CC BY
59
УДК 579.66:547.94
Н. И. Петухова (к.биол.н., доц.), О. В. Ландер (асп.), Ю. Р. Рахматуллина (асп.), В. В. Зорин (д.х.н., проф., зав. каф., чл.-корр. АН РБ)
Динамика жирнокислотного состава липидов гриба Mortierella alpina 18-1 - продуцента арахидоновой кислоты и его глицеринустойчивого мутанта при культивировании
на среде с глицерином
Уфимский государственный нефтяной технический университет, кафедра биохимии и технологии микробиологических производств 450062, г. Уфа, ул. Космонавтов, 1; тел. (347)431935, e-mail: bio@rusoil.net
N. I. Petukhova, O. V. Lander, Yu. R. Rakhmatullina, V. V. Zorin
Fatty acids composition dynamics of lipids of fungus Mortierella alpina 18-1 - arachidonic acid producer
and its glycerol-resistant mutant under glycerol-containing
medium cultivation
Ufa State Petroleum Technical University 1, Kosmonavtov Str., 450062, Ufa, Russia; ph. (347) 431935, e-mail: bio@rusoil.net
Исследована динамика жирнокислотного состава липидов гриба Mortierella alpina 18-1 — продуцента арахидоновой кислоты и его глицеринустойчивого мутанта при культивировании на овсяной среде, содержащей 1% глицерина. Показано, что в начальный период выращивания микроорганизмов (5—8 сут) доля арахидоновой кислоты в липидах мутанта ГР-1 значительно (в 7—11 раз) превышает ее содержание в липидах исходного гриба 18-1. В промежуточный период культивирования грибов (8—17 сут) наблюдается монотонное увеличение содержание арахидо-новой кислоты в липидах гриба 18-1 до 63%, тогда как в липидной фракции гриба ГР-1 происходит снижение уровня этого соединения до 40% (на 14 сут), после чего он снова возрастает до 63—65 %. Обнаружено, что временное снижение содержания арахидоновой кислоты в липидах гриба ГР-1 коррелирует с увеличением содержания -линоленовой кислоты почти до 60%.
Ключевые слова: арахидоновая кислота; глицерин; грибы; Mortierella alpina; полиненасыщенные жирные кислоты.
The fatty acids composition dynamics of lipids of fungus Mortierella alpina 18-1 — arachidonic acid producer — and its glycerol-resistant mutant was searched under cultivation on oat medium with 1% of glycerol. It is shown that at initial stage of microorganisms cultivation (5—8 days) the arachidonic acid content in mutant GR-1 lipids significantly (in 7—11 times) exceeds its content in original fungus 18-1. At intermediate stage of fungi cultivation (8—17 days) a monotonic increase of arachidonic acid content in fungus 18-1 lipids upto 63% is shown while in lipid fraction of fungus GR-1 a decrease of this compound downto 40% 14 days occurs followed by anew increase to 63—65 %. It is found that temporary decrease of arachidonic acid content in fungus GR-1 lipids correlates with increase of r-linolenic acid content to near 60%.
Key words: arachidonic acid; glycerol; fungi; Mortierella alpina; polyunsaturated fatty acids.
Побочным продуктом переработки липидов растительного и микробного происхождения, в частности при производстве биодизеля, является глицерин, на основе которого можно получать разнообразные практически важные продукты путем микробного синтеза 1,2.
Получение ряда эссенциальных полиненасыщенных жирных кислот, применяемых для
Дата поступления 02.02.13
лечения и профилактики различных хронических и воспалительных заболеваний, включая сердечно-сосудистые заболевания, ревматоидные артриты, астму, экзему, псориаз и рак также может быть реализовано на основе глицерина с помощью микроскопических грибов 3-9.
Известно, что грибы Mortierella alpina синтезируют липиды, содержащие арахидоно-вую кислоту, которые необходимы для образования клеточных мембран, и их синтез сопря-
жен с клеточным ростом. В то же время, эти грибы способны накапливать запасные липи-ды, синтез которых начинается в стационарной фазе роста, после истощения среды по ис-10
точнику азота .
