CC BY
25
УДК 579.66:547.94
А. А. Шакирова (преп.), А. С. Поезжаева (магистрант), Л. Х. Халимова (к.т.н., доц.)
ВЛИЯНИЕ ХЛОРИДА НАТРИЯ НА РОСТ И ЛИПИДООБРАЗОВАНИЕ ГРИБА MORTIERELLA ALPINA ГР-1
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347) 2431935, e mail: metilorang89@mail.ru
A. A. Shakirova, A. S. Poezzhaeva, L. Kh. Khalimova
INFLUENCE OF SODIUM CHLORIDE ON GROWTH AND LIPIDS SYNTHESIS OF MORTIERELLA ALPINA GR-1
Ufa State Petroleum Technological University 1, Kosmonavtov Str, 450062 Ufa, Russia; ph. (347) 2431935, e mail: metilorang89@mail.ru
Исследована возможность использования добавки хлорида натрия в овсяную среду, содержащую 2% глицерина и 0.03% сульфата цинка, для получения полиненасыщенных жирных кислот при твердофазном культивировании гриба Mortierella alpina ГР-1. Показано, что повышение концентрации хлорида натрия с 0 до 2 % в овсяной среде приводит к увеличению содержания липидов в биомассе воздушного мицелия с 12 до 33 %, соответственно. Однако содержание арахидоновой кислоты при этом снижается на 16% (от суммы жирных кислот) на овсяной среде с добавкой 1% хлорида натрия.
Ключевые слова: арахидоновая кислота; микробиологический синтез липидов; Mortierella alpina; овсяная среда; твердофазная ферментация.
The possibility of applying the additive sodium chloride in an oatmeal medium containing 2% glycerol and 0.03% zinc sulfate, to produce polyunsaturated fatty acids in the solid phase growth of the fungus Mortierella alpina GR-1. It has been shown that increasing the concentration of sodium chloride from 0 to 2% oat medium resulted in an increase of lipids containing in the biomass of aerial mycelium from 12 to 33%, respectively. However, the content of arachidonic acid was reduced by 16% (of total fatty acids) on oat medium supplemented with 1% sodium chloride.
Key words: arachidonic acid; lipids microbiological synthesis; Mortierella alpina; oat medium; solid-state fermentation.
В лабораторных условиях на основе микроорганизмов-продуцентов биологически активных веществ разработаны эффективные методы получения препаратов медицинского назначения *'2.
Арахидоновая кислота и ее производные обладают широким спектром биологической активности, что позволяет использовать их в качестве лекарственных средств, пищевых и кормовых добавок, стимуляторов роста и индукторов неспецифической устойчивости растений 3'
Ранее нами было показано, что гриб Mortierella alpina ГР-1 на глицеринсодержа-щих средах синтезирует липиды с высоким содержанием арахидоновой кислоты (65—67 %
Дата поступления 02.11.15
от суммы жирных кислот) 5-7. Однако содержание липидов в биомассе гриба при его культивировании на овсяной среде с 2% глицерина и 0.03% сульфата цинка не превышало 20% (асв).
Известно, что культивирование продуцентов полиненасыщенных жирных кислот в условиях повышенной солености среды в ряде случаев позволяет существенно увеличить выход практически ценных соединений — арахидоновой и эйкозапентаеновой кислот8. В работе 9 было показано, что добавка в овсяную среду хлорида натрия способствует стимулированию липидообразования у галорезистентного гриба Mortierella alpina XH1.
В настоящей работе с целью повышения содержания липидов в биомассе гриба Mortierella alpina ГР-1 было исследовано
влияние хлорида натрия на развитие воздушного мицелия гриба и накопление в нем липи-дов, содержащих арахидоновую кислоту.
Культивирование гриба осуществляли поверхностным способом на овсяной среде с 2% глицерина и 0.03% сульфата цинка, добавляя 0—2 % хлорида натрия, в течение 20 сут при температуре 28±2 °С.
Повышение концентрации хлорида натрия в среде привело к увеличению содержания липидов в биомассе с 12 до 33 % (рис.). Однако, выход воздушного мицелия при этом снизился более чем в 6 раз на среде с 2% хлорида натрия. Возможно, это связано с тем, что гриб Mortierella alpina ГР-1 находясь в неблагоприятных для него условиях повышенной солености среды начинает накапливать запасные вещества — липиды 10.
