очаг воспаления нейтро-филов, а позднее моноцитов. Изменения свойств эндотелия могут также способствовать преимущественному развитию клеточного или гуморального иммунного ответа.

Цель исследования состояла в изучении влияния про-воспалительных и противовоспалительных цитокинов на свойства эндотелиальных клеток перевиваемой линии EA.hy.926. Для этого использовали в качестве провоспа-лительных цитокинов TNF-a, IFN-y, а в качестве провос-палительного - IL-4, а также комбинации этих цитокинов. Изменения свойств эндотелия оценивали по экспрессии адгезионных молекул ICAM-1 и VCAM-1, по интенсивности секреции IL-8, а также по степени адгезии к эндотелиальным клеткам моноцитов периферической крови человека.

Анализ экспрессии адгезионных молекул ICAM-1 и VCAM-1 на поверхности эндотелиальных клеток показал, что TNFa, IFNy вызывают достоверное повышение уровня экспрессии этих молекул на поверхности клеток EA.hy.926, а IL-4 не обладает самостоятельным влиянием на экспрессию адгезионных молекул, но ингибирует экспрессию, индуцированную провоспалительными цитокинами. TNF-a, IL-4, а также комбинации цитокинов TNF-y с IL-4 и TNF-a с IFN-y усиливают адгезию моноцитов ПК человека к эндотелию. IFN-y не оказывает самостоятельного влияния на исследуемый показатель. Как видно из изложенного, только для TNF-a характерно однонаправленное действие на экспрессию адгезионных молекул и адгезию моноцитов к эндотелиальным клеткам. Что касается IFN-y и IL-4, их эффекты разнонаправленны, что свидетельствует о более сложном механизме адгезии, которая зависит не только от экспрессии изученных адгезионных молекул.

Оценка влияния тех же цитокинов и их сочетаний на уровень секреции IL-8 клетками EA.hy926 показала десятикратное повышение секреции IL-8 под влиянием TNF . В отличие от этого, IL-4 и IFN-y не обладают самостоятельным действием на секрецию IL-8, но ингибируют секрецию IL-8, индуцированную TNF-a. Обращает на себя внимание выявленный факт однонаправленного действия на секрецию IL-8 провосиалительного цитокипа IFN и противовоспалительного цитокина IL-4.

Поддержана грантами РФФИ№03-04-48118 и НШ -

540.2003.4

ИММУНОГЕННОСТЬ И ПРОТЕКТИВНАЯ АКТИВНОСТЬ ГРИППОЗНЫХ ВЕКТОРОВ, ЭКСПРЕССИРУЮЩИХ ЕБАТ-б СЕКРЕТОРНЫЙ БЕЛОК МИКОБАКТЕРИЙ,

ПРИ ГЕНЕРАЛИЗОВАННОМ ТУБЕРКУЛЕЗЕ У МЫШЕЙ С57В1./6

Стукова М.А*.. Заболотных Н.В**., Виноградова Т.И**., Серайниг С.***, Катингер Г.***, Егоров А.*

*ГУ «НИИ гриппа РАМН»,

Санкт-Петербург, Россия;

**ГУ «НИИ«Санкт-Петербургский НИИ фтизиопулъмонологии М3 РФ»;

* * * Институт прикладной микробиологии,

Вена, Австрия

В связи с недостаточной эффективностью вакцины БЦЖ, по-прежнему сохраняющей монопольную позицию при специфической профилактике туберкулеза, создание нового поколения вакцин крайне необходимо. Нами получены рекомбинантные аттенуированные штаммы вируса гриппа А, экпрессирующие белок ЕБАТ-6 микобактерий туберкулеза. Данный белок входит в семейство ранних секреторных белков, кодируемых участком генома, утраченным

в процессе длительного культивирования штаммов вакцины БЦЖ, и обладает нротективным действием при иммунизации животных в форме пептидных и ДНК вакцин.

Целью настоящей работы является определение про-тективного эффекта и активности Т-клеточного иммунного ответа при использовании гриппозного вектора, экспрессирующего микобактериальный антиген, в качестве вакцины при экспериментальном туберкулезе.

Материалы и методы: мышей линии C57BL/6 иммунизировали гриппозными векторами, экспрессирующими ESAT-6, интраназально дважды с интервалом в 3 недели в дозе 10ь БОЕ с целью индукции системного и местного иммунного ответа. Генерализованный туберкулез вызывали внутривенным введением 10ь КОЕ М. bovis bovinus 8 через 3 педели после второй иммунизации.

Результаты свидетельствуют, что иммунизация задерживала развитие туберкулезной инфекции, отдаляя сроки гибели вакцинированных мышей; удлиняя среднюю продолжительность их жизни; снижая обсемененность ткани легких МБТ (на 1,3 log); уменьшая распространенность специфического воспаления в легочной ткани по гистологической оценке. Иммунологическое исследование показало, что вакцинация вызвала антиген специфичный CD4 клеточный ответ, модифицировавший ТЪ-1им-мупиый ответ на инфицирование мышей МБТ. Под влиянием вакцинации отмечены: на ранних сроках развития инфекции - достоверное снижение повышенного уровня секреции IL-4 и восстановление индекса IFN-y/ IL-4 на Con А в культуре спленоцитов; на более ноздних, на фоне выраженного угнетения ТЬ-1 лимфоцитов у певакцини-рованных зараженных мышей, - стимуляция спонтанной и индуцированной (Con А и rESAT 6) продукции IFN-y спленоцитами, повышение уровня их пролиферации (спонтанной и в ответ на rESAT 6), активация продукции спленоцитами IL-2 на rESAT. У вакцинированных животных секреция IFN-y в ответ на Con А лимфоцитами лимфатических узлов и продукция IL-2 спленоцитами в ответ на СопА н rESAT 6 регистрировались па уровне показателей интактной группы в отличие от инфекци-рованных невакцинировапных мышей, где отмечалась достоверная иигибиция продукции данных цитокинов.

Заключение. Иммунизация гриппозным вектором, экспрессирующим ESAT-6, перед заражением C57BL/6 мышей М. bovis bovinus 8 привела к развитию антиген специфичного CD4 клеточного ответа, что способствовало снижению степени угнетения Th-1 иммунного ответа, характерного для туберкулеза, и обеспечило протективный эффект при экспериментальной туберкулезной инфекции.

ГЕНЕРАЦИЯ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК IN VITRO С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ IFN-a

Суренский С.В.

НИИ гематологии и переливания крови, Минск, Беларусь

С целью борьбы с рядом онкологических заболеваний и некоторых вирусных инфекций в последнее десятилетие активно разрабатываются методы стимуляции иммунитета с использованием ДК. Разработаны и изучаются не менее семи способов активации дифференцирования моноцитов периферической крови в дендритные клетки in vitro и столько же способов стимуляции созревания дендритных клеток.

Цель данной работы - подбор условий культивирования моноцит-нроизводных дендритных клеток, морфологическая и фенотипическая оценка дендритных клеток, полученных культивированием моноцитов с ГМ-КСФ/IFN-a.

Чистота выделения моноцитов, полученных из моно-нуклеаров периферической крови здоровых доноров крови методом адгезии на пластике, составляет более 60%. В течение 18 часов после выделения клетки культивировали в полной питательной среде с аутологичной плазмой без ростовых факторов. Затем меняли среду, в которой содержались ГМ-КСФ (1000 ЕД/мл) и IFN-a - 1000 (Ед/ мл). Клетки культивировались от 3-х до 5 суток, что зависело от чистоты выделения моноцитов. Отмечено, что чем выше процент загрязнения культуры моноцитов лимфоидными клетками, тем четче выражена ингибиция дифференцирования моноцитов в дендритные клетки. Процент примеси пропорционально увеличивает апоптоз дендритных клеток в культуре. Это вполне согласуется с результатами изучения жизненного цикла дендритных клеток in vivo и 100% апоптозом ДК при стимуляции Т-лим-фоцитов in vitro. Инкубацию клеток прекращали, когда большинство клеток становилось суспензионными.

Морфологически клетки характеризовались нежной структурой ядра, смещенного на периферию, вуалевидной цитоплазмой. На многих клетках можно было видеть нитевидные отростки. Это все признаки незрелых дендритных клеток.

Фенотипический анализ показал, что у моноцитов, экспрессирующих маркер CD 14, при дифференциации в дендритные клетки наблюдается снижение экспрессии этого маркера. В результате культивирования клетки начишот экспрессировать маркер CD83, характерный для дендритных клеток. Дифференцированию в дендритные клетки в наших экспериментах подвергалось 60% моноцитов. Спонтанное дифференцирование моноцитов в дендритные клетки (без стимуляции) происходило в 5-7%, что согласуется с данными литературы. Длительное культивирование (более 5 дней) с использованием ГМ-КСФ/IFN-a ведет к возрастающему апоитозу. По данным литературы, апоптоз усиливается при более длительном культивировании даже при чистоте популяции моноцитов 90%.

Полученные результаты являются основанием для использования данного способа генерации моноцит-производных дендритных клеток при разработке иммуноген-пых вакцин.

ВЛИЯНИЕ ВОДНЫХ ПРОЦЕДУР РАЗЛИЧНЫХ ТЕМПЕРАТУРНЫХ РЕЖИМОВ НА ИММУННУЮ СИСТЕМУ МЫШЕЙ

Суховей Ю.Г.. Мельников В.П., Калёнова Л.Ф., Петров С.А., Фишер Т.А.

НИИ общей и прикладной криологии,

Тюменский филиал НИИКИ СО РАМН,

Тюмень, Россия

Введение. Циклическая смена температуры окружающей среды, воздействуя на организм человека с момента рождения, способствует активации физиологических и биохимических процессов, необходимых для поддержания гомеостаза. Под действием низких температур у лиц, проживающих в условиях Крайнего Севера, отмечаются неспецифические изменения иммунореактивности, такие как снижение фагоцитарной активности нейтрофилов и

концентрации иммуноглобулинов (Ветрова с соавт., 2000; Козырева с соавт., 2003).

Для повышения устойчивости иммунной системы в последние годы широко пропагандируются различные виды водного закаливания организма - от экстремальных, таких как обливание ледяной водой и купание в проруби, до физиологически комфортных. В то же время практически не изучено влияние щадящих видов закаливания на иммунную систему. При создании модели водного «закаливания» на мышах исходили из известных схем закаливания.