Ранее было показано, что при твердофазном культивировании на овсяной среде, содержащей 1% глицерина и 0.01% сульфата цинка (среда ОГЦ), в липидах гриба Mortierella alpina 18-1 накапливается около 63% арахидо-новой кислоты (от суммы жирных кислот) 11. При увеличении концентрации глицерина в среде более 2% ускоряется процесс липидооб-разования, однако рост гриба при этом значительно ингибируется. С целью получения продуцента арахидоновой кислоты, более устойчивого к высоким концентрациям глицерина, нами был получен мутант (ГР-1), который более активно растет на среде с 3% глицерина, чем исходный гриб Mortierella alpina 18-1 11. Обнаружено, что данный гриб отличается от исходного штамма более высоким уровнем не-липидных компонентов в клетках. При этом уровень арахидоновой кислоты в липидах 21-но гриба был сопоставим с ее содержанием в липидах исходного штамма, выращенного в тех же условиях (65% и 63% от суммы жирных кислот, соответственно) 11. В качестве сопутствующих кислот в липидах этих микроорганизмов выявлены пальмитиновая (С16:0), стеариновая (С18:0), олеиновая (С18:1п9), ли-нолевая (С18:2п6), у-линоленовая кислота (С18:3п6) и дигомо-у-линоленовая кислота
COOH
El
16:0
(С20:3п6) кислоты 11,12, которые, как известно, являются интермедиатами пути биосинтеза арахидоновой кислоты у грибов Mortierella alpina, протекающего при участии нескольких специфических десатураз (D) и элонгаз (El) 13.
С целью выявления особенностей синтеза арахидоновой кислоты в клетках исходного продуцента и его глицеринустойчивого мутанта в настоящей работе была изучена динамика жирнокислотного состава липидов грибов в процессе их культивирования на среде ОГЦ, содержащей 1% глицерина.
В результате исследования динамики содержания арахидоновой кислоты было обнаружено, что ее практически одинаковый уровень в липидах исследуемых микроорганизмов достигается только в конце культивирования (17—21 сут) (рис. 1). В то же время в начальный период выращивания микроорганизмов (5—8 сут) доля арахидоновой кислоты в липидах мутанта ГР-1 значительно (в 7—11 раз) превышает ее содержание в липидах исходного гриба 18-1. В промежуточный период культивирования грибов (8—17 сут) наблюдается монотонное увеличение содержания арахидо-новой кислоты в липидах гриба 18-1, тогда как в липидной фракции мутанта ГР-1 происходит снижение уровня этого соединения до 40% (на 14 сут), после чего он снова возрастает до 63-65 %.
Анализ динамики содержания сопутствующих жирных кислот в липидах гриба ГР-1 показывает, что снижение арахидоновой кис-
COOH
18:0
D9
D6
20:4n6
о н о
н о ч о
У,
3 к л
S
*
(U S к
CS *
л
(U
4 о
о
60 —
50 —
40 —
30 —
20 —
10 —
гриб ГР-1 гриб 18-1
-1-1—
10 15
Время, сут
20
25
Рис. 1. Динамика содержания арахидоновой кислоты в липидах грибов Mortierella alpina 18-1 и ГР-1 в процессе культивирования на среде ОГЦ, содержащей 1% глицерина
0
0
Рис. 2. Динамика содержания жирных кислот в липидах гриба Mortierella alpinа ГР-1, растущего на среде ОГЦ с 1% глицерина
лоты коррелирует с накоплением у-линолено-вой кислоты, максимальное содержание которой достигается на 14 сут и составляет 57% (рис. 2). Можно полагать, что причиной резкого увеличения уровня -линоленовой кислоты в липидах является превалирование скорости синтеза этой кислоты над скоростью ее трансформации в дигомо-у-линоленовую кис-
лоту, катализируемой элонгазой. В пользу такого предположения свидетельствует снижение уровня предшественников у-линоленовой кислоты (пальмитиновой, олеиновой и линоле-новой кислот) после 13 сут культивирования гриба и практически полное отсутствие продукта ее элонгации (С20:3п6) в липидах гриба ГР-1 в этот период времени.
