CC BY
16
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
ВЛИЯНИЕ МНОГОКРАТНОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ИММУННЫХ КЛЕТОК С ОПРЕДЕЛЕННЫМИ ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ ХАРАКТЕРИСТИКАМИ НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ ИММУННОЙ И НЕРВНОЙ СИСТЕМ РЕЦИПИЕНТОВ
Аникеева О.С., Маркова Е.В.
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт фундаментальной и клинической иммунологии», Новосибирск, Россия
Введение. Ранее нами был продемонстрирован феномен и механизмы направленной регуляции поведенческих реакций у половозрелых экспериментальных животных трансплантацией иммунных клеток с определенными функциональными характеристиками, а также возможность формирования определенного стереотипа поведения у половозрелых животных путем многократной трансплантации иммуноцитов, проведенной в юве-нальном периоде онтогенеза.
Цель. Исследование механизмов влияния многократной трансплантации иммунных клеток с определенными функциональными характеристиками на уровень основных регуляторных цитокинов в головном мозге и селезенке животных-реципиентов в сопоставлении с интенсивностью иммунного ответа и уровнем сформированного ориентировочно-исследовательского поведения.
Материалы и методы. Исследование выполнено на мышах-самцах (CBAxC57BL/6)F1 в количестве 280 особей, которым, начиная с 4-5-недельного возраста (животные-реципиенты), проводилась трехкратная внутривенная трансплантация спленоцитов от сингенных доноров 3-месячного возраста с оппозитными (активным и пассивным) типами ориентировочно-исследовательского поведения. Контрольной группе животных вводилась среда RPMI-1640 в аналогичных условиях эксперимента. У животных-реципиентов и мышей контрольной группы по достижении половозрелого возраста проводилось исследование поведения в тесте «открытое поле», определение содержания ряда регуляторных цитокинов в головном мозге и селезенке методом иммуноферментного анализа и определение интенсивности гуморального и клеточного иммунного ответа.
Результаты. Ранее нами было показано, что мыши-самцы CBAxC57BL/6)F1 с оппозитными типами поведения различны также по функциональной активности клеток иммунной системы. В настоящем исследовании продемонстрировано, что трехкратная трансплантация спленоцитов от доноров с оппозитными типами поведения сингенным реципиентам в ювенильный период их развития вызывает у последних направленное изменение параметров ориентировочно-исследовательского поведения, сопровождаемое модуляцией содержании цитоки-нов в селезенке и головном мозге и интенсивности иммунного ответа.
В случае трансплантации спленоцитов от доноров с активным типом поведения в группе реципиентов в половозрелом возрасте регистрировалось увеличение доли животных с активным типом поведения относительно контрольной группы (28,4% га 11,7%; р = 0,003), что ассоциировалось с более высоким содержанием у реципиентов Ш-10 в лизатах селезенки (26,1 [5,03-68,3] vs 3,2 [0,12-6,9] pg/ml; р = 0,035) и повышением интенсивности иммунного ответа. В частности, высота реакции ГЗТ у мышей-реципиентов и в контрольной группе животных
составляла 38,2 (30-47,4) и 23,8 (12,25-30,8) соответственно; интенсивность гуморального иммунного ответа, оцененная по относительному числу антителообразую-щих клеток селезенки (АОК), у указанных групп мышей также повышалась (101,3 [60,2-184,9] vs 42,7 [14,9-45,5]).
В группе реципиентов, подвергнутых трехкратной трансплантации спленоцитов от доноров с пассивным типом поведения, регистрировалось увеличение доли животных с аналогичным донорам пассивным типом поведения: 36,6 % vs 23,4% относительно группы контроля (р = 0,05), что сопровождалось более высоким содержанием в лизатах головного мозга реципиентов №N7 (2205(2095,5-2322,5) vs 1975,8 (1832,4-2103,4) pg/ml; р = 0,023) и ТОТа (41,7±[0,91-141,9] vs 0,0±[0,0-25,9] pg/ml; р = 0,05) относительно соответствующих показателей в контрольной группе животных. Со стороны иммунного ответа у животных-реципиентов отмечалось снижение высоты реакции ГЗТ (15,85 [13,6-20] и 23,8 [12,25-30,8] относительно контрольной группы мышей) при повышении интенсивности гуморального иммунного ответа (относительное число АОК селезенки составляло у животных реципиентов и мышей контрольной группы соответственно 71,4 [46,8-102,3] vs 42,7 [14,9-45,5]).