Цель исследования - определить вектор влияния температурных режимов на иммунореактивность.

Материалы и методы. Эксперимент проведен на лабораторных мышах. Расчет временных параметров пребывания мышей в холодной (+7°С в течение 5 с) и теплой (+40°С в течение 30 с) воде был проведен на массу тела. Отдельно исследовалось влияние холодной и теплой воды, контрастная смена температуры воды с холодной на теплую и с теплой на холодную. Оценивалось состояние гуморального звена иммунитета определением АОК/сел (Cunningham, 1968) и клеточного звена иммунитета по реакции ГЗТ (Crowle, 1975) на эритроциты барана.

Результаты. Сравнивая между собой вектор влияния теплой и холодной воды на иммунитет мышей, можно отметить дивергенцию показателей: под влиянием холодной воды активируется преимущественно клеточное звено, а под влиянием теплой - гуморальное звено иммунитета. Действие данных факторов на иммунную систему не продолжительно по времени, основные изменения в иммунореактивности наблюдаются первые 3-5 дней от начала воздействия. Контрастная смена температуры воды с холодной на теплую приводит к усилению активности клеточного и снижению гуморального иммунитета. Контрастная смена температуры воды с теплой на холодную приводит к одновременной активации гуморального и клеточного иммунитета. Эффект стимуляции иммунной системы контрастной сменой температуры воды с теплой па холодную сохраняется в течение 2-х недель после прекращения процедур.

Заключение. Таким образом, проведенное исследование показало, что различные температурные режимы оказывает значительное неспецифическое влияние на иммунореактивность животных. Используя различные режимы температурного воздействия, можно неспецифически, но достаточно селективно влиять на гуморальное и клеточное звенья иммунитета.

ОСОБЕННОСТИ ПОСТРОЕНИЯ КРИВЫХ ДОЗА-ЭФФЕКТ У МЫШЕЙ ИНБРЕДНЫХ ЛИНИЙ

Табунов B.C.. Кирилличева Г.Б., Непомнящих В.А., Соловьева М.С.

ГУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва, Россия

Любой иммуномодулятор в зависимости от конкретных условий реализации иммуномодулирующей активности препарата может обладать как иммуностимулирующей, так и иммуносупрессорной активностью, то есть, как повышать, так и снижать неспецифическую резистентность организма к различным патологическим воздействиям.

Важнейшей характеристикой любого иммуномодулятора является кривая доза - эффект, которая характеризует

зависимость между характером изменения изучаемого показателя и дозой препарата. Показано, что характер кривой доза - эффект имеет свои особенности при применении препаратов, в действии которых преобладают специфические или неспецифические (адаптогенные) свойства.

В настоящем исследовании изучено влияние стафилококкового анатоксина и конъюнктизана В, препаратов, обладающих иммуномодулирующей активностью, на уровень активности экто 5'- нуклеотидазы макрофагов перитонеального экссудата у мышей инбредных линий. Ранее нами было показано, что по характеру изменений данного фермента можно судить о влиянии препаратов на чувствительность к различным патологическим воздействиям.

В опытах использованы мыши линий (СВА, C57BL/ 6, BALB/C, гибриды F1(CBA+ C57BL/6)). Препараты вводили подкожно в широком диапазоне доз.

В результате проведенного эксперимента были получены кривые доза-эффект для каждого препарата у мышей инбредных линий, выявлены особенности этих кривых при разной генетической принадлежности животных.

Особенностью настоящего исследования явилось применение адаптационно-биоритмологического подхода для оценки результатов эксперимента. Использование данного подхода позволило сделать вывод о том, что в механизме действия иммуномодулирующего эффекта обоих препаратов важное значение имеют неспецифические (адаптогенные) изменения.

Неспецифические изменения - это стандартные однотипные изменения, возникающие в ответ на действие самых разных раздражителей. Специфические изменения - это особые, присущие только данному воздействию изменения.

Экспериментально доказано, что для проведения сравнительного анализа действия иммуномодуляторов у мышей инбредных линий и получения полной информации обо всех сторонах иммуномодулирующего эффекта (специфического и неспецифического компонентов) у мышей всех используемых линий необходимо построение кривой доза - эффект в различные фазы биологического ритма изучаемого показателя.

Показано преимущество адаптационно-биоритмологического подхода по сравнению с традиционными методами исследования для выбора оптимальной дозы иммуномодулирующего препарата.

СТИМУЛЯЦИЯ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА СИНТЕТИЧЕСКИМИ ПЕПТИДНЫМИ ФРАГМЕНТАМИ ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА (TGF 1) -EKNCCVR И LDTNYC

Тагирова АК.. Молдогазиева Н.Т., Симонова A.B.*, Аршинова С.С.*, Бахус Г.О.*, Беспалова Ж.Д.**, Кудрявцева Е.В.**, Овчинников М.В.**, Терентьев A.A.

Российский государственный медицинский университет;

* Институт Иммунологии М3 РФ,

* Кардиологический научный центр,

Москва, Россия

Проведенное сравнение первичных структур а-фетопро-теина (АФП) и трансформирующего фактора роста (TGFßl) выявило ряд аналогий в строении этих белков (Терентьев A.A., 2004). Последовательности 14-19AFP(LDSYQC)h2-7

TGFßl (LDTNYС) различаются всего по двум аминокислотным остаткам и имеют в своих структурах остатки цистеина с —SH группами, которые могут участвовать как во внутримолекулярных, так и межмолекулярпых взаимодействиях. Последовательность 14-19 AFP ранее (Тегеп A.A., 1997,1999, 2000) была выявлена как биоактивный сайт структуры AFP, сходные с ней участки характерны для ряда факторов роста и некоторых онко- и фетоплацентарных белков.

На первом этапе проводимого исследования было решено изучить пептид LDTNYC, а также пептид EKNCCVR, являющийся участком 12-18 полипепгидной цепи TGFßl, который содержал дицистеиновый фрагмент и последовательность EKN,, характерную как для AFP и TGFßl, так и для некоторых белков клеточной адгезии (Терентьев A.A., 2004). Пептиды LDTNYC (acm) и EKNC(acm)C(acm)VR, синтезировали на твердой фазе, (acm) - ацетамидометильная группа, необходимая для защиты от окисления сульфгидрильных групп цистеина. Изучение действия пептидов проводили в реакции властной трансформации лимфоцитов с использованием мо-нонуклеаров периферической крови здоровых доноров.

Гепаринизированную кровь в 2 раза разводили средой 199 («ПанЭко», Россия), затем наслаивали на градиент плотности фиколл-пака («ПанЭко», Россия) и центрифугировали 40 минут при 400 g. Затем отбирали образовавшееся в интерфазе «кольцо» мононуклеаров. После этого клетки дважды отмывали центрифугированием средой 199. Затем мононуклеары доводили до концентрации 2x10е кл/мл в полной культуральной среде (ПКС), состоящей из среды RPMI- 1640 (с 10% сывороткой плода коровы («HyCIon», США), 2 мМ L-глютамина («ПанЭко») и 40 мкг/мл гента-мицина («ПанЭко», Россия). Их жизнеспособность после выделения составляла не менее 95%, что определяли но включению 0,2% трипанового синего. Мононуклеары культивировались в объёме 150 мкл в 96-луночных круглодонных планшетах при 37 в атмосфере 5% С02 в течение 72 часов в присутствии только ПКС - спонтанная пролиферация и в присутствии ПКС и пептида в концентрациях. 10'8, 10'9, Ю'10 моль/л. В качестве положительного контроля использовали клетки, инкубированные в присутствии ФГА («ПанЭко», Россия). За 6 часов до окончания реакции в каждую лунку добавляли 3Н-тимидин («Изотоп», Россия) в концентрации 1 микроКюри на лунку. По окончании реакции клеточная взвесь переносилась на стекловолоконные фильтры. Высушенные в течение ночи фильтры переносили в сцинциляционные флаконы с 3 мл сцинциляционной жидкости и производили подсчет включения радиоактивной метки: в культуре со средой - спонтанная бласттранс-формация, с фитогемагглютинином - ФГА индуцированная бласттрансформация, с пеитидом - TGFßl-иидуциро-ванная бласттрансформация. Результаты выражали в импульсах в минуту (имп./мин) и в процентах от контроля -спонтанной бласттрансформации.

Обнаружено, что пептид EKNC(acm)C(acm)VR активно стимулирует пролиферацию иитактных клеток. Выраженность стимуляции пролиферации индивидуальна и колеблется от 112 до 363%. Величина стимуляции не зависит от степени исходной активации лимфоцитов при этих концентрациях пептида. Отсутствие дозозависимого эффекта при этих концентрациях пептида вполне согласуется с чрезвычайно низкими, пикомолярными, физиологическими концентрациями TGFßl в организме. Пептид LDTNYC (асш) также достоверно стимулировал пролиферацию в примененных концентрациях, но с несколько менее выраженным эффектом.

Представляет интерес дальнейшее изучение иммунобиологических свойств данных пептидов, в том числе на экспериментальных моделях иммунодефицитных процессов.

КАРТА СТРУКТУРЫ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА ЧЕЛОВЕКА (АФП) И ЕГО ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНОСТЬ КАК ИММУНОМОДУЛЯТОРА

Татаринов Ю.С.. Терентьев A.A.,

Молдогазиева Н.Т., Тагирова А.К.,

Казимирская В.А., Пугачева О.Г.

Российский государственный медицинский университет, Москва, Россия

Альфа-фетопротеин (АФП) является основным сывороточным белком, характерным для эмбрионального периода развития всех представителей класса млекопитающих, и достаточно хорошо изученным опухолевым маркером. Интенсивно изучается иммунорегуляторная роль АФП. Показано, что АФП способен эффективно взаимодействовать с макрофагами и лимфоцитами и оказывает иммуносупрессивное действие на пролиферирующие лимфоциты. Предполагается также, что а-фетопротеин принимает участие в регуляции процессов размножения и дифференцировки клеток. Для объяснения полифункпионального действия АФП важно не только иметь представление о структуре этого белка, но и знать, какие участки структуры АФП ответственны за то или иное биологическое действие. Современное состояние биоинформатики позволяет провести картирование структурно-функциональных участков в молекуле АФП. Методами биоинформатики с использованием международных баз данных проведено сравнение первичной структуры АФП человека (SW1SS-PRON 02771) с первичными структурами ряда факторов роста, цитокинов, онкофетальных, фетоплацентарных и других биологически активных белков с целью выявления и определения положения структурно функциональных участков в полипептидной цепи АФП.

