CC BY
63
УДК 579.66:547.94
А. А. Шараева (асп.), Н. И. Петухова (к. биол. н., доц.), Д. В. Щербакова (студ.), В. В. Зорин (чл.-корр. АН РБ, д.х.н., проф., зав. каф.)
Влияние соапстока на рост и синтез арахидоновой кислоты
гриба Mortierella alpina ГР-1
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e-mail: [email protected]
A. A. Sharaeva, N. I. Petukhova, D. V. Scherbakova, V. V. Zorin
Influence of soapstock on fungus Mortierella alpina rP-1 growth and arachidonic acid synthesis
Ufa State Petroleum Technological Univercity 1, Kosmonavtov Str, 450062, Ufa, Russia; ph. (347)431935, e-mail: [email protected]
Исследована возможность использования соапстока — отхода производства подсолнечного масла для получения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты с помощью микроорганизмов. Показано, что гриб Mortierella alpina ГР-1 — продуцент арахидоновой кислоты способен расти на овсяной среде с сульфатом цинка (0.12%), в присутствии 0.5— 2 % соапстока, содержащего около 50% сухих веществ. Содержание арахидоновой кислоты в липидах гриба, полученных на среде с 0.5— 1 % асв соапстока достигает 56% (от суммы жирных кислот). При более высоких концентрациях соапстока в среде (2—4 % асв) происходит подавление развития воздушного мицелия гриба и формирование мощного субстратного мицелия, содержащего липиды с низким содержанием ара-хидоновой кислоты (около 5% от суммы кислот).
Ключевые слова: арахидоновая кислота; микробиологический синтез липидов; Mortierella alpina; отходы переработки растительных масел.
The possibility of soapstock — sunflower oil production waste — use for microorganisms-assisted obtaining of lipids containing polyunsaturated fatty acids was searched. It has been shown that fungus Mortierella alpina TP-1 — producer of arachidonic acid — is able to grow on the oat medium with zinc sulfate (0.12%) and soapstock (0.5—2 %) containing 50% adm. The arachidonic acid content in fungal lipids obtained on medium with 0.5—1.0 % adm soapstock is 56% (of total fatty acids). Higher concentrations of soapstock (2—4 % adm) in medium inhibit aerial mycelium development of fungus and massive substrate mycellium with low arachidonic acid content (5% of total fatty acids) formation occurs
Key words: vegetable oils processing waste; arachidonic acid; microbiological synthesis of lipids; Mortierella alpina.
Одним из подходов к снижению стоимости биотехнологической продукции является использование в качестве сырья для биосинтеза отходов переработки растительной биомассы. В настоящее время на их основе разрабатываются эффективные технологии получения широкого спектра продуктов с добавленной стоимостью (биотоплив, химикалиев, лекарственных веществ, средств защиты растений, биосурфактантов, биопластиков, наноматериа-лов, биокатализаторов и др.) 1-3.
Дата поступления 12.01.14
Перспективным сырьем для биотехнологических производств может служить соап-сток, образующийся на стадии химического рафинирования растительных масел с помощью гидроксида натрия. Показано его использование для получения ряда практически важных продуктов (полиоксибутирата, биогаза, гетерополисахаридов, ферментов) 4-7.
В настоящей работе изучена возможность использования соапстока — отхода производства подсолнечного масла, в качестве сырья для получения полиненасыщенных жирных кислот, в частности арахидоновой кислоты, с помощью микроорганизмов.
Арахидоновая кислота и ее производные обладают широким спектром биологической активности, что позволяет использовать их в качестве лекарственных средств, пищевых и кормовых добавок, стимуляторов роста и индукторов неспецифической устойчивости растений 8-12.
Эффективными продуцентами липидов с высоким содержанием арахидоновой кислоты являются грибы рода Mortierella 13-17. Ранее при исследовании возможности использования глицерина — отхода производства биодизеля 18 и ряда отходов производства подсолнечного масла для синтеза арахидоновой кислоты с помощью гриба Mortierella alpina ГР-1 было показано, что микроорганизм активно растет на овсяной среде с 1% глицерина или гидрофу-за (фосфолипидов), а также на глицеринсо-держащей среде со смесью овсяной крупы и шрота (1:1), накапливая 25—27 % липидов, содержащих 63—65 % арахидоновой кислоты (от суммы жирных кислот). В то же время применение жирных кислот в качестве компонента ростового субстрата ограничивается их ингиби-
19
рующим действием на рост микроорганизма .