о н о
о4
H О
4
О
5 «
X
Я
К Л S
N <u S
к
es N
Л
tu «
о О
lOO 9O sO JO
6O
5O 4O 3O 2O lO O
9l
sj
2O
□ С16-С18 ^2O:3n6 58 □ lS:3n6
16
1,12
41
3б,б
3б,3
3,41 3,95
I
б,22
3,94
O O
бб
1O
14
18
23
Время, сут
Рис. 3. Динамика содержания фракции С16-С18 жирных кислот, -линоленовой и дигомо- -линоленовой кислот в липидах гриба Mortierella alpina 18-1, растущего на среде ОГЦ с 1% глицерина
4
5
s
Следует отметить, что лимитирующая роль элонгазы была показана ранее для гриба Mortierella alpina 1S-4 14 при сравнении состава липидов, полученных на среде с глюкозой и на средах с твинами. Уровень арахидоновой кислоты в расчете на обезжиренную биомассу не зависел от источника углерода, тогда как уровень 18:1, 18:2 и 18:3 в липидах, полученных на среде с твинами, значительно превышал долю этих соединений в липидной фракции мицелия, выращенного на глюкозе. В грибах Mortierella alpina 1S-4 обнаружена и охарактеризована элонгаза, специфичная к -линолено-вой 18:3 и стеаридоновой 18:4 кислотам, превращающая эти соединения в дигомо- -линоле-новую и эйкозатетраеновую кислоты, соответственно 15. Ключевая роль этого фермента в синтезе полиненасыщенных жирных кислот доказана на молекулярном уровне. Введение гомологичного гена (GLELOp), кодирующего данную элонгазу в грибы Mortierella alpina IS-4 приводило к снижению уровня у-линоле-новой кислоты в липидах трансформанта и обогащению их арахидоновой кислотой 16.
При анализе динамики уровня сопутствующих кислот в липидах гриба 18-1 было обнаружено, что максимальный уровень С16-С18-предшественников дигомо- -линоленовой кислоты (в том числе у-линоленовой кислоты — непосредственного субстрата элонгазы) приходится на 5—8 сут культивирования продуцента (рис. 3). В период интенсивного синтеза ара-хидоновой кислоты (рис. 1) уровень С16-С18-
жирных кислот снижается до 35% (рис. 3). При этом содержание в липидах гриба Mortierella alpina 18-1 самого продукта элонгации (дигомо- -линоленовой кислоты) остается низким (не более 6%) на протяжении всего периода культивирования микроорганизма в результате быстрой конверсии этого соединения в арахидоновую кислоту с помощью D5-десатуразы.
Таким образом, полученные результаты показывают существенную разницу в кинетике накопления промежуточных метаболитов в синтезе арахидоновой кислоты грибом Mortierella alpina 18-1 и его глицеринустойчи-вым мутантом ГР-1.
Экспериментальная часть
Выращивание грибов проводили методом поверхностного культивирования на плотной питательной среде ОГЦ (овсяная крупа — 12%, глицерин 1%, сульфат цинка 0.01%) при температуре 25 оС на чашках Петри в течение 21 сут. Питательную среду стерилизовали в автоклаве в течение 30 мин при температуре 120 оС. Инокулят наносили на поверхность среды в центре чашки Петри. Выращенную биомассу собирали, трижды промывали дистиллированной водой и высушивали в сушильном шкафу до постоянного веса при температуре 65 оС. Липиды экстрагировали из сухого мицелия трехкратной обработкой гексаном. Для определения жирнокислотного состава
грибных липидов получали метиловые эфиры жирных кислот, как описано в работе 17.
Идентификацию метиловых эфиров ЖК проводили на хроматомасс-спектрометре HP-5896 c масс-селективным детектором HР-5972А, стеклянной капиллярной колонкой длиной 50 м, 5% фенилметилсиликона на HР-5, температура ионного источника 120 оС, ускоряющее напряжение 3 кВ, энергия ионизации 70 эВ. Режим изменения температуры колонки программировали со скоростью 10 град/мин от 50 до 250 оС.
Литература
1. Зорин В. В., Петухова H. И., Шахмаев Р. H. // Российский химический журнал (Журнал Росс. Хим. Общества им. Д. И. Менделеева).— 2011.- Т.55, №1.- С.77.
2. Плетнев М. Ю. //Биотехнология.— 2009.— №1.- С.3.
3. Рахматуллина Ю. Р., Петухова H. И., Авдеева Е. H., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.— 2005.— Т.12, №1.- С.49.
4. Петухова H. И., Рахматуллина Ю. Р., Яхуто-ва Я. Р., Спирихин Л. В., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2006.- Т.13, №1.- С.95.
5. Петухова H. И., Рахматуллина Ю. Р., Пантелеева С. H., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.—
2007.- Т.14, №1.- С.141.
6. Hou C. T. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol.-
2008.- V.35.— P.501.
7. Ceron Garcea M. C., Fernandez Sevilla J. M., Acien Fernandez F. G., Molina Grima E., Garcea Camacho F. // J. Appl. Phycol.- 2000.- V.12.-P.239.