По химической структуре АФП является гликопротеином, содержащим около 4% углеводов. АФП как продукт трансляции содержит 609 аминокислотных остатков (ао). В результате процессинга удаляется сигнальный пептид (18 ао) и в состав зрелой молекулы АФП человека входит 591 ао. Полипептидная цепь АФП содержит 32 остатка цистеина, которые образуют 15 дисульфидных связей, и один участок N (233) гликозилирования. Для АФП характерна свойственная всем представителям семейства альбумина пространственная организация, представленная тремя гомологичными доменами (I-III), каждый из которых состоит из двух глобулярных субдоменов (IA, IB, IIA, IIB, IIIA, IIIB), сшитых межепиральными дисульфидными связями. Подобная пространственная структура обеспечивает возможность существования различных конформационных вариантов белка в зависимости от вида междоменных связей, что имеет важное функциональное значение. В первом домене локализованы: циклии-связывающий мотив (RTLHR) АФП 1-5 (Терентьев A.A., 2004), сходная с активными сайтами факторов роста последовательность (14-20) LDSYQCT (Терентьев A.A., 1997), клеточной адгезии мотив LRE (195-197), мотив с высоким содержанием пролина (111-129), кинетензин-подоб-пый сегмент IARRFIPFLY (148-156), билирубин-связываю-щий участок (136-148), выявляемый моноклональными антителами AFY6 эпитопиый участок CKAENAVE (175-182), сходный с TGFbl участок VPE (123-125). Во втором домене локализованы: участки с мотивами клеточной адгезии LDV

(242-244), RGD (253-255), DGEK (262-265), ILRVAK (352-356), сходный с TGFbl участок FSSGEKN (323-329), участок связывания полиненасыщенных жирных кислот (210-228), участок с высоким содержанием гистидина VAHVHEHC (244-251), циклин-связывающий мотив LNRFL (312-316), актин-связывающий участок DKGEEELQ (377-384), кинетензин-подобный участок YSRRHPQLA (340-348), сегмент пептида казеина молока GLF (399-401), билирубин-связывающий участок (261-277), сегмент высокой гомологии с альбумином (246-26 1). В третьем домене локализованы: сходные с TGFbl участки VIQ (386-388) и (445-447), ингибирующий эстрогензависимую пролиферацию участок (446-479), сегмент главного комплекса гистосовместимости GVALQTMKQ (524-532), мотивы гетсродиме-ризации, отвечающие за взаимодействие с цитоплазматическими рецепторами, факторами роста и факторами транскрипции (497-534 и 535-589), эстроген-связывающий участок (423-445), кинетензин-подобный участок LVKQKPQIT (538-546), сегмент высокой гомологии с альбумином (489-505), участвует в связывании рецептора АФП, и сегмент подобный активатору плазминогена (553-591), участвует в регуляции роста трансформированных клеток.

Выявление биоактивных сайтов в структуре АФП важно не только для теории, оно дает возможность синтезировать пептиды с заданной последовательностью и изучить их иммунобиологическую активность с дальнейшим возможным практическим использованием.

СТРУКТУРНЫЕ ПРЕДПОСЫЛКИ УЧАСТИЯ В РЕГУЛЯЦИИ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА СС-ФЕТОПРОТЕИНА (AFP) И ТРАНСФОРМИРУЮЩЕГО ФАКТОРА РОСТА (TGFß)

Терентьев A.A.

Российский государственный медицинский университет, Москва, Россия

Сравнительное изучение а-фетопротеина (AFP) и трансформирующего фактора роста (TGFßl) - полипептида, перспективного для терапевтического применения при ряде аутоимунных заболеваний, с целью выявления в них сходных последовательностей как биологически активных сайтов продемонстрировало определенное сходство свойств этих белков. Оба белка характеризуются выраженной полифункциональностью, проявляя ан-типролиферативную активность и иммуносупрессив-ность. В то же время они способны активировать пролиферацию некоторых тканей.

При сравнении аминокислотных последовательностей AFP (SwissProt: Р02771) и TGFßl (SwissProt: Р01137), не родственных и не гомологичных белков (зрелая, секретируе-мая молекула AFP содержит 591 аминокислотный остаток, а секретируемая молекула TGFßl - 112 аминокислотных остатков), обращает внимание определенное сходство строения этих молекул. Аминокислотный состав этих белков характеризуется значительным содержанием в них цистеина: в AFP

- 5,4%, в TGFßl - 8%. В структурах обоих белков наблюдается наличие сдвоенных цистеинов -СС- (характерное для ряда хемокинов). Эти дицистеины участвуют в образовании дисульфидных мостиков с другими остатками цистеинов, образуя своеобразный внутримолекулярный каркас в виде ди-цистиновых распорок. После внутриклеточной деградации этих белков их фрагменты, содержащие дицистеины, могут связывать N0 и Fe2+, депонировать их излишки или созда-

вать их внутриклеточный дефицит и таким образом влиять на регуляцию клеточного метаболизма. Последовательности 14-19 AFP (LDSYQC) и 2-7 TGF(31 (LDTNYC) различаются всего по двум аминокислотным остаткам и имеют в своих структурах остатки цистеина с —SH группами, которые могут участвовать как во внутримолекулярных, так и в меж-молекулярных взаимодействиях. Последовательность 14-19 AFP ранее (Terentiev А.А., 1997,1999, 2000) была выявлена как биоактивный сайт структуры AFP, сходные с ней участки характерны для ряда факторов роста и некоторых онко- и фетоплацентарных белков. Кроме того, в структуре TGFpi обнаружена еще одна сходная с ней последовательность LDTQYS с порядковыми номерами аминокислот 54-59. Выявлено также высокое сходство последовательностей 323-329 AFP (FSSGEKN) и 8-14 TGFf31 (FSSTEKN). Обнаружено также сходство тринептидных участков 123-125 AFP (VPE) и 79-81 TGFPI (VPQ), 386-388 AFP (YIQ) и 21-23 TGFjM (YID), 445-447 AFP (QLS) и 99-101 TGF|31 (QLS).

Особый интерес вызывает выявление в первичных структурах AFP и TGFP структурного мотива RxL, свойственного для циклин-связывающих доменов Cip/Kip— белков, в частности белка р21. Данный участок Cip/Kip-белков гомологичен участкам белков семейства pRb: р107, р130, которые также содержат мотив RxL и участвуют в регуляции фосфорилирующей активности циклин-проте-инкиназных комплексов. Эти домены ответственны за взаимодействие указанных факторов с циклинами (Zhu et al., 1995; Vlach et al., 1997). В настоящее время считается, что Cip/Kip-белки являются мощными ингибиторами киназных комплексов: циклин Е- и циклин A-CDK2, отсутствие киназной активности которых приводит к нарушению фос-форилирования белка pRb и транскрипционных факторов семейства E2F: E2F1, E2F2, E2F3, и аресту клеток в G1 фазе митотического (клеточного) цикла. Циклин-связывающие мотивы представляют последовательности 18-20 TGF(31 (RQL), 18-20 и 25-28 TGFfS2 (RPL и KRDL), 9-11 и 18-20 TGF(33 (RNL и RPL), близки к ним последовательности 25-28 TGF(31 (RKQL) и 25-28 TGFP3 (RQDL). Циклин-связывающие мотивы как в прямом, так и в инвертированном виде представлены в AFP последовательностями 1-5 (RTLHR) и 312-316 (LNRFL). Наличие подобных участков в AFP и TGFP способствует объяснению механизмов антипролиферативной активности этих белков.

Вышеуказанные находки представляют не только теоретический интерес для сравнительного анализа первичных структур различных белков и факторов роста с целью выяснения - насколько характерны для них и насколько функциональны в них подобные участки, но и для изучения в дальнейшем иммунобиологической активности синтетических пептидов, имеющих подобные аминокислотные последовательности.

ВЛИЯНИЕ СУПЕРНАТАНТОВ АКТИВИРОВАННЫХ НЕЙТРОФИЛОВ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ФАГОЦИТОВ НА РАЗЛИЧНЫХ ЭТАПАХ ВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ РЕАКЦИИ

Третьякова И.Е.. Долгушин И.И., Мезенцева Е.А.

Государственная медицинская академия, Челябинск, Россия

Целью настоящего исследования было изучение влияния супернатантов активированных нейтрофилов (нейтрофило-кинов) на функциональную активность нейтрофилов и мак-

рофагов на различных этапах асептического воспаления. Для реализации этой цели мышам линии СВА внутрибрюшинно вводили 3,0 мл мясо-пентонного бульона. Нейтрофилокины выделяли из нейтрофилов крови допоров после активации гранулоцитов частицами латекса с последующей фильтрацией через миллипоровые фильтры с диаметром пор 0,24 мкм. В эксперименте использовали 3 группы мышей: в первой -супернатанты активированных нейтрофилов вводили мышам внутрибрюшинно трехкратно с интервалом 24 часа в количестве 50 мкл/мышь сразу после инъекции мясо-пептогшого бульона; во второй - нейтрофилокины вводили в том же количестве через 24 часа после инъекции мясо-пептонного бульона; в третьей - введение нейтрофилокинов осуществляли через 72 часа после инъекции мясо-пептонного бульона. Оценку функциональной активности фагоцитов перитонеального экссудата проводили на 6 сутки асептического воспаления. Контролем служили интактные мыши и мыши, которым вводили только мясо-пептонный бульон.

Результаты исследования показали, что нейтрофилокины влияют па функциональную активность нейтрофилов и макрофагов (лизосомальную, фагоцитарную, НСТ-восстанавливающую) на всех этапах воспаления, но в большей степени стимулируют активность этих клеток на ранних этапах воспаления.

РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ РИНОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ У ЧЕЛОВЕКА

Файзулоев Е.Б.. Никонова A.A., Океании A.C., Борисенко A.C., Зверев В.В.