Заключение. Таким образом, представленные результаты свидетельствуют о модулирующем влиянии многократной трансплантации иммунных клеток с определенными функциональными характеристиками, проведенной в ювенильный период развития экспериментальных животных, на функциональную активность иммунной и нервной систем реципиентов половозрелом возрасте.
ИЗМЕНЕНИЕ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРЕДОПРЕДЕЛЯЕТ ВОЗНИКНОВЕНИЕ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В СПОНТАННОЙ МЫШИНОЙ МОДЕЛИ
Аронов Д.А., Моисеева Е.В.
Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова, Москва, Россия
Введение. Рак молочной железы (РМЖ) является наиболее распространенным онкологическим заболеванием у женщин. Персональное предсказание времени возникновения РМЖ может существенно облегчить раннюю диагностику, способствуя снижению смертности. Например, в модели Гейла прогноз строится на основании данных анамнеза жизни женщины с учетом наличия мутаций BRCA1/2 и других известных генов, определяющих врожденную предрасположенность к развитию РМЖ. Однако существующие в клинической онкологии модели по-прежнему не позволяют даже приблизительно предсказать возраст, в котором у данной женщины возникнет РМЖ. Отдельного внимания заслуживает прогностический потенциал показателей иммунный системы: для ряда субпопуляций клеток иммунной системы (ИС) пациентов с РМЖ описаны как про-, так и противоопухолевые эффекты. Имеются данные о связи инфильтрации РМЖ лимфоцитами Treg с плохим прогнозом, а цитоток-сическими Т-лимфоцитами (ЦТЛ) — с благоприятным (в зависимости от типа РМЖ, возраста пациента и пр.). Однако влияние уровня/дисбаланса отдельных компонентов ИС на время клинического проявления рака по-прежнему не описано: невозможно выявить момент инициации РМЖ у человека, а стандартные (в том чис-
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
ле и генномодифицированные) мышиные модели, как правило, не отражают последовательную динамику естественных патофизиологических процессов в момент зарождения, промоции и прогрессии опухолевого ростка. Линия мышей BLRB конвенционального разведения характеризуется высокой частотой естественно возникающего (спонтанного) РМЖ у самок по мере старения. Проведенный ранее патоморфологический анализ позволил выявить в данной линии мышей наличие всех основных типов РМЖ человека, а также этапы прогрессии от гиперплазии до карциномы in situ и инвазивного РМЖ (как лобулярного, так и протокового). Ранее было выявлено сходство состава лейкоцитарных инфильтратов мыши в этой модели и пациентов с РМЖ.
Цель. Оценить прогностический потенциал иммунологических показателей крови, измеренных до возникновения опухоли в спонтанной мышиной модели РМЖ человека BLRB.
Материалы и методы. У интактных самок BLRB (n = 81) нашей коллекции в возрасте от 27 до 99 недель (средний возраст 55,2±2,0) были прижизненно взяты образцы крови из ретроорбитального синуса в объёме 200 мкл. Методом проточной цитометрии (FACSCalibur, BD Biosciences, США) был измерен уровень 11 основных показателей ИС крови: лимфоцитов (CD45highSSClow), моноцитов (F4/80+SSCint), нейтрофилов (CD11b+F4/80negSSCint), эозинофилов (F4/80+SSChigh), CD4+ Т-хелперов, CD8+nrn, CD 19+B-лимфоцитов, NKLl+NK-лимфоцитов, NK1.1+CD3+NK-T лимфоцитов, CD4+CD25+ активированных (акт.) Т-хелперов, CD8+CD25+ акт. ЦТЛ. Далее в течение 7 месяцев ежедневно оценивали выживание стареющих самок, еженедельно индивидуально проводили пальпацию, регистрируя появление новых РМЖ. Статистическую значимость различий оценивали в программе STATISTICA 10 (StatSoft, США) по U-критерию Манна—Уитни, связь между параметрами оценивали по коэффициенту корреляции Спирмена.
