CC BY
36
© С. С. Наумов, Э. Б. Арушанян, 2012 УДК 616.8-085.2/3
ВЛИЯНИЕ ТОНИЗИДА И БИЛОБИЛА НА ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ И НЕВРОЛОГИЧЕСКИЕ РАССТРОЙСТВА У КРЫС НА МОДЕЛИ ОСТРОГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА
С. С. Наумов, Э. Б. Арушанян Ставропольская государственная медицинская академия
Препараты некоторых лекарственных растений (женьшеня, элеутерококка, родиолы и т. п.), произрастающих преимущественно в районах Дальнего Востока, в традиционной народной медицине, помимо других показаний, широко используются для лечения заболеваний центральной нервной системы. Одна из причин клинических возможностей такого рода средств, по современным представлениям, может быть связана с наличием у них нейропротективных свойств [3]. Исходя из этого, представлялось интересным определить влияние комплексного растительного препарата тонизида, содержащего экстракты женьшеня, родиолы, аралии и элеутерококка [7], на последствия острого геморрагического инсульта (ГИ) у крыс. Вызываемые тонизидом сдвиги были сопоставлены с действием другого хорошо апробированного в клинике растительного ноотропного агента, получаемого из листьев Гинкго билоба - билобила. Кроме того, учитывая значение временного фактора для активности любых нейротропных средств
[1], эффект указанных препаратов оценивали в разное время суток.
Материал и методы. Опыты выполнены на 40 белых беспородных крысах массой 170-220 г, содержавшихся в обычных условиях вивария при фиксированном световом режиме (свет-темнота 12:12) со свободным доступом к пище и воде. Острый геморрагический ГИ моделировали по методике А. Н. Макаренко и со-авт. [6]. Для этого под кетаминовым наркозом у крыс трепанировали череп и с помощью стереотаксически вводимого мандрен-ножа осуществляли деструкцию мозговой ткани в области внутренней капсулы (Н = 4 мм, _ = 3,0 мм, А = -1,3 мм от брегмы). Спустя 2-3 минуты в ту же область инъецировали 0,4-0,5 мл крови, взятой из сердца животного.
Изменения в поведении и неврологический статус оценивали у 4 групп крыс (по 10 в каждой), получавших ежедневно (в течение 7 суток) внутрибрюшинно физиологический раствор (контроль), тонизид 200 мг/ кг - смесь равных количеств экстрактов корней женьшеня, родиолы розовой, элеутерококка и аралии (Биолит, Томск) и билобил (100 мг/кг, Словения). Инъекции начинали уже через 2 ч после операции в период так называемого терапевтического окна. Для сравнения использовали 10 интактных животных. Каждая группа была дополнительно подразделена на равные под-
Наумов Станислав Сергеевич, очный аспирант кафедры фармакологии
Ставропольской государственной медицинской академии; тел.: (8652)354881, 89064898117; e-mail: n_stanislav@mail.ru.
Арушанян Эдуард Бениаминович, заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой фармакологии Ставропольской государственной медицинской академии; тел.: (8652)353429; e-mail: eduard.arush@mail.ru.
группы, которые тестировались в утренние (7.00-8.00) и вечерние (19.00-20.00) часы на протяжении 1-х, 3-х и 7-х суток эксперимента.
Оценку поведенческих сдвигов производили с помощью традиционных методик «открытого поля» и условнорефлекторного пассивного избегания, позволявших судить об исследовательской, локомоторной и когнитивной деятельности крыс [5]. На круглой арене стандартного размера на протяжении 5 мин учитывали горизонтальную (по числу пересечённых сегментов арены) и вертикальную (число вертикальных стоек) двигательную активность. Для характеристики памяти животных в челночном боксе с электрифицированным полом вырабатывали условный избегательный ответ, по латентности которого на следующий день судили о прочности сформированного памятного следа. Неврологический статус оценивали посредством Международной шкалы (Neurological Severity Scores) для лабораторных животных [8], которая градуировалась от 0 до 16 баллов.