Известно, что соапстоки представляют сложную смесь, содержащую воду, мыла, жирные кислоты, жиры (триацилглицериды), глицерин, а также соединения фосфора, красящие вещества, минеральные и механические примеси и др. Содержание сухих веществ может значительно варьировать от 50 до 90 %. Наличие в соапстоках веществ как стимулирующих рост гриба Mortierella alpina ГР-1 (глицерин), так и ингибирующих его (жирные кислоты), позволяет полагать, что в зависимости от концентрации в среде этот отход будет оказывать различное действие на продуцент ара-хидоновой кислоты.
В работе использовали подкисленный с помощью фосфорной кислоты соапсток (рН 6.8),
полученный при производстве подсолнечного масла на ОАО «Чишминское», с массовым содержанием сухих веществ около 50%. Соапсток вносили в овсяную среду с сульфатом цинка (120 г овсяной крупы и 1.2 г сульфата цинка на 1 кг среды) в концентрациях 0.5—4 % асв. В качестве контроля использовали среду без соапстока. Среды инокулировали грибным мицелием в трех точках на поверхности каждой чашки Петри и выращивали грибы в течение 20 сут при 25 оС.
При исследовании роста гриба Mortierella alpina ГР-1 было обнаружено, что при низких концентрациях соапстока в среде формируется обильный воздушный мицелий, тогда как при высоких концентрациях образуется мощный субстратный мицелий (рис. 1). Масса субстратного мицелия, собранного с поверхности среды, содержащей 4% соапстока, в одной чашке Петри, составляла 0.37 г, что сопоставимо с массой воздушного мицелия, полученного на среде с 0.5% соапстока (0.4 г).
Ранее было показано, что в воздушном мицелии гриба Mortierella alpina ГР-1 накапливаются липиды с высоким содержанием ара-хидоновой кислоты 19. Содержание арахидо-новой кислоты в липидах субстратного мицелия не изучалось. Вместе с тем, при наличии в субстратном мицелии липидов, также содержащих целевую кислоту в значительных количествах, может быть целесообразным культивирование гриба именно при высоких концентрациях соапстока.
Однако, исследование жирнокислотного состава липидов субстратного мицелия показало, что содержание арахидоновой кислоты в них очень низкое (около 5% от суммы жирных кислот), тогда как в липидах воздушного мицелия содержание целевой кислоты достигало 56%. Это показывает, что наиболее эффективными для получения арахидоновой кислоты
0.5% (асв) 1.0% (асв) 2% (асв) 4% (асв)
Рис. 1. Влияние различных концентраций соапстока на рост гриба Mortierella alpina ГР-1
являются среды, содержащие низкие концентрации соапстока. Возможно, что жирные кис-
20
лоты, содержащиеся в соапстоке , подавляют развитие воздушного мицелия. Ингибирующее действие этих соединений на формирование воздушного мицелия гриба Mortierella alpina ГР-1 показано нами ранее 19.
Кроме того, обнаружено, что в присутствии высоких концентраций соапстока (2—4 % асв) значительно изменяются реологические свойства среды. Среда становится очень твердой, что не только затрудняет ее равномерное распределение по чашкам Петри, но и, возможно, осложняет рост грибного мицелия. Установлено, что снижение содержания овсяной крупы с 120 г/кг до 70—90 г/кг в средах с соапстоком (2—4 % асв) способствует увеличению текучести среды, в связи с чем дополнительно был исследован рост гриба и при более низком содержании овсяной крупы в среде.
Следует отметить, что снижение содержания овсяной крупы в среде с 120 до 70 г/кг в вариантах без соапстока приводит к существенному уменьшению выхода воздушного мицелия (более чем в 2.5 раза), однако, в присутствии 0.5% асв соапстока достигается сопоставимый выход массы воздушного мицелия в вариантах с 90 и 120 г/кг, а при концентрации соапстока 1% асв более высокий выход мицелия наблюдается при 90 г/кг овсяной крупы (рис. 2). Дальнейшее увеличение содержания соапстока (до 2—4 % асв) приводит к подавлению развития воздушного мицелия не только при 120 г/кг овсяной крупы, как было показано выше (рис. 1), но и при более низких концентрациях овса в среде (рис. 2).