ГУ НИИ вирусных препаратов

им. О.Г. Анджапаридзе РАМН, Москва, Россия

Введение. Риновирусы (РВ) являются частой причиной ОРВИ у человека. До 50% всех случаев простудных заболеваний вызвано именно РВ. Если для основной части населения риновирусная инфекция не представляет большой опасности - исход ее, как правило, благоприятный, то у пациентов с предрасположенностью к астме РВ могут вызывать обострение аллергических воспалительных процессов. В связи с этим, разработка методов диагностики РВ инфекции представляет научно-практический интерес, в частности, как инструментов для изучения роли респираторных вирусов в развитии бронхиальной астмы.

Целью работы было разработать тест-систему для высокоспецифичного выявления РНК риновирусов человека в клинических образцах.

Материалы и методы. РВ человека 16 серотина, полученный от Др. Соминипой A.A. (НИИ гриппа РАМН, Санкт-Петербург), культивировали в диплоидных эмбриональных легочных клетках человека во вращающемся барабане. Внруспый материал титровали по ЦПД определением конечной точки, рассчитывая ТЦД50/мл по Риду-Мен-чу. Тотальную нуклеиновую кислоту для РТ-ПЦР выделяли из культуры клеток кислофенольным методом либо, используя коммерческий набор реактивов («Изоген», Россия). Для анализа нуклеотидных последовательностей были использованы компьютерные программы Vector NTI Advance 9.0.0 (InfoMax) и Omiga 2.0 (Oxford Molecular Ltd.).

Основные результаты. На основе анализа частичных последовательностей 5’-концевой нетранслируемой области генома (5’NTR) 111 серотипов и изолятов РВ человека было подобрано 6 нар праймеров для РТ-ПЦР (по три как

прямых, так и обратных) и 2 олигопуклеотидные последовательности для гибридизационных зондов на участке между праймерами. В препаративных количествах был накоплен вирусный материал РВ человека 16 серотипа. Из вирусного материала выделяли РНК и анализировали ее методом РТ-ПЦР, используя 6 подобранных праймеров (9 вариантов пар праймеров). В качестве отрицательного контроля использовали тотальную РНК, выделенную из неза-раженных клеток. Продуктами всех 9 реакций, проводимых с вирусной РНК, были ампликоны ожидаемой электрофоретической подвижности. Для наиболее перспективных пар праймеров была определена чувствительность выявления РВ РНК. Задача определения РНК риновирусов с помощью РТ-ПЦР усложняется тем, что 5’NTR является высококонсервативной областью для большинства представителей семейства Picornaviridae. Таким образом, наличие в изучаемой пробе некоторых энтеровирусов (полио-, коксаки- и эхо-вирусов) может приводить к ложноположительным результатам. Предполагается, что высокая специфичность теста должна обеспечиваться второй стадией анализа - гибридизацией продуктов РТ ПЦР с подобранными нерадиоактив-ио-меченными зондами, специфичным только риновирус-пой РНК, в 96-луночных планшетах.

Заключение. Разрабатываемая тест-система требует дальнейшего изучения с использованием широкого спектра лабораторных штаммов риновирусов и энтеровирусов человека, а также клинических образцов. Предполагается, что тест-система найдет применение в исследованиях, посвященных изучению роли риновирусов человека в развитии бронхиальной астмы.

ПЕРМИССИВНАЯ РОЛЬ ПРОЛАКТИНА В ИММУНОРЕГУЛЯЦИИ

Фомичева Е.Е., Немирович-Данченко Е.А.

НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург, Россия

Вопрос о реальной роли пролактина в регуляции функций иммунной системы является дискуссионным. По мнению одних авторов, пролактин стимулирует реакции клеточного и гуморального иммунитета (Berzi et al. 1990,2003), увеличивает фагоцитарную активность и хемотаксис макрофагов (Ortega et al., 1997), усиливает IL-

2 индуцированную пролиферацию Т-лимфоцитов и экспрессию рецептора IL-2, синтез ДНК в лимфоцитах и повышает активность Т-лимфоцитов-киллеров (Matera, 1996,Ben-Johnatan et al. 1997, Chikanza, 1999, Stefaneanu, 2001). По мнению других - действительная роль пролактина в функциях иммунной системы не доказана, т.к. в экспериментах на мышах, нокаутных к рецептору пролактина, не выявлены нарушения функций иммунной системы (Goffin et al.1998,2002, Bouchard et al.1999, Dorshkind, Horesman, 2000). В то же время пролактин рассматривается как признанный иммуномодулятор, препятствующий развитию иммуносупрессии и апоп-тоза лимфоцитов. При этом иммуномодулирующие эффекты пролактина обеспечиваются не только наличием рецепторов к пролактииу на всех типах иммунокомпетен-тных клеток, но и взаимодействием пролактина с другими иммуномодуляторами, такими как глюкокортикоид-ные гормоны (ГК) и IL-1, индуцирующими формирование защитных реакций организма (Besedovsky et al. 1996, Корнева,Рыбакина,2002). Однако значение этого взаимо-

действия для проявления иммунопротективного действия пролактина при стрессе недостаточно изучено.

Целью работы было исследование возможности функционального взаимодействия пролактина с ГК гормонами и IL-1 при стрессе. Для этого прослеживали влияние пролактина на продукцию лимфоцит-активирующих факторов (ЛАФ) перитонеальными макрофагами и пролиферативную активность лимфоцитов периферической крови крыс Wistar при стрессе.

Пролактин (Sigma) вводили в/бр в дозах 5,25,40 нг/100 г веса за 20 мин до холодового стресса в камере (-20°С, 20 мин). По окончании стрессорного воздействия животных декапитировали и собирали: перитонеальные макрофаги из брюшной полости для тестирования продукции ими иммуномодулирующих цитокинов в составе ЛАФ (IL-1, IL-6, TNF-a) и лимфоциты периферической крови из брюшной аорты для оценки их пролиферативной активности. Показано, что введение пролактина нестрессированным животным вызывало спонтанную продукцию ЛАФ, которая увеличивалась в 2 раза при дополнительной стимуляции макрофагов ЛПС in vitro. Предварительное введение пролактина за 20 мин до стресса усиливало освобождение ЛАФ у стрессированных животных в 1,5-2 раза по сравнению с этим показателем, зарегистрированным в случае применения только стрессорного воздействия. Таким образом, системное введение пролактина повышает функциональную активность перитонеальных макрофагов и продукцию ими иммуномодулирующих цитокинов, в том числе IL-1.

Лимфоциты периферической крови животных отвечают реакцией бласттрансформации (РБТЛ) на действие IL-1 в присутствии субоптимальной дозы лектинов - в этом проявляется комитогенный эффект IL-1 , который позволяет оценить пролиферативную активность лимфоцитов. Внутрибрюшинное введение пролактина не изменяло интенсивности РБТЛ на действие нативного IL-1 (nIL-1 ) в сравнении с этим показателем у интактных животных. Лимфоциты периферической крови крыс, подвергнутых холодовому стрессу, взятые через 10 мин после окончания стрессорного воздействия, не отвечали реакцией бласттрансформации на действие hIL-1 . Введение пролактина, причем только в дозе 40 нг/100 г веса, за 20 мин до аппликации стресса, предотвращало угнетение пролиферативной активности лимфоцитов. Таким образом, в условиях стрессорного воздействия пролактин повышает чувствительность лимфоцитов к комитогенному действию IL-1 и препятствует стрессиндуцированному угнетению пролиферативной активности лимфоцитов.

Полученные результаты позволили заключить, что системное введение пролактина стимулирует продукцию иммуномодулирующих цитокинов в составе ЛАФ, важнейшим из которых является IL-1 (Dinarello, 1991). Пролактин усиливает освобождение IL-1 не только макрофагами (Kumar et al.1997), но и другими клеточными системами организма (De Vito et al.1997). IL-1, как известно, является эндогенным биорегулятором, оказывающим нормализующее действие на нарушенные функции иммунной системы при стрессе (Корнева,Рыбакина,2002). При этом, в условиях целостного организма для проявления регуляторных влияний IL-1 на иммунологические процессы пролактин оказывает пермиссивное действие. По-видимому, усиление пролактином синтеза и освобождения IL-1 и обеспечение его биологических эффектов при стрессе7 может рассматриваться как один из механизмов иммунопротективного действия пролактина.

Поддержано грантом РФФИ № 03-04-49236

ИЗМЕНЕНИЕ ГОМЕОСТАЗА ИОНОВ КАЛЬЦИЯ В Т-РЕГУЛЯТОРНОЙ ПОПУЛЯЦИИ CD4+ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Хайдуков С.В.. Литвинов И.С.

Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и ЮЛ. Овчинникова РАН, Москва, Россия

Популяция CD4+CD25+ Т-клеток периферической крови человека (ПКЧ) гетерогепна по функциональным свойствам и фенотипическим признакам. Она включает в себя пролиферирующие CD4+CD45RA+CD45R0+CD25low Т-лимфоциты и CD4+CD45R0+CD25h,gh Т-регуляторные клетки. Существуют ли взаимные переходы между CD4+CD25l,lgh и CD4+CD25low популяциями, до сих пор остается неизвестным. Идентификацию этих клеток принято проводить по совокупности количественных параметров экспрессии молекул CD38, CD62L, CD95 и HLA-DR, которые и были использованы для ai 1ализа лимфоцитов в составах ПКЧ и иономицин-резистентной (ИР) фракции клеток.

Обе субпопуляции CD4+CD25+ Т-лимфоцитов проявляют неодинаковую чувствительность к действию иономи-цина. В ИР-фракции значительно возрастает доля CD4+CD25high Т -клеток, по сравнению с кровью того же донора, а содержание CD4+CD25low Т-лимфоцитов - уменьшается. Следовательно, большинство CD4+CD25lllgl' Т-лим-фоцитов представлено резистентными к действию иономи-цина клетками. В сравнении с CD4+CD25hlgh Т-лимфоци-тами ПКЧ, ИР-нопуляция всегда обогащена в той или иной мере клетками с высоким уровнем экспрессии молекул HLA-DR, CD95 и CD38 (возрастание MEAN с 11,7 до 20,0, с 3,2 до 5,0 и с 2,7 до 3,4, соответственно). Одновременно, ИР CD4+CD25hlgh Т-лимфоциты характеризуются меньшей долей CD62L+ клеток и заметным снижением уровня экспрессии этих молекул (падение MEAN с 4,4 до 3,5). Следовательно, часть популяции CD4+CD25hlgh Т-клеток в составе ПКЧ, на которых отсутствуют молекулы HLA-DR, CD95 и CD38, но высоко экспрессированы CD62L, является чувствительной к действию иономицина.