После окончания опытов крыс под наркозом умерщвляли и извлечённый формализированный головной мозг на замораживающем микротоме («Техном МЗП-1003») подвергали серии срезов с последующей окраской гемотаксилин-эозином без депарафинирования. С помощью светооптической микроскопии характеризовали общую гистологическую картину, определяя структурные изменения с помощью разработанной нами шкалы, которая основывалась на учёте нарушений микроциркуляции, некробиоза нервной ткани, наличия вторичных ишемических очагов и степени выраженности воспалительной реакции. Эти признаки оценивали в баллах с последующим их суммированием. Полученные результаты статистически обработаны с помощью пакета компьютерных программ «BIOSTAT» с использованием t-критерия Стьюдента, однофакторного дисперсионного анализа, критерия Ньюмена - Кейлса.
Результаты и обсуждение. У контрольных животных, получавших физиологический раствор, по сравнению с интактными крысами после ГИ наблюдали довольно грубые поведенческие нарушения, совпадавшие с выраженными неврологическими расстройствами. В «открытом поле» отмечалось падение как горизонтальной, так и вертикальной двигательной активности. Моторное и исследовательское поведение имело тенденцию к некоторому восстановлению к концу послеоперационной недели, но не нормализовалось полностью. То же относится и к латентному периоду избегательного ответа в челночной камере, который при ГИ на 7-е сутки регистрации был значимо (р<0,05) короче, чем без повреждения мозга, указывая на явное ухудшение памяти. Следует отметить любопытный факт: мнестический дефект уменьшался на 3-и сутки регистрации, но вновь возрастал на 7-й день. Сопоставление поведенческих сдвигов в разное время суток свидетельствовало, что они в целом были сильнее выражены в утренние часы (табл. 1 и 2).
Таблица 1
Влияние растительных адаптогенов на двигательную активность в «открытом поле» у крыс после геморрагического инсульта
Группы животных Через 24 часа Через 72 часа Через 7 суток
ГДА ВДА ГДА ВДА ГДА ВДА
Интактные 1 20,3±2 3±0,5 19,3±0,8 2±0,5 22,3±1,4 2,6±0,8
2 21±1,7 2,6±0,8 20±2,6 2±0,5 22,6±0,8 4,3±0,8
ГИ + физ. раствор 1 1,3±0,5* 0 3,2±1,2* 1,7±0,4 6,1±0,4* 3,0±0,7
2 3,0±0,7* 2,9±0,6 4,7±1,2* 1,7±0,4 7,2±1,4* 3,5±1,3
ГИ + тонизид 1 12,6±0,9*+# 3,1±0,6 14,1±0,9*# 5,5±0,4*+# 21±3,0*+# 6,6±0,4*+#
2 9,1±0,7*# 3±0,5 12,1±0,9*# 4±0,5* 15,6±1,9* 4,1±0,4
ГИ + Билобил 1 2,4±0,2 1,9±0,6 4,2±0,8 2,7±0,5 7,6±2,1 2,5±0,3
2 3,6±1,4 2,2±0,7 6,2±1,2 3,1 ±0,9 12,4±2,5 5,6±1,3+
Примечание:
ГИ - геморрагический инсульт;
1 - утренние определения;
2 - вечерние определения;
ГДА - горизонтальная двигательная активность;
ВДА - вертикальная двигательная активность;
* - достоверный сдвиг по отношению к животным с ГИ при Р<0,05 (здесь и далее однофакторный дисперсионный анализ, критерий Ньюмена - Кейлса);
** - достоверный сдвиг по сравнению с интактными жи вотными при Р<0,05;
+ - достоверность разницы при сравнении утренних и ве^ черних серий при Р<0,05;
# - достоверный сдвиг при сравнении эффектов тонизи да и билобила при ГИ (Р<0,05).
Таблица 2 Влияние растительных адаптогенов на латентный период условной реакции пассивного избегания у крыс после геморрагического инсульта
Группы животных Латентный период УРПИ, сек
24 часа после обучения на 3-и сутки на 7-е сутки
Интактные 1 83,3±2,3 88,3±3,8 84,3±2,7
2 90±0,8 97,6±1,7 93±3,2
ГИ + физ. раствор 1 23,7±11,2** 52,4±21,3 17,2±7,5*
2 68,3±26,4 71,4±39,3 28,0±2,9*
ГИ + тонизид 1 43±0,5 37,8±4,6 89,7±6,7*#
2 55,1 ±5,4 69±7,2+ 101,8+2,8*#
ГИ + билобил 1 93,5±14,8*# 43,3±22,0 23,7±11,2
2 102,3±12,4# 115,4±12,1*+# 34,8±7,3
Примечания: см. таблицу 1.