г 35
-6— Биомасса - -Д - Липиды „ А
митиновая (С16:0), стеариновая (С18:0), олеиновая (С18:1), линолевая (С18:2), у-линоленовая (С18:3) и дигомо-^-линоленовая (С20:3) кислоты. Однако с увеличением содержания хлорида натрия в среде от 0 до 1 % уровень арахидоновой кислоты в липидах снижается с 47 до 30 % (от суммы кислот). Вместе с тем, было обнаружено, что при культивировании гриба Mortierella alpina ГР-1 на овсяной среде с 2% глицерина и 0.03% сульфата цинка без добавки хлорида натрия, содержание арахидоновой кислоты в липидах воздушного мицелия было ниже (47% от суммы ЖК), чем в предыдущих опытах (65—67 % от суммы ЖК). Вероятно, это связано с повышенной температурой при культивировании (28±2 оС) 11.
Таким образом, полученные результаты показывают, что добавление хлорида натрия (до 2%) в состав глицеринсодержащей овсяной среды для культивирования гриба Mortierella alpina ГР-1 стимулирует липи-донакопление.
Экспериментальная часть
Выращивание грибов проводили в чашках Петри диаметром 10 см методом поверхностного культивирования на овсяной среде (овсяная крупа — 120 г/л), содержащей 2% глицерина и 0.03 сульфата цинка и с добавкой хлорида натрия в концентрации 0, 0.5, 1.0, 1.5 и 2 %. Питательные среды стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при температуре 120 оС. В качестве инокулята использовали восьмисуточный воздушный мицелий гриба, полученный на овсяной среде. Культивирование осуществляли при температуре 28±2 оС в течение 20 сут.
Биомассу воздушного мицелия собирали и высушивали в сушильном шкафу до постоянного веса при температуре 85 оС. Липиды экстрагировали из сухого мицелия трехкратной обработкой гексаном. Экстракты объединяли, удаляли мелкие частицы биомассы цент-
Таблица
Жирнокислотный состав липидов, накапливаемых в воздушном мицелии при культивировании гриба Mortierella alpina ГР-1 в течение 20 сут при 28±2 оС на овсяной среде, содержащей 2% глицерина и 0.03% сульфата цинка,
и различной концентрации хлорида натрия_
0,5 1 1,5 2
Концентрация хлорида натрия, %
Рис. Влияние концентрации хлорида натрия на выход биомассы и содержание липидов, накапливаемых в воздушном мицелии при культивировании гриба Mortierella alpina ГР-1 в течение 20 сут 28+2 °С на овсяной среде, содержащей 2% глицерина и 0.03% сульфата цинка
Анализ жирнокислотного состава грибных липидов (табл.), полученных на овсяной среде с 2% глицерина и 0.03% сульфата цинка в присутствии и в отсутствие хлорида натрия, показал, что во всех вариантах основным компонентом является арахидоновая кислота (С20:4). В качестве сопутствующих кислот в липидах гриба присутствуют паль-
Глицерин, % Сульфат цинка, % Хлорид натрия,% Жирные кислоты*, % (от суммы)
С16:0 С18:0 С18:1 С18:2 С18:3 С20:3 С20:4
2 0.03 0 22.4 7.4 15 5.7 2.1 - 46.8
0.5 26 7.7 20.3 6.9 2.9 - 36
1 25.8 7.8 26.3 6.7 3.1 - 30.4
* С 16:0 — пальмитиновая, С 18:0 — стеариновая, С 18:1 — олеиновая; С18:2 - линолевая; С18:3 — у -линоленовая; С20:3 — дигомо-Y-линоленовaя; С20:4 — арахидоновая
рифугированием и высушивали. Количество собранной биомассы и выделенных липидов оценивали гравиметрически.
Для определения жирнокислотного состава грибных липидов получали изопропиловые эфиры жирных кислот, как описано в работе 12. Идентификацию этиловых эфиров жирных кислот поводили на хроматомасс-спектрометре HP-5896 c масс-селективным детектором НР-5972А, стеклянной капиллярной колонкой длиной 50 м, 5% фенилметилсиликона на НР-5, температура ионного источника 120 °С, ускоряющее напряжение 3 кВ, энергия ионизации 70 еВ. Режим изменения температуры колонки программировали со скоростью 10
Литература
1. Зорин В. В., Петухова Н.И., Шахмаев Р. Н. Перспективные направления утилизации глице-ринсодержащих отходов в производстве биодизельного топлива // Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева).- 2011.- T. LV, №1.- С. 77-89.