среде в области 90—120 г/кг и достигает наибольшего значения при концентрации соапстока 0.5% от асв (рис. 3).
0,5
ук 0,4
Н
а
0,3
,а
сс а 0,2
S
s
W 0,1
0
ti
□ без соапстока
Ш соапсток - 0,5% асв
□ соапсток - 1% асв
□ соапсток - 2% асв ■ соапсток - 4% асв
70 90 120
Овсяная крупа, г/кг среды
Рис. 2. Масса воздушного мицелия, полученного при культивировании гриба Mortierella alpina ГР-1 на средах с различным содержанием овсяной крупы и соапстока в течение 20 сут
Показано, что содержание липидов в воздушном мицелии гриба Mortierella alpina ГР-1 мало зависит от содержания овсяной крупы в
овсяная крупа:
□ 70 г/кг
□ 90 г/кг
□ 120 г/кг
0 0,5 1
Соапсток, % (асв)
Рис. 3. Содержание липидов в воздушном мицелии, полученном при культивировании гриба Mortierella alpina ГР-1 на средах с различным содержанием овсяной крупы и соапстока в течение 20 сут
В результате исследования жирнокислот-ного состава липидов воздушного мицелия обнаружено, что при культивировании гриба Mortierella alpina ГР-1 на овсяных средах без соапстока уровень арахидоновой кислоты в липидах снижается с 58 до 38 % (от суммы кислот) с увеличением содержания овсяной крупы в среде от 70 до 90—120 г/кг (табл. 1). Внесение соапстока в концентрации 0.5—1 % асв в среду, содержащую 120 г/кг овсяной крупы, приводит к увеличению содержания арахидо-новой кислоты с 38 до 53 %. Напротив, при использовании сред с низким содержанием овсяной крупы (70 г/кг) добавление соапстока способствует снижению доли целевой кислоты в липидах воздушного мицелия (с 58 до 44 % от суммы жирных кислот). На средах, содержащих 90 г/кг овсяной крупы, соапсток в концентрации 0.5—1 % асв не оказывает существенного влияния на уровень арахидоновой кислоты в липидах (54—56 % от суммы жирных кислот).
Таким образом, полученные результаты показывают, что соапсток, образующийся при производстве подсолнечного масла, может быть использован в качестве добавки к ростовой среде для получения полиненасыщенных жирных кислот с помощью микроорганизмов. Внесение соапстока в концентрации 0.5% (асв) в среду для культивирования гриба Mortierella alpina ГР-1 — продуцента арахидоновой кислоты — позволяет снизить содержание в ней овсяной крупы на 25% без существенного снижения выхода биомассы (воздушного мице-
Таблица 1
Жирнокислотный состав липидов воздушного мицелия, полученного при культивировании гриба Mortierella alpina ГР-1 на средах с различным содержанием овсяной крупы
и соапстока в течение 20 сут
Овсяная крупа, г/кг Соапсток, % асв Жирные кислоты, % (от суммы)
пальмитиновая стеариновая олеиновая лино-левая у-лино-леновая арахидо-новая
70 0 16 2 16 6 2 58
0.5 16 3 16 6 3 57
1 17 3 20 13 3 44
90 0 17 5 19 4 2 54
0.5 14 4 17 6 3 56
1 14 3 16 8 3 56
120 0 20 6 31 3 1 38
0.5 20 8 23 6 2 41
1 16 5 17 6 3 53
лия), содержания в ней липидов и уровня ара-хидоновой кислоты. При культивировании гриба на среде, обеспечивающей наиболее эффективное развитие воздушного мицелия (концентрация соапстока 0.5% асв и содержание овсяной крупы 90 г/кг), уровень арахидоно-вой кислоты в липидах составляет 56% (от суммы жирных кислот). Использование более высоких концентраций соапстока (2—4 % асв) нецелесообразно в связи с подавлением развития воздушного мицелия и формированием мощного субстратного мицелия, содержащего ли-пиды с низким содержанием арахидоновой кислоты (около 5% от суммы кислот).