Полученные данные свидетельствуют об отличии Т-регуляторной популяции клеток от наивных предшественников измененных системой гомеостаза ионов кальция. Данные свойства Т-регуляторных клеток ПКЧ обнаружены впервые.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований, проект

03-04-48190.

АКТИВНОСТЬ ЦТЛ, ИНДУЦИРОВАННЫХ С ПОМОЩЬЮ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК, НАГРУЖЕННЫХ ПЕПТИДАМИ ПРОСТАТСПЕЦИФИЧЕСКОГО МЕМБРАННОГО АНТИГЕНА ИЛИ ЛИЗАТОМ ЛИНИИ LNCAP

Хомякова A.B.*. Москалева Е.Ю., Корженевский Д.А., Коростолев С.А., Северин C.E., Северин Е.С.

НИИ молекулярной медицины ММ А имени И.М.Сеченова, Москва, Россия; Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения, Москва, Россия

Введение. Иммунотерапия рака предстательной железы (ПЖ), основанная на индукции опухолеспецифи-

ТАБЛИЦА. ЦТА ЛИМФОЦИТОВ, ИНДУЦИРОВАННЫХ ДК, НАГРУЖЕННЫМИ Н1А-А2-РЕСТРИКТИР0ВАННЫМИ ПЕПТИДАМИ И ЛИЗАТОМ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК В ОТНОШЕНИИ КЛЕТОК ЛИНИИ ШСАР

Соотношение Пептиды ПСМА Лизат LNCaP

мишень:эффектор Д^псмм Д^ПСШИ Д^ПСМИЇ ДК». ДКщСаР

1:40 18 0 28 25 СО со

1:20 16 0 19 14 24

1:10 0 0 7 11 19

ческих ЦТЛ с использованием ДК, рассматривается в настоящее время как новый перспективный неинвазивный метод лечения. Перспективнным опухолеспецифическим антигеном при этой нозологии может быть простат -специфический мембранный антиген (ПСМА), т.к. его экспрессия повышена при раке ПЖ, в том числе в низкодифференцированных, метастазирующих и гормопо-резистентных клетках. Целью работы явилось сравнение эффективности ЦТЛ, индуцированных ДК, нагруженными различными пептидами ПСМА, в отношении клеток рака ПЖ линии ЕМСаР, исследование возможности использования смеси пептидов при нагрузке ДК и сравнение эффективности простатслецифических ЦТЛ, индуцированных ДК, нагруженными НЬА-А2-рсстриктиро-ванными пептидами ПСМА и лизатом клеток линии ЬЫСаР.

Материалы и методы. В работе использовали НЕА-А2-рестриктированные пептиды: ПСМА4

аЬНЕТБЗАУ), ПСМА7и (АЬРБ1Е8КУ), ПСМА27 (УЬАССРЕЕЕ), а также лизат, полученный из клеток линии рака простаты ЬЫСаР. ДК выделяли из моноцитов периферической крови здоровых доноров. ГМ-КСФ и 1Ь-4 вносили в день 1, 3 и 5. В день 6 для индукции созревания ДК добавляли лейкинферон, ТОТ-а, ПГЕ2 и ЛПС. Для нагрузки лизатами ДК собирали в день 6 и инкубировали с экстрактом клеток Ь1ЧСаР (70 мкг/мл по белку), в течение 12 часов, затем вносили факторы созревания. Нагрузку пептидами проводили, инкубируя зрелые ДК с соответствующими пептидами (30 мкг/мл), а также с их смесью. Для индукции ЦТЛ ДК инкубировали с аутологическими лимфоцитами в соотношении 1:10. ЦТА лимфоцитов, распознающих опухолеспецифические пептиды, определяли с использованием НЬА-А2 клеток Т-В-клеточной гибридомы линии Т2, нагруженных соответствующим пептидом, и карциномы ПЖ линии ЬЫСаР, экспрессирующей ПСМА. ЦТА лимфоцитов, полученных с помощью ДК, нагруженных лизатами, исследовали в отношении линии ЬЫСаР.

Результаты. ЦТА лимфоцитов, специфических в отношении ГГ2-ПСМА4 Т2-ПСМА7п и Т2-ПСМА27, составляла 33, 29 и 47% соответственно при соотношении мишень-эффектор 1:20 (ЦТА контрольных лимфоцитов составляла 15%). ЦТА тех же ЦТЛ, а также лимфоцитов, индуцированных Д К, нагруженными лизатом опухолевых клеток в отношении линии Ц\[СаР, представлена в таблице.

Таким образом, использование как НЬА-А2 рестрик-тированных пептидов, так и лизата опухолевых клеток позволяет индуцировать специфический иммунный ответ в отношении клеток линии П^СаР. Лизаты вызывают более эффективный иммунный ответ. Из трех исследованных НЬА-А2-рестриктированных пептидов

ПСМА, только два позволяли индуцировать ЦТЛ, способные распознавать ПСМА в опухолевых клетках. Использование смеси пептидов ПСМА4, ПСМА711 и ПСМА27 позволяет индуцировать активные в отношении LNCaP ЦТЛ.

Заключение. Нагрузка ДК НЬА-А2-рестриктирован-ными пептидами ПСМА4 и ПСМА27, или смесью пептидов, позволяет индуцировать ЦТЛ, способные лизировать клетки рака ПЖ линии LNCaP. Использование лизата опухолевых клеток для нагрузки ДК позволяет индуцировать опухолеспецифические ЦТЛ с более высокой ЦТА, чем использование пептидов.

ВЛИЯНИЕ МИЕЛОПЕПТИДОВ НА АНТИГЕНПРЕДСТАВЛЯЮЩУЮ СПОСОБНОСТЬ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Хомякова A.B.-1. Москалева Е.Ю. \ Корженевский Д.А1, Фонина Л.А.2,

Михайлова A.A. , Северин С.Е.1, Северин Е.С.1

Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения; Институт биоорганической2химии им. ЮЛ. Овчинникова и М.М. Шемякина , Москва, Россия

Введение. Миелопептиды (МП) представляют собой группу регуляторных пептидов костного мозга. Для некоторых из них расшифрована первичная структура и имеется возможность получения в виде синтетических продуктов. Известные данные об иммунорегуляторной активности МП-1 и МП-4 и о способности МП-3 стимулировать антигенпредставляющую способность (АПС) макрофагов позволили предположить, что объектом регулирующего действия МП могут оказаться и дендритные клетки (ДК), предшественники которых образуются в костном мозге. Одной из важнейших функций ДК является захват и представление антигенов Т-лимфоцитам. Первый процесс наиболее активно осуществляется незрелыми ДК, в то время как для полноценного представления антигенов ДК должны быть полностью зрелыми. Жизнеспособность незрелых ДК in vitro зависит от ряда цитокинов, в частности от ГМ-КСФ и IL-4, и отсутствие этих факторов вызывает апоптоз ДК. В связи с этим, целью настоящей работы явилось изучение влияния МП-1, МП-2, МП-3 и МП-4 на АПС незрелых и зрелых ДК человека в смешанной культуре лимфоцитов и на жизнеспособность незрелых ДК, оцениваемую по уровню апоп-тоза ДК после исключения из ростовой среды цитокинов ГМ-КСФ и IL-4.

Материалы и методы. ДК получали из моноцитов периферической крови здоровых доноров, которые культи-

ТАБЛИЦА. ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ МИЕЛОПЕПТИДОВ (20 МКГ/МЛ) НА АПС ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК (* - Р<0,05)

МИЕЛОПЕПТИД АПС,%

Незрелые ДК Зрелые ДК

МП-1 (Phe-Leu-Gly-Phe-Pro-Thr) 152±1Г 125±7

МП-2 (Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp) 100±10 112+8

МП-3 (Leu-Val-Cvs-Tyr-Pro-Gln) 138 ±3* 109±3

МП-4 (Phe-Arg-Pro-Arg-Ile-Met-Thr-Pro) 130±30 111+14

Контроль 100±10 100+8

вировали в среде RPMI 1640 с 10% инактивированной фетальной сыворотки крупного рогатого скота (ПКС) в течение 5 дней с добавлением ГМ-КСФ и IL-4. В день 6 часть незрелых ДК собирали (ДКпезр), а к остальным добавляли факторы для индукции созревания ДК: лейкинферон и TNF-a. Спустя 2 дня собирали зрелые ДК (ДКзр). АПС ДК оценивали по уровню стимуляции пролиферации ал-логенных Т-лимфоцитов в смешанной культуре после инкубации в течение 2 часов с соответствующим МП (20 мкг/ мл). На 5 сутки вносили 3Н-тимидин и через 6 часов клетки собирали и оценивали интенсивность биосинтеза ДНК. Для определения влияния МП на жизнеспособность незрелых ДК их инкубировали в ПКС без цитокинов ГМ-КСФ и IL-4 в присутствии отдельных МП (20 мкг/мл) на протяжении 5 суток. Уровень апоптоза исследовали после инкубации ДК с флуоресцентным красителем Hoechst с помощью флуоресцентной микроскопии.

Результаты и обсуждение. Показано, что ДКзр отличались более высокой АПС при всех исследованных соотношениях ДК:лимфоциты. При соотношении ДК'.лим-фоциты, равном 1:40 (концентрация лимфоцитов 200 тыс/лунку), индекс стимуляции пролиферации лимфоцитов для ДКнезр и ДКзр составил 4,0 и 8,5 соответственно. Внесение МП в среду инкубации зрелых ДК практически не влияло на их АПС. В то же время МП-1 и МП-3 достоверно повышали АПС незрелых ДК. Полученные результаты при соотношении ДК:лимфоциты? равном 1:40 представлены в таблице.

При исследовании незрелых ДК после исключения из ростовой среды цитокинов ГМ-КСФ и IL-4 и дальнейшей инкубации в течение 5 суток, обнаружено, что большая часть ДК изменяла морфологию и прикреплялась к пластику. При этом уровень апоптоза ДК составлял 16%. Инкубация ДКнезр в присутствии МП-1, МП-2 и МП-3 снижала уровень апоптоза в1,8; 2,3 и 4 раза соответственно.