Результаты. Спустя 7 месяцев РМЖ был выявлен у 21/81 самок (26%), 37/81 самок (46%) погибли без клинических признаков РМЖ и 23/81 самок (28%) были живы без РМЖ. Изначальный уровень моноцитов в крови выживших без РМЖ самок был ниже уровня у погибших самок (p = 0,02), так и у самок группы с РМЖ (p = 0,04). Изначальный уровень Т-хелперов в крови выживших без РМЖ самок был выше, чем у самок с РМЖ (p = 0,04). Однако не было обнаружено статистически значимых различий между группой погибших без РМЖ самок и группой самок с РМЖ. Далее мы обнаружили достоверную связь 9 из 11 измеренных показателей с возрастом самки на момент забора крови (p < 0,05): уровень лимфоцитов, эозинофилов, Т-хелперов, акт. Т-хелперов, NK-клеток снижался, а уровень нейтрофилов, ЦТЛ, акт. ЦТЛ и B-лимфоцитов повышался с возрастом. Обнаруженный у самок BLRB по мере старения иммунологический дисбаланс послужил основанием для разделения исходной популяции самок на условно «молодых» (от 27 до 55 нед., в среднем 42,0±1,4 нед., n = 45) и «старых» (от 56 до 99 нед., средний возраст 71,2±2,1 нед., n = 36) и рассматривать эти две группы отдельно. Оказалось, что у «молодых» самок с РМЖ изначальный уровень NK-клеток был ниже, чем у погибших без РМЖ (p = 0,009) и выживших без РМЖ (p = 0,032). У «старых» самок с РМЖ обнаружили сочетание изначально низкого уровня B-лимфоцитов с высоким уровнем Т-хелперов, в то время как у погиб-
ших без РМЖ оба параметра были низкие (p = 0,02), а у выживших без РМЖ — высокие (p = 0,011).
Выводы. 1) Иммунологический дисбаланс усиливался по мере старения еще до возникновения РМЖ. 2) У относительно «молодых» и более «старых» самок прогностическим потенциалом в крови обладают разные иммунологические показатели. 3) Только стратифицируя самок по возрасту, удалось выявить, какие параметры ИС предопределяют появление спонтанного РМЖ в модели BLRB.
ВЛИЯНИЕ ВРЕМЕНИ ЭКСПОЗИЦИИ С БЕТА-ЭНДОРФИНОМ НА СЕКРЕТОРНУЮ АКТИВНОСТЬ СПЛЕНОЦИТОВ И МАКРОФАГОВ У МЫШЕЙ
Баева Т.А., Гейн С.В.
ФБГНУ«Институт экологии и генетики микроорганизмов» УрО РАН, Пермь, Россия
Бета-эндорфин (BE) — представитель эндогенной опиоидной системы, активно участвующий в регуляции функций иммунной системы. Это короткоживущее пептидное соединение, оказывающие непродолжительные биологические эффекты. Большой интерес представляет наличие у BE опосредованных, отсроченных по времени эффектов на функуциональную активность клеток иммунной системы. Одним из механизмов опосредованных эффектов BE может являться модуляция продукции гормонов гипоталамо-гипофизарной оси, в частности, кор-тикостерона. Целью настоящего исследования являлось изучение влияния BE на уровни кортикостерона в плазме периферической крови мышей, секрецию IL-2, IL-4 и IFNy мышиными спленоцитами, а также продукцию IL-1P и IL-10 перитонеальными макрофагами in vivo через 1 час и через 6 ч после введения пептида.
Материалы и методы. Исследования были выполнены на беспородных мышах-самцах массой 22-25 грамм. В экспериментах использовали BE (Skytek Laboratories, США), который вводили однократно внутрибрюшинно в дозах от 100 до 0,0005 мкг/кг массы животного. Животным контрольной группы вводили эквивалентный объем 0,9% NaCl. Одну половину животных выводили из эксперимента через 1 час, а вторую через 6 часов после введения BE. Выделение и культивирование спленоцитов и перитонеальных макрофагов осуществляли по стандартным методикам. Каждая культура содержала 1 х 106 клеток в 1 мл полной культуральной среды, которую готовили ex tempore на основе среды RPMI 1640 с добавлением 10 mM HEPES, 2 mM L-глутамина, 100 мкг/мл гента-мицина, меркаптоэтанола (10-3М) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки. В качестве митогена для спленоци-тов использовали конканавалин А (КонА) в концентрации 20 мкг/мл, а для макрофагов — опсонизированный зимозан (ОЗ) в концентрации 150 мкг/мл. Культивирование осуществляли во влажной атмосфере с 5% CO2 при 37 °C в течение 24 (для IL-2, IL-ф, IL-10) или 48 (для IFNy и IL-4) часов. Концентрацию кортикостеро-на определяли методом конкурентного твердофазного иммуноферментного анализа c помощью коммерческой тест-системы Enzo (США). Количественное определение цитокинов в супернатантах клеточных культур проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью наборов для мышей по методике, предложенной производителем. Полученный материал обрабатывали с помощью однофакторного дисперсионного анализа для непарных данных. Статистическую значимость раз-