8. Chi Z., Pyle D., Wen Z., Frear C., Chen S. // Process Biochemistry.- 2007.- V.42.- P.1537.
9. Athalye S. K., Garcia R. A., Wen Z. // J. Agric. Food Chem.- 2009.- V.57.- P.2739.
10. Eroshin V. K., Satroutdinov A. D., Dedyukhina E. G. // Proc. Biochem.- 2000.- V.35.- P.1171.
11. Петухова H. И., Митягина А. В., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2010.- Т.17, №5.- С.50.
12. Давлетбаев И. М., Петухова H. И., Зорин В. В. // Баш. хим. ж.- 2003.- Т.10, №1.- С.50.
13. Certik M., Sakuradani E., Shimizu S. // Tibtech December.- 1998.- V.16.- P.500.
14. Wynn J. P. and Ratledge C. // Microbiology.-2000.- V.146.— P.2325.
15. Parker-Barnes J. M., Das T., Bobik E., Leonard A. E., Thurmond J. M. // PNAS, 2000.- V.97, №15.8284.
16. Wynn J. P., Ratledge C. // Lipids.- 2005.-V.40, №1.- P.25.
17. А. С. 968072. СССР, МКИ С 12 Й 1/100./ Сул-танович Ю. А., ^чаев А. П., Барсукова И. А. // Б.И.— 1982.- №39.- С.223.
Количественный анализ состава полученных препаратов метиловых эфиров жирных кислот осуществляли на хроматографе Хроматэк Кристалл с пламенно-ионизационным детектором на капиллярной колонке 60 т х 0.32 тт ГО Solgel-Wax х 0.5 цт. Режим анализа: температура термостата колонки — 250 оС, температура детектора — 320 оС, температура испарителя — 320 оС, скорость газа-носителя (азот) — 27.5 мл/мин.
Literature
1. Zorin V. V., Petukhova N. I., Shakhmaev R. N. // Rossiyskiy khimicheskiy zhurnal (Zhurnal Ross.Khim.Ob-va im D.I.Mendeleeva).- 2011.— V.55, №1.- P.77.
2. Pletnev M. Yu. // Biotekhnologiya.- 2009.-№1.- P.3.
3. Rakhmatullina Yu. R., Petukhova N. I., Avde-eva E. N., Zorin V. V. // Bashkirskiy khimicheskiy zhurnal.- 2005.- V.12, №1.- P.49.
4. Petukhova N. I., Rakhmatullina Yu. R., Yakhutova Ya. R., Spirikhin L. V., Zorin V. V. // Bashkirskiy khimicheskiy zhurnal.- 2006.-V.13, №1.- P.95.
5. Petukhova N. I., Rakhmatullina Yu. R., Pante-leeva S. N., Zorin V. V. // Bashkirskiy khi-micheskiy zhurnal.- 2007.- V.14, №1.- P.141.
6. Hou C. T. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol.-2008.- V.35.- P.501.
7. Ceron Garcea M. C., Fernandez Sevilla J. M., Acien Fernandez F. G., Molina Grima E., Garcea Camacho F. // J. Appl. Phycol.- 2000.- V.12.-P.239.
8. Chi Z., Pyle D., Wen Z., Frear C., Chen S. // Process Biochemistry.- 2007.- V.42.- P.1537.
9. Athalye S. K., Garcia R. A., Wen Z. // J. Agric. Food Chem.- 2009.- V.57.- P.2739.
10. Eroshin V. K., Satroutdinov A. D., Dedyukhi-na E. G. // Proc. Biochem.- 2000.- V.35.-P. 1171.
11. Petukhova N. I., Mityagina A. V., Zorin V. V. // Bashkirskiy khimicheskiy zhurnal.- 2010.-V.17, №5.- P.50.
12. Davletbaev I. M., Petukhova N. I., Zorin V. V. // Bashkirskiy khimicheskiy zhurnal.- 2003.-V.10, №1.- P.50.
13. Certik M., Sakuradani E., Shimizu S. // Tibtech December.- 1998.- V.16.- P.500.
14. Wynn J. P. and Ratledge C. // Microbiology.-2000.- V.146.- P.2325.
16. Parker-Barnes J. M., Das T., Bobik E., Leonard A. E., Thurmond J. M. // PNAS, 2000.- V.97, №15.- 8284.
16.
17.
Wynn J. P., Ratledge C. // Lipids.- 2005.-V.40, №1.- P.25.
A. S. 968072. USSR, MKI S 12 Y 1/100./ Sultanovich Yu. A., Nechaev A. P., Barsukova I. A. // B.I.- 1982.- №39.- P.223.