Заключение. Миелопептиды регулируют активность незрелых ДК: МП-1 и МП-3 повышают АПС незрелых ДК, а МП-1, МП-2 и МП-3 - их жизнеспособность.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ РЕАКЦИЙ, ВЫЗВАННЫХ БАКТЕРИЕЙ А.НУ01ЮРН1Ш МЫШЕЙ С57/ВІ.6 И ВАІ.В/С

Хомякова Т.И-.. Макарова О.В.1, Козловский Ю.Е.2, Хомяков Ю.Н.3

ГУ НИИ морфологии человека РАМН, Москва,

3 ГНУНИИПЗК им. В А. Афанасьева, пос. Удельное, МО, МНИИ медицинской экологии, Москва

Введение. Морфологические проявления воспалительных реакций, вызванных бактериальным агентом, определяются особенностями возбудителя и состоянием им-

мунной системы хозяина. Бактерия А.ку(1горЫ1а, широко распространенная в естественных условиях и включенная в список новых инфекций, имеющих тенденцию к распространению, характеризуется высокой степенью изменчивости в зависимости от факторов макро- и микроокружения. Морфологическое исследование органов и тканей теплокровных эукариотов, инфицированных Аеготопаз Иус1горкПа, до настоящего времени не проводилось.

Целью исследования было изучение морфологических изменений в органах у мышей линий С57/В16 и Ва1Ь/ с при подкожном инфицировании А.ку(1горЫ1а.

Материалы и методы. Использован штамм АМуйгорИИа 342-3, обладающий всеми характеристиками/!. куйгоркИа, но не проявляющий ДНК-азной активности.

В работе использованы половозрелые мыши-самцы массой 18-20 г. В контрольных и опытных группах было по 20 животных. Мышам контрольной группы вводили подкожно стерильный физиологический раствор. В эксперименте мышам обеих линий подкожно в области внутренней поверхности левого заднего бедра вводили 103 жмт бактерий, в течение 24 часов культивированных на плотной питательной среде (кровяной агар) и суспендированных в стерильном апирогенном физиологическом растворе. На 3-и и 7-е сутки мышей опытных и контрольных групп эвтаназировали смещением шейных позвонков. Специфичность развившегося воспаления подтверждали высевом из внутренних органов (печени, селезенки, крови из сердца) на кровяной агар. Для исследования проводили забор крови и внутренних органов опытных и контрольных животных: кожи в месте введения, печени, легких, аксиллярных лимфатических узлов. В крови определяли абсолютное количество лейкоцитов в 1 мкл.

Результаты. У мышей Ва1Ь/с опытной группы на 3-и сутки отмечено достоверное увеличение количества лейкоцитов по сравнению с контролем. На 7-е сутки содержание лейкоцитов у мышей Ва1Ь/с опытной группы оставалось повышенным. У мышей С57/В16 опытной группы на 3-и сутки было отмечено более резкое повышение количества лейкоцитов по сравнению с контрольной группой и инфицированными мышами Ва1Ь/с. На 7-е сутки количество лейкоцитов у инфицированных мышей С57/В16 было достоверно выше по сравнению как с контрольной группой, так и со значением этого показателя у мышей Ва1Ь/с опытной группы.

В гистологических срезах кожи в месте введения у инфицированных мышей обеих линий выявлен очаг гнойного воспаления В лимфатических узлах животных обеих линий отмечалась картина реактивного лимфаденита с гиперплазией по смешанному типу. В легких инфицированных мышей С57/В16 и Ва1Ь/с на 3-и и 7-е сутки были обнаружены очаги интерстициальной пневмонии. При заражении бактерией А.куйгоркИа в гистологических срезах печени у мышей С57/В16 на 3-и и 7-е сутки после подкожного введения А.1гу(1горЫ1а выявлена морфологическая картина гранулематозного гепатита. На фоне мезен-

химально-воспалителыюй реакции и очаговых некрозов определялось большое количество гранулем, состоящих из макрофагов или макрофагов с примесыо нейтрофилов. У мышей Ва1Ь/с при подкожном заражении бактерией А.!гу(1горЫ1а в гистологических срезах печени на 3-и и 7-е сутки определялась умеренно выраженная мезенхималь-но-воспалительная реакция.

Заключение. Бактерия АеготопавкуЛ-орИИа 342-3 при подкожном введении вызывает у мышей С57/В16 и Ва1Ь/ с воспалительную реакцию в коже, лимфатических узлах, легких, печени. У мышей С57/В16 развивается острый гранулематозный гепатит. Воспалительный процесс у мышей сравниваемых линий сопровождается увеличением числа лейкоцитов в крови, причем оно более выражено у мышей С57/В16.

ЭФФЕКТЫ ЭРИТРОПОЭТИНА

ПРИ ТРАВМЕ СПИННОГО МОЗГА У КРЫС

Цыган Н.В.

Военно-медицинская академия,

Санкт-Петербург, Россия

Введение. В настоящее время травма спинного мозга играет значительную роль в жизни современного общества. Высокий риск развития пожизненной нетрудоспособности, необходимость ухода за больным в течение десятилетий, высокая стоимость лечения таких пациентов и низкая частота восстановления функций определяют актуальность разработки новых подходов к лечению травмы спинного мозга. Цитокин эритропоэтин обладает нейропротек-тивными свойствами при травме спинного мозга.

Цель исследования. Оценить влияние эритропоэти-на на последствия травмы спинного мозга у крыс.

Материалы и методы. Двадцати четырем взрослым крысам-самцам проводилась компрессия позвоночника с силой 20 Н в течение 30 с на уровне Ы-Ь2, сорока восьми

- па уровне Ь3-Ь4. Животные были разделены на 5 групп: иптактиые крысы (8 животных); крысы, которым вводился хлорид натрия (0,9%, 0,5 мл) виутрибрюшинно через 10 мин после нанесения травмы па уровне 1Л-Ь2 (8 животных); крысы, которым вводился эритропоэтин (5000 ЕД/ кг) внутрибрюшинно через 10 мин после травмы на уровне Ь1-Ь2 (8 животных); крысы, которым вводился хлорид натрия (0,9%, 0,5 мл) внутрибрюшинно через 10 мин после нанесения травмы на уровне Ь3-Ь4 (20 животных); крысы, которым вводился эритропоэтин (5000 ЕД/кг) внутрибрюшинно через 10 мин после травмы на уровне ЕЗ-Е4 (20 животных). Ежедневное неврологическое тестирование крыс всех групп включало оценку тонуса задних конечностей и хвоста, болевой чувствительности нижней половины туловища, болевого рефлекса сгибания задних конечностей, болевого рефлекса отдергивания хвоста. Результаты неврологического тестирования оценивались по балльной системе. Поведенческие реакции крыс изучали до травмы и на 1, 7, 14, 21 сут. после травмы в тестах «открытое поле» и «приподнятый крестообразный лабиринт».

Основные результаты. В течение 21 сут. после травмы выжили все интактные крысы. При нанесении травмы на уровне Ы-Е2 летальность составила 100%; максимальная продолжительность жизни крыс после травмы спинного мозга составила 6 сут. После травмы на уровне Ь1-Ь2 продолжительность жизни крыс, получавших эритропоэтин (4,63± 1,69 сут.), была достоверно (р<0,05) выше, чем у крыс, получавших хлорид натрия (2,75± 1,28 сут.).

В течение 21 суток после травмы у интактных крыс определялось сохранение исследовавшихся неврологических показателей в норме. С 11 -х по 16-е сут. после травмы на уровне L3-L4 суммарный тонус задних конечностей и хвоста у крыс, получавших эритропоэтин, был достоверно (р<0,05) выше, чем у крыс, получавших хлорид натрия. Срок 50%-ного восстановления суммарного тонуса задних конечностей и хвоста после травмы на уровне L3-L4 был достоверно (р<0,025) ниже у крыс, которые получали эритропоэтин.

У всех животных, получивших травму спинного мозга, поведение в «открытом поле» на 1,7,14, 21 сут. после нанесения травмы характеризовалось резким снижением двигательной и исследовательской активности по сравнению с поведением крыс до нанесения травмы. Вертикальная двигательная активность полностью отсутствовала. Активность проявлялась лишь в первые 20-30 с после помещения крыс в «открытое поле». Затем наблюдали замирание без дальнейшего изменения позы животного, что сопровождалось ограниченным количеством болюсов дефекаций (до 4).

У всех животных, получивших травму спинного мозга, при тестировании в «приподнятом крестообразном лабиринте» на 1, 7,14, 21 сут. после нанесения травмы помещение в освещенный центр перекреста лабиринта не инициировало передвижение и исследование рукавов лабиринта. Позу животных квалифицировали как застывание на месте без изменения положения тела в пространстве.

Заключение. Полученные данные свидетельствуют о том, что эритропоэтин увеличивает продолжительность жизни, не влияет достоверно па динамику поведенческих реакций, а также повышает степень и скорость неврологического восстановления после травмы спинного мозга у крыс.

ВЛИЯНИЕ ПР0ТИВ0ЛЕЙК03НЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ НА ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТОК ХРОНИЧЕСКОГО МИЕЛОИДНОГО ЛЕЙКОЗА К МОНОНУКЛЕАРНЫМ КЛЕТКАМ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Черепович B.C.. Шахлевич Е.В., Антоненко Е.В., Лоткова Е.С., Гринев В.В.

Белорусский государственный университет,

Минск, Беларусь

Согласно современным представлениям, комбинированная химиоиммунотерапия могла бы повысить эффективность терапевтических мероприятий при хроническом миелоидиом лейкозе (ХМЛ) человека. Одиако для ее успешного проведения необходимы исчерпывающие данные о возможном влиянии противолейкозных лекарственных препаратов па чувствительность клеток ХМЛ к цитотоксическим лимфоцитам человека. Кроме того, необходимо экспериментальное обоснование возможности преодоления лекарственной резистентности лейкозных клеток с помощью цитотоксических лимфоцитов.