При оценке неврологического статуса его грубые расстройства показаны у всех контрольных животных, причём в течение первых 48 ч после операции они отличались максимальной выраженностью. К концу недели происходило их некоторое ослабление. Так же, как и при учёте поведенческих нарушений, это в меньшей степени относилось к показателям вечерних экспериментов (рис.). Согласно гистологическим данным, описанным явлениям сопутствовала определённая патоморфологическая картина. Она характеризовалась обширными очаговыми кровоизлияниями преимущественно в области внутренней капсулы. Кроме того, во всех слоях неокортекса и подлежащих субкортикальных структурах обнаруживался перива-скулярный отёк. Даже на значительном расстоянии от очага повреждения (в коре, мозжечке) порой можно было отметить ишемические явления.
А Б В
Рис. Влияние инъекций физиологического раствора (1), тонизида (2) и билобила (3) на выраженность неврологического дефицита (N88) у крыс в разные сроки после геморрагического инсульта (ГИ):
А, Б, В - на 1-е, 3-и и 7-е сутки после ГИ соответственно; светлые столбики - утренние определения, темные - вечерние;
*, ** - при достоверности соответственно Р<0,05; <0,01 по сравнению с животными, получавшими физ. раствор;
+ - при сравнении утренних и вечерних серий (Р<0,01)
Комплексный препарат растительных адаптогенов при повтором введении в целом ослаблял поведенческие и неврологические нарушения, вызванные острым ГИ. По сравнению с контрольными животными в «открытом поле» прогрессивно восстанавливалась горизонтальная и вертикальная двигательная активность, к окончанию послеоперационной недели приближаясь к тем же показателям у интактных крыс (см. табл. 1). Знаменательно, что эффект тонизида был гораздо отчётливее в утренние часы, когда сдвиг локомоции приобретал статистически значимый вид: горизонтальная активность в это время составляла 21±3,0 и только 15,6±1,9 (р<0,05) при вечернем тестировании. Препарат ликвидировал также нарушения
памяти в челночном боксе, на 7-е сутки с высокой достоверностью (р<0,05) удлиняя латентность избега-тельной реакции. Надо заметить, что в утренней группе 50 % крыс воздержались от захода в тёмную камеру и лишь 25 % животных - в вечерние часы (см. табл. 2), что может указывать на большую прочность сформированного навыка в начале дня.
Одновременно с нормализацией поведения тонизид уменьшал выраженность неврологического дефицита. Эффект обнаруживался уже через 24 ч после ГИ и имел тенденцию к постепенному нарастанию за исключением вечернего тестирования на 3-й послеоперационный день. Как и в случае поведенческих сдвигов, действие препарата было заметнее в утренние часы (см. рис.). Указанные изменения определённым образом коррелировали с улучшением патоморфологической картины в области очага поражения мозга. На 7-е сутки утром это соответствовало 6,5±0,5 (против 16,3±0,3 в контроле), а вечером 8,0±0,5 (в контроле 11,7±0,2) баллам. И здесь следует отметить несколько большую эффективность препарата у животных утренней группы.
Традиционный ноотропный препарат билобил, обладая подобно тонизиду нормализующим влиянием на последствия травматизации мозга, тем не менее по ряду критериев отличался от него. В частности, он слабее восстанавливал поведенческие нарушения в «открытом поле», а его мнемотропное действие в утренней группе животных, отчётливо проявлявшееся в 1-е сутки после ГИ, постепенно ослабевало к концу эксперимента. Оно по-разному проявлялось в вечерние часы: на 3-и сутки показано значимое ослабление амнезии, которая, напротив, возросла на 7-й послеоперационный день (см. табл. 1 и 2). Билобил ограничивал, кроме того, неврологический дефицит, причём в отличие от тонизида, как и при регистрации поведения, нормализация отчётливее происходила вечером (см. рис.). Данный препарат также ослаблял патоморфологические сдвиги, обусловленные ГИ. Утром его действие оценивали в 9,8±0,4, а вечером в 8,8±0,5 баллов, что по абсолютным значениям несколько уступало эффекту тонизида.
Таким образом, оба изученных препарата растительных адаптогенов обнаруживали способность нормализовать нарушения когнитивной деятельности, моторики и неврологический дефицит у крыс на модели острого ГИ. Это совпадало с заметным улучшением морфологической картины в очаге повреждения мозга.