Экспериментальная часть
Выращивание гриба проводили методом поверхностного культивирования на плотных питательных средах следующего состава:
1) овсяная крупа — 120 г, соапсток — 5, 10, 20 или 40 г (асв), 2и804-7Н20 — 1.2 г, вода — 1л;
2) овсяная крупа — 90 г, соапсток — 5, 10, 20 или 40 г (асв), 2и804-7Н20 — 1.2 г, вода — 1л;
3) овсяная крупа — 70 г, соапсток — 5, 10, 20 или 40 г (асв), 2и804-7Н20 — 1.2 г, вода — 1л;
4) овсяная крупа — 70, 90 или 120 г, гп804-7Н20 - 1.2 г, вода - 1л.
Питательные среды стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при температуре 120 оС.
Инокулят наносили на поверхность среды в центре чашки Петри. Выращенную биомассу собирали, трижды промывали дистиллированной водой и высушивали в сушильном шкафу до постоянного веса при температуре 65 оС. Липиды экстрагировали из сухого мицелия троекратной обработкой гексаном. Для определения жирнокислотного состава грибных липидов получали метиловые эфиры жирных кислот как описано в работе 21.
Идентификацию метиловых эфиров жирных кислот проводили на хроматомасс-спект-рометре НР-5896 с масс-селективным детектором НР-5972А, стеклянной капиллярной колонкой длиной 50 м, 5% фенилметилсиликона на НР-5, температура ионного источника 120 оС, ускоряющее напряжение 3 кВ, энергия ионизации 70 еВ. Режим изменения температуры колонки программировали со скоростью 10 град/мин от 50 до 250 оС.
Количественный анализ состава полученных препаратов метиловых эфиров жирных кислот осуществляли на хроматографе «Хро-матэк Кристалл» с пламенно-ионизационным детектором на капиллярной колонке 60т х х 0.32тт ГО Solgel-Wax х 0.5^т. Режим анализа: температура термостата колонки - 250 оС, температура детектора - 320 оС, температура испарителя - 320 оС, скорость газа-носителя (азот) — 27.5 мл/мин.
Литература
1. Зорин В. В., Петухова Н. И., Шахмаев Р. Н. // РЖХО им. Д. И. Менделеева.- 2011.— Т.55, №1.— С.77.
2. Makkar R. S., Cameotra S. S., Banat I. M. // AMB Express.— 2011.— V.1, №5.— Р.1.
3. Javers J., Gibbons W. R., Karunanithy C. // Adv. Microbiol.— 2012.— V.2.— P.241.
References
1. Zorin V. V., Petukhova N. I., Shakhmaev R. N. Rossiiskii khimicheskii zhurnal. 2011. V.55, no. 1. P.77.
2. Makkar R. S., Cameotra S. S., Banat I. M. AMB Express. 2011. V.1, no.5. Р.1.
3. Javers J., Gibbons W. R., Karunanithy C. Adv. Microbiol. 2012. V.2. P.241.
4. Ward A. J. // DCA Danish centre for food and agriculture.— 2012.— P.22.
5. Javers J., Gibbons W. R., Karunanithy C. // Adv. Microbiol.— 2012.— V.2.— P.241.
6. Maneerat S. // Songklanakarin J. Sci. Technol.—
2005.— V.27(3).— P.675.
7. Корнеева О. С., Капранчиков В. С., Мотина Е. А, Тарасевич Т.В. // Усп. совр. естествознания.—
2006. №10.— C.75.
8. Петухова Н. И., Рахматуллина Ю. Р., Пантелеева С. Н., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.—
2007.— Т.14, №1.— С.141.
9. Кудрявцева Л. П., Кудрявцев Н. А. // Научно-практич. ж. «Агро XXI».— 2009.— №4-6.— С.6.
10. Озерецковская О. Л., Васюкова Н. И., Чален-ко Г. И., Герасимова Н. Г., Ревина Т. А., Валуева Т. А. // Докл. АН.— 2008.— Т.423, №1.— С.129.
11. Озерецковская О. Л., Васюкова Н. И., Чален-ко Г. И., Герасимова Н. Г., Ревина Т. А., Валуева Т. А. // Прикл. биохим. и микробиол.— 2009.— Т.45, №2.— С.220.
12. Кульнев А. И., Соколова Е. А. Многоцелевые стимуляторы защитных реакций роста и развития растений (на примере препарата иммуно-цитофит).— Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1997.— 100 с.