В связи с этим целью настоящей работы было экспериментальное обоснование синергизма действия цитотоксических лимфоцитов человека и противолейкозных лекарственных препаратов N-гидроксикарбамида, бусуль-фана и цитарабина на клетки ХМЛ. Источником цитотоксических лимфоцитов служили мононуклеарные клетки периферической крови (МПК) здоровых доноров; в качестве модельных лейкозных клеток использовались клетки линии К562 эритробластного криза ХМЛ. Специфическая гибель лейкозных клеток, обусловленная действием МПК, бусульфана и цитарабина, оценивалась с

помощью оптимизированного МТТ теста, а Ы-гидрокси-карбамида - с помощью теста на исключение тринаново-го синего.

Определение специфической гибели клеток линии К562 под влиянием М-гидроксикарбамида показало, что его цито-токсический эффект имеет дозо- и время-зависимый характер и может быть описан стандартной фармакологической функцией у=Л1+(Л2-Л1)/(1-Ю(<1'ой(х0>'х)р)). Минимальной эффективной концентрацией препарата является концентрация 1 мкг/мл, выход на плато наблюдается при 100 мкг/ мл, а ЬБ50 при 96-часовом культивировании лейкозных клеток с цитостатиком составляет 5,201 мкг/мл. Схожий по динамике цитотоксический эффект на лейкозные клетки оказывает и цитарабин, однако ЬО50 для него при 96-часовом культивировании составляет

0,414 мкг/мл. Бусульфан же, в отличие от М-гидроксикарбамида и цитарабина, оказывает слабое дозо- и время-зависи-мое цитотоксическое действие на лейкозные клетки: в рамках выбранного диапазона концентраций (от 0,001 мкг/мл до 100 мкг/мл) этот препарат даже при 96-часовом культивировании не вызывает 50%-ной гибели клеток линии К562.

Совместное культивирование па протяжении 18 часов клеток линии К562 с МПК при оптимальном соотношении 1:20 приводит к 35,3±11,0%-ной специфической гибели лейкозных клеток. Экспериментальным путем нами было обнаружено, что частота МПК-индуцирован-ной специфической гибели клеток линии К562 может быть увеличена до 77,1 ± 14,5 и 86,7±13,3% (Р<0,05) путем 24-часового прекультивирования лейкозных клеток с М-гидроксикарбамидом и бусульфаном соответственно. При этом модулирующий эффект лекарственных препаратов на чувствительность клеток линии К562 к МПК имеет нелинейный характер и наблюдается при всех выбранных концентрациях - от 0,001 до 1000 мкг/мл. Цитарабин же такого синергизма цитотоксического действия с МПК на лейкозные клетки не проявляет.

С помощью нелинейного регрессионного анализа нами установлено, что синергизм цитотоксического действия М-гидроксикарбамида с МПК на лейкозные клетки носит трехфазный характер с максимумами при концентрациях 0,001 мкг/мл; 0,176 мкг/мл и 82,64 мкг/мл. Интересно отметить, что только один из максимумов -100 мкг/мл, - укладывается в диапазон клинически достижимых концентраций лекарственного препарата в плазме крови больных, а два других - нет (Стах для М-гидро-ксикарбамида варьирует от 55 до 139,2 мкг/мл). Модулирующий эффект бусулъфана носит иной характер: он имеет только один максимум при концентрации 0,412 мкг/мл (при концентрациях ниже и выше указанной эффект снижается). Этот максимум соответствует нижней границе диапазона максимальных концентраций препарата, достигаемых в плазме крови больных (Стахдля бусульфана варьирует от 0,496 до 1,684 мкг/мл). Кроме того, он меньше равновесной концентрации препарата в плазме крови больных, которая равна 1,1-9,7 мкг/мл.

Таким образом, кратковременное (на протяжении 24 часов) прекультивирование лейкозных клеток линии К562 с токсичными и нетоксичными концентрациями противолейкозных лекарственных препаратов М-гидроксикарбамида и бусульфана (но не цитарабина) достоверно повышает их чувствительность к ци-тотоксическому эффекту МПК. При этом синергизм действия М-гидроксикарбамида с МПК носит трехфазный характер, а бусульфана - имеет только один максимум.

МОДЕЛЬ АЛЛЕРГИИ НА ГРИБ ASPERGILLUS FUMIGATUSY МЫШЕЙ, ХАРАКТЕРИЗУЮЩАЯСЯ ПРОДУКЦИЕЙ СПЕЦИФИЧЕСКОГО IGE

Шевченко М.А.. Алексеева Л.Г., Свирщевская Е.В.

Институт биоорганической химии им. Шемякина и Овчинникова, Москва, Россия

Одной из основных характеристик аллергических заболеваний у человека является повышенная продукция IgE. Однако в экспериментальных моделях вызвать формирование аллерген-специфического IgE зачастую не удается. Так в мышиной модели аллергии на гриб Aspergillus fumigatus (Af) в легких, сенсибилизированных экстрактом гриба мышей, наблюдается характерная картина воспаления с инфильтрацией эозинофила-ми, формированием бокаловидных клеток, фиброзом ткани и повышенным уровнем общего IgE при полном отсутствии Af-специфического IgE. Разработка протокола иммунизации мышей экстрактом Af, при которой будет наблюдаться продукция специфического IgG, позволит изучить механизм патогенеза аллергии на Af более детально. Целью работы была разработка мышиной модели аллергии на Af с повышенной продукцией специфического IgE. Поскольку известно, что интерлейкин-4 (IL-4) является ключевым цитокином, способствующим переключению В-клеток на синтез IgE, то основным методом индукции IgE явилось повышение уровня IL-4 за счет в/б инъекций. Мышей линии BALB/c иммунизировали п/к в адъюванте экстрактом Af. Далее часть мышей (гр.1) получила дополнительно 10 инъекций экстракта интраназально (и.н.); часть мышей (гр.2) получила 10 инъекций IL-4 в/б; часть мышей (гр.З) получила 10 инъекций экстракта Af и.н. и 10 инъекций IL-4 в/б. Группа 4 не получала дополнительных инъекций и явилась контролем. Продукцию IgG, общего и специфического к экстракту Af IgE, определяли твердофазным прямым иммуноферментным анализом. С целью подтвердить аллергический характер воспаления у мышей, получавших интраназальные инъекции, осуществляли забор легких для гистологического анализа. Основным субклассом IgG, формирующимся в ответ на введение экстракта гриба, во всех группах был IgG 1. Возрастание титра IgGl наблюдалось во всех группах мышей пропорционально дозе введенного аллергена. Повышение общего IgE наблюдали в группах с дополнительными и.н. инъекциями аллергена (гр.1 и 3), но не в группе с дополнительными инъекциями IL-4 (гр.2) или в контроле (гр.4). Продукция специфического IgE наблюдалась только в группе 3, получавшей экстракт аллергена и.н. на фоне повышенного уровня IL-4. Гистологический анализ легких показал похожую картину воспаления в легких мышей групп

1 и 3, характеризующуюся инфильтрацией легких ней-трофилами, лимфоцитами и редкими эозинофилами. Таким образом, для формирования аллерген-специфи-ческого IgE у мышей в ответ на экстракт аллергена важна локализация В-клеточного ответа в легких, что, по-видимому, способствует переключению В-клеток на синтез IgE in situ. Предложенная схема иммунизации может быть использована для индукции аллергического ответа с продукцией специфического IgE, вызванного различными аллергенами.

ВЛИЯНИЕ ХОРИОНИЧЕСКОГО ГОНАДОТРОПИНА НА ПРОДУКЦИЮ IL-6, G-CSF И IFN-a МОНОЦИТАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЖЕНЩИН Ширшев С.В.. Заморина С.А., Крапивина O.A.

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия

Известно, что моноциты активно инфильтрируют ткани репродуктивного тракта и опосредуют механизмы иммунного аборта, а также участвуют в процессах реконструкции ткани, требующейся для растущих экстраэмбриональ-ных тканей и эмбриона. Ряд своих функций они выполняют за счет секреции цитокинов, осуществляющих контроль иммунных реакций в маточно-плацентарной интерфазе.

В работе изучали эффекты основного гормона беременности, хорионического гонадотропина (ХГ) на продукцию IL-6, G-CSF и IFN-a моноцитами женщин. Объектом исследования служили фракционированные моноциты периферической крови женщин, находящихся в фолликулярной или лютеиновой фазе менструального цикла. Выделенные клетки проинкубировали с ХГ в дозах 10 и 100 МЕ/ мл в течение 60 мин при 37°С, затем стимулировали липо-полисахаридом (ЛПС, 100 нг/мл) и по истечении 24-часо-вой инкубации определяли уровень цитокинов в культуральной среде иммуноферментным методом.

Установлено, что ХГ не влиял на продукцию G-CSF моноцитами женщин, и этот эффект не зависел от того, в какую фазу менструального цикла они получены. ХГ повышал продукцию IL-6 моноцитами женщин только в фолликулярную фазу, не оказывая эффектов па синтез данного цитокина в лютеиновую фазу цикла. В то время как на продукцию IFN-a ХГ оказывал стимулирующее действие в зависимости от дозы и фазы менструального цикла. Так, в высокой дозе (100 ME/мл) ХГ достоверно повышал уровень IFN-a только в моноцитах фолликулярной фазы цикла, а в низкой дозе (10 МЕ/мл) - в моноцитах лютеиновой фазы.

Таким образом, уровень и соотношение женских половых стероидных гормонов определяют чувствительность клеток к ХГ при индукции синтеза цитокинов. Повышение уровня IL-

6 и IFN-a является одним из механизмов фетопротекции и способствует благополучному протеканию беременности.

ОЦЕНКА HER-2/NEU СТАТУСА ОПУХОЛЕЙ У БОЛЬНЫХ РАКОМ МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ AHTH-HER-2/NEU-MHHH-AHTHTELflA Эдельвейс Э.Ф.. Баландин Т.Г., Кузнецова Е.М., Степанова Е.В.*, Барышников А.Ю.*, Деев С.М.