Полученные результаты правомерно трактовать как следствие комплексного вмешательства действующих начал изученных растений в нейрохимические процессы поражённой инсультом мозговой ткани. Защитный эффект растительных адаптогенов, подобных женьшеню, родиолы или Гинкго билоба, по современным представлениям, может зависеть в первую очередь от противодействия оксидантному стрессу, который неизменно сопутствует любой форме экспериментального инсульта [2, 9, 10, 12]. Имеет значение и защита от разных видов нейроинтоксикации, ограничение апоптоза, воспалительных процессов [11, 13, 14]. Всё это в конечном счете приводит к уменьшению объёма инфаркта мозга и положительным морфологическим перестройкам.
Вместе с тем в действии исследованных препаратов выявлены определённые отличия. С клинической точки зрения, во-первых, существенно, что в наших
экспериментах на использованной модели ГИ у тонизида обнаружена большая эффективность в сравнении с билобилом. Во-вторых, они различались и по своей хронотропной активности. При меньшей тяжести вечернего поражения мозга тонизид гораздо успешнее ослаблял поведенческие и неврологические расстройства в случае использования утром. Возможно, отчасти это объясняется и тем обстоятельством, что в состав комплексного препарата входит элеутерококк, который, по нашим предыдущим наблюдениям и на людях, отчётливее улучшал память именно в утренние часы [4]. Указанные факты, а также обнаруженные различия, по-видимому, следует учитывать в практике клинического применения то-низида и билобила.
Выводы
1. Комплексный препарат растительных адап-тогенов тонизид и билобил (экстракт листьев Гингко билоба) при недельном использовании ослабляли поведенческие и неврологические расстройства, которые возникали у крыс при моделировании острого геморрагического инсульта. Одновременно наблюдалось улучшение патоморфологической картины поражённого участка мозга.
2. Тонизид несколько превосходил билобил по эффективности влияния на изученные показатели. Оба препарата различались и по своей хронотропной активности, поскольку действие тонизида в отличие от билобила отчётливее проявлялось при его введении в утренние, чем вечерние часы.
Литература
1. Арушанян, Э.Б. Хронофармакология / Э.Б. Ару-шанян. - Ставрополь, 2000. - 424 с.
2. Арушанян, Э.Б. Ноотропные свойства препаратов Гинкго Билоба / Э.Б. Арушанян, Э.В. Бейер // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2008. - № 71(4). - С. 57-63.
3. Арушанян, Э.Б. Растительные адаптогены / Э.Б. Арушанян, Э.В. Бейер. - Ставрополь, 2009. - 231 с.
4. Арушанян, Э.Б. Неодинаковое влияние элеутерококка на психофизиологические показатели у здоровых людей в зависимости от времени суток и хронотипа испытуемых / Э.Б. Арушанян, О.А. Мастягина // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2009. - № 72(3). -С. 10-12.
5. Воронина, Т.А. Методические указания по изучению ноотропной активности фармакологических веществ / Т.А. Воронина, Р.У. Островская // Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2000. - С. 126-130, 153-158.
6. Макаренко, А.Н. Метод моделирования локального кровоизлияния в различных структурах головного мозга экспериментальных животных / А.Н. Макаренко, Н.С. Косицин, Н.В. Пасико-ва // Журнал высшей нервной деятельности. -2002. - № 52 (6). - С. 765-768.
7. Методические рекомендации при применении биологических активных добавок.- Томск, 2007. - 59 с.
8. Салмина, А.Б. Изменение активности АДФ-рибозилциклазы в клетках нервной систе-
мы коррелирует с развитием постишемиче-ской когнитивной дисфункции / А.Б. Салмина, Н.А. Шнайдер, С.В. Михуткина // Международный неврологический журнал. - 2007. - № 1
(11). - С. 7-11.
9. Bu, Y. Siberian ginseng reduces infarct volume in transiens focal cerebral ischemia in Sprague-Dawley rals/ Y. Bu, Z.H. Jin, S.Y. Park [et al.] // Phytather. Res. - 2005. - № 19. - P 167-169.
10. Cao, L.L. The effect of salidroside on cell damage induced by glutamate and intracellular free calcium in PC12 cells / L.L. Cao, H. Dug, M.W. Wang // J. Asian Nat. Prod. Res. - 2006. - № 8. - P 159165.