13. Dyal S. D., Narine S. S.// Food Research International.— 2005.— V.38.— P.445.
14. Yuan C., Wang J., Shang Y., Gong G., Yao J., Yu Z. // Food Technol. Biotechnol.— 2002.— V.40 (4).— P.311.
15. Eroshin V. K., Satroutdinov A. D., Dedyukhi-na E. G., Chistyakova T. I. // Process Biochemistry.— 2000.— V.35.— P.1171.
16. Рахматуллина Ю. Р., Петухова Н. И., Авдеева Е. Н., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.— 2005.— Т.12, №1.— С.49.
17. Петухова Н. И., Рахматуллина Ю. Р., Яхуто-ва Я. Р., Спирихин Л. В., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.— 2006.— Т.13, №1.— С.95.
18. Da Silva G. P., Mack M., Contiero J. // Biotechnology adv.— 2009.— V.27.— P.30.
19. Петухова Н. И., Шараева А. А., Шакиров А. Н., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.— 2013.— Т.20, №3.— С.75.
20. Haas M. J. // Fuel Processing Technology.— 2005.— V.86.— P.1087.
21. А. c. №968072 СССР / Султанович Ю. А., Нечаев А. П., Барсукова И. А. // Б.И.— 1982.— №39.— С.223.
4. Ward A. J. DCA Danish centre for food and agriculture. 2012. P.22
5. Javers J., Gibbons W. R., Karunanithy C. Adv. Microbiol. 2012. V.2. P.241.
6. Maneerat S. Songklanakarin J. Sci. Technol.— 2005, V.27(3). P.675.
7. Korneeva O. S., Kapranchikov V. S., Motina E. A., Tarasevich T. V. Uspekhi sovremennogo estestvoznaniya. 2006. No. 10. P.75.
8. Petukhova N. I., Rakhmatullina Yu. R., Panteleeva S. N., Zorin V. V. Bash. khim. zh. 2007. V.14, no.1. P.141.
9. Kudryavtseva L. P., Kudryavtsev N. A. Nauchno-prakticheskii zhurnal «Agro XXI». 2009. No.4—6. P.6.
10. Ozeretskovskaya O. L., Vasyukova N. I., Chalenko G. I., Gerasimova N. G., Revina T. A., Valueva T. A. Doklady akademii nauk. 2008. V.423, no. 1. P.129.
11. Ozeretskovskaya O. L., Vasyukova N. I., Chalenko G. I., Gerasimova N. G., Revina T. A., Valueva T. A. Prikladnaya biokhimiya i mikrobiologiya. 2009. V.45, no.2. P.220.
12. Kul'nev A. I., Sokolova E. A. Mnogotselevye stimulyatory zashchitnykh reaktsiy rosta i razvitiya rasteniy (na primere preparata immunotsitofit) [Multipurpose stimulants protective reactions plant growth and development (for example, drug Immunotsitofit)].— Pushchino: USTP PSC RAS Publ., 1997. 100 p.
13. Dyal S. D., Narine S. S. Food Research International. 2005. V.38. P.445.
14. Yuan C., Wang J., Shang Y., Gong G., Yao J., Yu Z. Food Technol. Biotechnol. 2002. V.40 (4). P.311.
15. Eroshin V. K., Satroutdinov A. D., Dedyukhi-na E. G., Chistyakova T. I. Process Biochemistry. 2000. V.35. P.1171.
16. Rakhmatullina Yu. R., Petukhova N. I., Avde-eva E. N., Zorin V. V. Bash. khim. zh.— 2005. V.12, no.1. P.49.
17. Petukhova N. I., Rakhmatullina Yu. R., Yahuto-va Ya. R., Spirihin L. V., Zorin V. V. Bash. khim. zh. 2006. V.13, no.1. P.95.
18. Da Silva G. P., Mack M., Contiero J. Biotechnology advances. 2009. V.27. P.30.
19. Petukhova N. I., Sharaeva A. A., Shakirov A. N., Zorin V. V. Bash. khim. zh. 2013. V.20, no.3. P.75.
20. Haas M. J. Fuel Processing Technology. 2005. V.86. P.1087.
21. Sultanovich Yu. A., Nechaev A. P., Barsukova I. A. Method for the quantitative determination of fatty acid composition of lipids mikpoopganizmov. Patent RF no. 968072, 1982.