Институт биоорганической химии

им. академиков М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова

РАН, Москва, Россия;

*Российский онкологический научный центр им.H.H.Блохина РАМН, Москва, Россия

Рак молочной железы (РМЖ) - одно из самых распространенных злокачественных заболеваний. У пациентов с РМЖ более чем в 30% случаев наблюдается гиперэкспрессия рецептора HER2/neu на раковых клетках. Целью настоящей работы явилась разработка иммуногистохимичес-кого метода оценки HER2/neu статуса опухолей у больных раком молочной железы с использованием анти-НЕ112/пеи-мини-антитела. Определение HER2/neu статуса опухоли помогает выявить пациентов, которым требуется специфическая терапия моноклональным анти-HER2/neu антителом Herceptin/Trastuzumab (Genentech,USA). Это рекомбинантное гуманизированное

антитело связывается с внеклеточным доменом HER2/neu, блокирует пролиферацию клеток, гиперэкспрессирующих HER2/neu, и индуцирует развитие аптителозависимой цитотоксичности. Ввиду его возможной кардиотоксичности назначать этот препарат следует только после проведения точной диагностики HER2/neu статуса опухоли. В диагностических лабораториях для проведения иммуногисто-химического анализа HER2/neu широко используется коммерческий набор HercepTest (DAKO.USA). Для HercepTest разработана шкала оценки клеток инвазивной карциномы по степени окрашивания мембран: от 0 до 3+.

Мы разработали новый метод оценки HER2/neu статуса опухоли, в котором коммерческие aiiTH-HER2/neu антитела заменены на рекомбинантное aHTH-HER2/neu-MHHH-anTHTe-ло. Оно состоит из одной молекулы aHTH-HER2/neu-MHHH-антитело-барназа-барназа и двух молекул anTH-HER2/neu-мипи-антитело-барстар. За счет нековалентного очень прочного взаимодействия барстара с барназой формируется трехвалентное антитело (гример), способное узнавать эпитоп внеклеточного домена HER2/neu и связываться с тремя молекулами рецептора на клеточной поверхности. Тример узнает тот же самый эпитоп ракового маркера HER2/neu, что и терапевтический агент Herceptin, и используется нами как первичное антитело при оценке статуса FIER2/neu. Вторичными антителами в данном тесте являются кроличьи поликлональные антитела, полученные в результате иммунизации кроликов белком тримером и специфически обогащенные с помощью аффинной хроматографии на колонке с иммобилизованным тримером. Третьим компонентом служат козьи анти-кроличьи поликлональные антитела, конъюгированные с нероксидазой хрена. Определение HER2/neu статуса опухолей провели иммуногистохимическим методом на парафиновых срезах больных РМЖ сначала с коммерческим набором HercepTest, а затем с разработанной нами системой. В случае каждого больного использовались два парафиновых среза одного и того же блока - опытный и контрольный. В отрицательном контроле вместо первичных антител срез инкубировали с буферным раствором.

В результате оценка HER2/neu статуса опухолей по шкале от 0 до 3+ с помощью анти- HER2/neu мини-анти-тела совпала с оценкой коммерческим тестом HercepTest. В отрицательных контролях отсутствует неспецифическое связывание как в случаях HercepTest анализа, так и в разработанном нами тесте. Процедура окрашивания парафиновых срезов с помощью aHTH-HER2/ncu мини-ан-титела соответствует стандартной иммуногистохимичес-кой процедуре и не требует дополнительных реактивов и оборудования. Данная методика достаточно специфична, легко и быстро выполнима, и может быть рекомендована для использования в диагностических лабораториях.

Работа поддержана грантом РФФИ и грантом Московского Комитета по Науке и Технике.

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ ЦИТОКИНОВ IL-18 И IL-18 СВЯЗЫВАЮЩЕГО ПРОТЕИНА И ИССЛЕДОВАНИЕ ИХ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ.

Якушенко Е.В.*. Лопатникова Ю.А.*, Храпов Е.А., Филипенко М.Л., Пустошилова Н.М.,

Закабунин А.И., Сенников С.В.*, Козлов В.А.*

*ГУ НИИ Клинической иммунологии СО РАМН, Новосибирск, Россия;

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН,

Новосибирск, Россия

Интерлейкин-18 (или IFN-гамма индуцирующий фактор) является провоспалительным цитокином, но струк-

туре и некоторым функциям этот цитокип схож с IL-1 и относится к его семейству. Основные эффекты IL-18 направлены на стимуляцию продукции таких цитокинов, как IFNy, TNFa, IL-lß, а также молекул адгезии и факторов стимулирующих апоптоз. На клеточном уровне основными мишенями для IL-18 являются иммупокомпе-тентные клетки и, в частности, Т хелперы 1 типа и НК-клетки. IL-18 сдвигает баланс клеток в сторону активации клеточного звена иммунного ответа. IL-18, с одной стороны, участвует в противоинфекционной и противоопухолевой защите организма, а с другой, в некоторых случаях является патогенетическим фактором формирования хронического воспаления (болезнь Крона, СКВ и др.). Природным антагонистом IL-18 является IL-18 связывающий протеин (1Ь-18СП), который способен нейтрализовать негативные эффекты IL-18. В связи с вышесказанным целью данной работы было получение рекомбинантных цитокинов IL-18 и 1Ь-18СП для получения в дальнейшем на их основе лекарственных препаратов. Продуцентами полученных цитокинов являются клетки E. Coli. При изучении биологической активности IL-18 было показано, что изучаемый белок стимулирует продукцию цитотоксической молекулы оксида азота N0, IFNy и TNFa мононуклеарами периферической крови человека, сдвигает баланс клеток с фенотипом CD4/CD8 в пользу последних и, кроме того, стимулирует реакцию гиперчувствительности замедленного типа у мышей. При исследовании его противоопухолевой активности использовалась мышиная перевиваемая клеточная линия меланома В16. Клетки В16 (200 тыс./мышь) вводили подкожно, IL-18 в дозах 1 и 5 мкг/мышь 1-, 2- и 3-кратно, начиная с 3 дня после переноса клеток В16 вводили в/в в хвостовую вену. В результате проведенных исследований показано, что рч1Ь-18 тормозит рост опухолевых клеток, причем наиболее эффективно в дозе 5 мкг/мышь 2 раза, продолжительность жизни экспериментальных животных максимально увеличивалась при двукратном введении 1мкг/мышь. При изучении биологической активности полученного IL-18Cn показано, что исследуемый белок нейтрализует стимулирующую активность pIL-18 в отношении продукции TNFa мононуклеарами периферической крови человека. Таким образом, получены рекомбинантные цитокины IL-18 и 1Ь-18СП, обладающие показанными для них ранее биологическими и специфическими эффектами. Авторы выражают признательность региональному общественному фонду содействия отечественной медицине за поддержку в проведении исследований.

АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ СПЛАЙСИНГ мРНК IL-4 И IL-6 В КЛЕТКАХ РАЗНЫХ ФЕТАЛЬНЫХ ТКАНЕЙ МЫШИ И ЧЕЛОВЕКА

Яценко О.П.. Силков А.Н., Филипенко М.Л.*, Храпов Е.А.*,Воронина Е.Н.*,Козлов В.А., Сенников С.В.

ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН*, Новосибирск, Россия

Известно, что посредством механизмов альтернативного сплайсинга генов цитокинов может происхо-

дить тканесиецифическая экспрессия изоформ медиаторов в разных тканях в онтогенезе. В наших исследованиях было впервые показано, что в клетках селезенки и костного мозга мышей экспрессируются альтернативные варианты мРНК 1Ь-4 и 1Ь-6. В частности ген 1Ь-4 экспрессируется в виде двух изоформ мРНК; полноразмерной и со сплайсированных вторым экзоном (мРНК 1Ь-4Д2), а ген 1Ь-6 экспрессируется в виде трех изоформ мРЕ1К: полноразмерной формы мРНК 1Ь-6 и альтернативно-сплайсирован-ных по 3 и 5 экзонам, соответственно мРНК 1Ь-6ДЗ и мРНК 1Ь-6Д5. Показано, что экспрессия мРНК 1Ь-6Д5 имеет видоспецифический характер, в то время как экспрессия мРНК 1Е-6ДЗ потенциально может быть найдена и у других видов, включая человека. Нуклеотидная последовательность изоформ мРНК 1Е-4 и 1Ь-6 мышей подтверждена секвенированием. При количественном изучении экспрессии мРНК изоформ 1Е-4 и 1Е-6 в разных клетках фетальных и взрослых тканей (селезенка, тимус, печень, легкое, мышцы, кишечник, костный мозг, головной мозг) мышей было установлено, что альтернативные варианты экспрессируются как минорные и не превалируют над полноразмерными формами. При изучении альтернативного сплайсинга мРНК 1Ь-4 и 1Ь-6 в клетках человека нами получены более интересные данные. Нами подтверждены ранее известные факты, что ген 1Ь-4 экспрессируется в виде двух изоформ мРНК; полноразмерной и альтернативно-сплайсиро-ванной по 2 экзону (мРНК 1Ь-4Д2), а ген 1Е-6 экспрессируется в виде трех изоформ мРНК: полноразмерной формы мРНК 11^-6 и альтернативно-снлайси-рованных по 2 и по 2 и 4 экзонам, соответственно мРНК 1Ь-6Д2 и мРНК 1Ь-6Д2,4. При изучении экспрессии мРНК изоформ 1Ь-4 и 1Ь-6 в разных фетальных тканях человека (селезенка, тимус, печень, кожа, сердечная и скелетная мышцы) было установлено, что экспрессия их носит тканеспецифический характер. Для 1Е-4 показано, что в спленоцитах и тимоци-тах превалируют мРНК 1Ь-4Д2, а в клетках кожи и сердечной мышцы мРНК 1Ь-4Д2 является доминантной. Для 1Е-6 также показано, что в тимоцитах и спленоцитах превалирует мРНК IЬ-6 2, в то же время в клетках кожи экспрессии мРНК 1Е-6 не обнаружена. Таким образом, альтернативный сплайсинг мРНК 1Ь-

4 и 1Ь-6 в клетках человека носит тканеспецифический характер и, учитывая, что биологическая активность и функциональные свойства изоформ отличаются, то посредством этого механизма может происходить тонкая регуляция функциональной активности клеток в онтогенезе. Нужно отметить, что альтернативный сплайсинг поставляет для эволюции пластический материал, который в случае целесообразности может закрепляться в эволюционном ряду и приобретать самостоятельное значение. Так, на уровне грызунов определяются изоформы мРНК 1Ь-4 и 1Ь-

6, но они экспрессируются как минорные, и тканевой специфичности в экспрессии у них, в отличие от человека, нет. Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований. Проект №03-04-49397. Авторы выражают признательность региональному общественному фонду содействия отечественной медицине за поддержку в проведении исследований.