11. Chen, X.C. Ginsenoside Rg1 attenuates dopamine-induced apoptosis in PC12 cells by suppressing oxidative stress / X.C. Chen, YG. Zhu, L.A. Zhu
[et al.] // Eur. J. Pharmacol. - 2003. - № 473. -P 1-7.
12. Chen, F. Reduction in levels of the Alzheimer amiloid beta peptide after oral administration of ginsenosides / F. Chen, E.A. Eckman, C.B. Eck-man // FASEB. J. - 2006. - № 20 (8). - P 12691271.
13. Huong, N.T. Social isolation stress-induced oxidative damage in mouse brain and its modulation by majonoside-R2, a Vietnamese ginseng saporin / N.T. Huong, Y. Murakami, M. Tohida [et al.] // Biol. Pharm. Bull. - 2005. - № 28. - P 1389-1393.
14. Kim, Y.H. Neuroprotective effects of ginsenoside Rg3 against homocysteine-induced excitotoxicity in rat hippocampus / Y.H. Kim, S.Y. Cho, J.H. Lee [et al.] // Brain Res. - 2007. - № 1136. - P 190199.
ВЛИЯНИЕ ТОНИЗИДА И БИЛОБИЛА НА ПОВЕДЕНЧЕСКИЕ И НЕВРОЛОГИЧЕСКИЕ РАССТРОЙСТВА У КРЫС НА МОДЕЛИ ОСТРОГО ГЕМОРРАГИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА
С. С. НАУМОВ, Э. Б. АРУШАНЯН
Комплексный препарат растительных адапто-генов тонизид и ноотропное средство билобил при повторном введении ослабляли поведенческие и неврологические нарушения у крыс, вызываемые геморрагическим инсультом. Эти нарушения неодинаково выражены в утренние и вечерние часы, что по-разному отражается на фармакологическом эффекте.
Ключевые слова: тонизид, билобил, геморрагический инсульт, хронофармакология
EFFECTS OF TONIZID
AND BILOBIL ON BEHAVIORAL
AND NEUROLOGICAL DISTURBANCES INDUCED
BY HEMORRAGIC STROKE IN RATS
NAUMOV S. S., ARUSHANIAN E. B.
Behavioral and neurological disturbances in rats after acute hemorrhagic stroke were observed. The described shifts were weaker in the evening hours then after morning testing. Repeated administration of pineal gland hormone melatonin progressively decreased disturbances produced by stroke and volume injury of cerebral tissue. These results more expressed in evening hours.
Key words: hemorrhagic stroke, pineal melatonin, behavioral disturbances
© A. М. Сампиев, Н. A. Давитавян, 2012 УДК 615.246.4.07:582.736
РАЗРАБОТКА НОРМ КАЧЕСТВА ЖИДКОГО ЭКСТРАКТА ТРАВЫ СТАЛЬНИКА ПОЛЕВОГО
А. М. Сампиев, Н. А. Давитавян Кубанский государственный медицинский университет
Важнейшим и обязательным этапом в создании нового лекарственного средства, в том числе растительного происхождения, является научно-обоснованное нормирование его качества. Разработка норм качества фитопрепарата осуществляется прежде всего с учетом состава содержащихся в нем биологически активных соединений (БАС). Главным показателем и
Сампиев Абдулмуталип Магаметович, доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой фармации
Кубанского государственного медицинского университета; тел.: (861)2684439, 89280375500; e-mail: sampiev_abdul@mail.ru
Давитавян Наира Альбертовна, кандидат фармацевтических наук, доцент кафедры фармации
Кубанского государственного медицинского университета; тел.: (861)2684439, 89649139472; e-mail: davitavyan08@mail.ru.
количественной характеристикой качества фитопрепарата является необходимый уровень содержания в нем действующих веществ. При этом по данному показателю целесообразно соблюдение принципа сквозной стандартизации в ряду: лекарственное растительное сырье - субстанция - лекарственная форма [3, 6]. Ранее были представлены исследования по разработке технологии и показана потенциальная возможность использования в медицине жидкого экстракта травы стальника полевого [1, 2]. С целью дальнейшего внедрения этого нового фитопрепарата в качестве лекарственного средства представлялось необходимым проведение исследования по нормированию его качества.
Материал и методы. В качестве объекта исследования использовали жидкий экстракт травы стальника полевого, полученный вакуум-фильтрационным способом [2]. Оценку качества экстракта проводили