2. Петухова Н. И., Хузина А. В., Файзрахманова Л. C., Муслухов Р. Р., Комлева Е. В., Зорин В.
B. Исследование влияния ультрафиолетового облучения на синтез продигиозина Serratia sp. NS-R1 // Баш. хим. ж.- 2009.- T.16, №1.-
C.106-108.
3. Hou C.T. Production of arachidonic acid and dihomo-y-linolenic acid from glycerol by oil-producing Wlamentous fungi, Mortierella in the ARS culture collection // J. Ind. Microbiol. Biotechnol.- 2008.- V.35.- P.501-506.
4. Ceron Garcia M.C., Fernandez Sevilla J.M.,Acien Fernandez F.G., Molina Grima E., Garcia Camacho F. Mixotrophic growth of Phaeodactylum tricornutum on glycerol: growth rate and fatty acid profile // J. Appl. Phycol.-2000.- V.12.- P.239.
5. Петухова Н.И., Ландер О.В. Рахматуллина Ю.Р. Зорин В. В. Динамика жирнокислотного состава липидов гриба Mortierella alpina 18-1 — продуцента арахидоновой кислоты и его гли-церинустойчивого мутанта при культивировании на среде с глицерином // Баш. хим. ж.-2013.- T.20, №1.- C.94-98.
6. Петухова Н.И., Рахматуллина Ю.Р., Яхутова Я.Р., Спирихин Л.В., Зорин В.В. Исследование корреляции ТТН-редуктазной активности с содержанием арахидоновой кислоты в липидах гриба Mortierella alpina 18-1 // Баш. хим. ж.-2006.- Т.13, №1.- С.95-97.
7. Петухова Н.И., Митягина А.В., Зорин В.В. Синтез полиненасыщенных жирных кислот гли-церинустойчивым мутантом Mortierella alpina GR-1 // Баш. хим. ж.- 2010.- Т.17, №5.-С.50-52.
8. Dosanjhi B.S., Higgs D.A., Plotnikoff M. D., Markert J. R., Buckley J. T. Preliminary evaluation of canola oil, pork lard and marine lipid singly and in combination as supplemental dietary lipid sources for juvenile fall chinook
град/мин от 50 до 250 0С. Отнесение хрома-тографических сигналов к соответствующим метиловым эфирам жирных кислот проводили с помощью библиотеки масс-спектров №5Т.
Количественный анализ состава полученных препаратов метиловых эфиров жирных кислот осуществляли на хроматографе Хрома-тэк Кристалл с пламенно-ионизационным детектором на капиллярной колонке 60шх 0.32шш ГО Solgel-Wax х 0.5^ш. Режим анализа: температура термостата колонки 250 оС, температура детектора 320 оС, температура испарителя 320 оС, скорость газа-носителя (азот) 27.5 мл/мин.
References
1. Zorin V.V., Petukhova N.I., Shakhmaev R.N. Perspektivnye napravleniya utilizatsii glitserin-soderzhashhikh otkhodov v proizvodstve biodi-zel'nogo topliva [Perspective directions of utilization of glycerol containing waste in the production of biodiesel] Ros. khim. zh. (Zh. Ros. khim. ob-va im. D.I. Mendeleeva) [Russian chemical Journal (Journal of the Russian Chemical Society named D.I. Mendeleev)], 2011, v. LV, no. 1, pp. 77-88.
2. Petukhova N.I., Khuzina A.V., Faizrakhmanova L.S, Muslukhov R.R., Komleva E.V., Zorin V.V. Issledovanie vliyaniya ul'trafioletovogo oblucheniya na sintez prodigiozina Serratia sp. NS-R1 [Research of the influence of ultraviolet radiation on the prodigiosine synthesis by Serratia sp. HC-P1] Bashkirskii khimicheskii zhurnal [Bashkir Chemical Journal], 2009, v. 16, no. 1, pp. 106-108.
3. Hou C.T. [Production of arachidonic acid and dihomo-y-linolenic acid from glycerol by oil-producing Wlamentous fungi, Mortierella in the ARS culture collection]. J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 2008, v. 35, pp. 501-506.
4. Ceron Garcia M.C., Fernandez Sevilla J.M., Acien Fernandez F.G., Molina Grima E., Garcia Camacho F. [Mixotrophic growth of Phaeodactylum tricornutum on glycerol: growth rate and fatty acid profile]. J. Appl. Phycol. 2000, v. 12, pp. 239-248.
5. Petukhova N.I., Lander O.V., Rahmatullina Yu. R., Zorin V.V. Dinamika zhirnokislotnogo sostava lipidov griba Mortierella alpina 18-1 — produtsenta arakhidonovoi kisloty i ego glitserinustoichivogo mutanta pri kul'tivirova-nii na srede s glitserinom [Fatty acids composition dynamics of lipids of fungus Mortierella alpina 18-1 — arachidonic acid producer and its glycerol-resistant mutant under glycerol-containing medium cultivation]. Bashkirskii khimicheskii zhurnal [Bashkir Chemical Journal], 2013, v. 20, no. 1, pp. 94-98.
6. Petukhova N.I., Rakhmatullina Yu.R., Yakhutova Ya.R., Spirikhin L.V., Zorin V.V.
Issledovanie korrelyatsii TTH-reduktaznoi aktivnosti s soderzhaniem arakhidonovoi kisloty
salmon (Oncorhynchus tshawytscha) // Aquaculture.- 1988.- V. 68.- Pp.325-343.
9. Петухова Н.И., Рахматуллина Ю.Р., Пантелеева C.H., Зорин B.B. Исследование синтеза полиненасыщенных жирных кислот галорезистен-тным грибом Mortierella alpina HN1 // Башкирский химический журнал.- 2007.- Т. 14, №1.- C. 141-144.
10. Konova I.V., Sergeeva Ya.E., Galanina L.A., Kochkina G.A., Ivanushkina N.E., Ozerskaya S. M. Lipid Synthesis by Geomyces pannorum under the Impact of Stress Factors // Microbiology.-2009.- V. 78, №1.- Pp. 42-47.
11. Totani N., Oba K. A simple method for production of arachidonic acid by Mortierella aipina // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1988.-V. 28.- P. 135-137.
12. А.с. 968072. СССР Способ количественного определения жирнокислотного состава липидов микроорганизмов / Султанович Ю.А., Нечаев А.П., Барсукова И.А. //Б.И.- 1982.- №39.
v lipidakh griba Mortierella alpina 18-1 [Correlation studies of TTH-reductase activity with arachidonic acid content in Mortierella alpina 18-1 fungi lipids]. Bashkirskii khimicheskii zhurnal [Bashkir Chemical Journal], 2006, v. 13, no. 1, pp. 95-97.
7. Petukhova N.I., Mityagina A.V., Zorin V.V. Sintez polinenasyshhennykh zhirnykh kislot glitserinustoichivym mutantom Mortierella alpina GR-1 [Synthesis of polyunsaturated fatty acids by glycerol-resistant mutant Mortierella alpine GR 1]. Bashkirskii khimicheskii zhurnal [Bashkir Chemical Journal], 2010, v. 17, no. 5, pp. 50-52.
8. Dosanjh B.S., Higgs D.A., Plotnikoff M.D., Markert J.R., Buckley J. T. [Preliminary evaluation of canola oil, pork lard and marine lipid singly and in combination as supplemental dietary lipid sources for juvenile fall chinook salmon (Oncorhynchus tshawytscha)]. Aquaculture, 1988, v. 68, pp. 325-343.
9. Petukhova N.I., Rakhmatullina Yu.R., Panteleeva S.N., Zorin V.V. Issledovanie sinteza polinenasyshhennykh zhirnykh kislot galorezistentnym gribom Mortierella alpina HN1 [Investigation of synthesis of polyunsaturated fatty acids with galo-resistant fungus Mortierella alpina HN1]. Bashkirskii khimicheskii zhurnal [Bashkir Chemical Journal], 2007, v. 14, no. 1, pp. 141-144.
10. Konova I. V., Sergeeva Ya.E., Galanina L.A., Kochkina G.A., Ivanushkina N.E., Ozerskaya S. M. [Lipid Synthesis by Geomyces pannorum under the Impact of Stress Factors]. Microbiology, 2009., v. 78, no. 1, pp. 42-47.
11. Totani N., Oba K. [A simple method for production of arachidonic acid by Mortierella aipina]. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1988, v. 28, pp. 135-137.
12. Sultanovich Yu.A., Nechaev A.P., Barsukova I.A. Sposob kolichestvennogo opredeleniya zhirnookislotnogo sostava lipidov mikroorganiz-mov [A method of quantitative determination of fatty acid lipid composition of microorganisms]. Patent USSR, no. 968072, 1982.
