CC BY
10CATALYSIS
Статья поступила в редакцию 20.05.13. Ред. рег. № 1641
The article has entered in publishing office 20.05.13. Ed. reg. No. 1641
УДК 541.135.5:547
ВЛИЯНИЕ ПОТЕНЦИАЛА ЭЛЕКТРОДА НА ПАРАМЕТРЫ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ПРОИЗВОДНЫХ ФЕНОЛА В ПРИСУТСТВИИ ЛАККАЗЫ
1 2 М.А. Осина , В.А. Богдановская
Национальный исследовательский университет «МЭИ» 111250 Москва, ул. Красноказарменная, д. 14 Тел.: (495) 362-27-33; e-mail: OsinaMA@mpei.ru 2Институт физической химии и электрохимии им. А.Н. Фрумкина РАН 119991 Москва, Ленинский пр., д. 31 Тел.: (495) 952-53-08, e-mail: bogd@elchem.ac.ru
Заключение совета рецензентов: 25.05.13 Заключение совета экспертов: 28.05.13 Принято к публикации: 30.05.13
Изучены электрохимические реакции субстратов лакказы: пирокатехина, допамина и 2-амино-4-хлорфенола на пиро-углероде. Исследовано влияние субстратов на ток восстановления О2 на пироуглеродном электроде с композитом лакка-за-нафион и потенциала электрода на кинетические параметры биоэлектрокаталитических реакций. Показано, что селективное определение концентрации данных субстратов по току восстановления продуктов ферментативного окисления лакказой возможно при Е < 0,3 В (Ag/AgCl).
Ключевые слова: биоэлектрокатализ, композитный материал, лакказа, нафион, фенолы.
THE EFFECT OF ELECTRODE POTENTIAL ON THE PARAMETERS OF THE ELECTROCHEMICAL DETERMINATION OF THE CONCENTRATION OF DERIVATIVES OF PHENOL IN THE PRESENCE OF THE LACCASE
M.A. Osina1, V.A. Bogdanovskaya2
'National Research University "Moscow Power Engineering Institute" 14 Krasnokazarmennaya str., Moscow, 111250, Russia Tel.: (495) 362-27-33; e-mail: OsinaMA@mpei.ru 2A.N. Frumkin Institute of Physical Chemistry and Electrochemistry, RAS 31 Leninsky pr., Moscow, 119991, Russia Tel.: (495) 952-53-08, e-mail: bogd@elchem.ac.ru
Referred: 25.05.13 Expertise: 28.05.13 Accepted: 30.05.13
The electrochemical reactions of substrates of laccase such as pyrocatechol, dopamine and 2-amino-4-chlorophenol at pyrographite were studied. The influences of substrates onto the reduction current of О2 at pyrographite electrode with laccase-Nafion composite and the effect of the potential on the kinetic parameters of bioelectrocatalytic reactions were investigated. It was shown that the selective determination of the concentration of the given substrates by the reduction current of their enzymatic oxidation products in the presence of laccase is achieved at E < 0.3 V (Ag/AgCl).
Keywords: bioelectrocatalysis, composite material, laccase, Nafion, phenols.
В настоящее время перспективы использования биологических материалов в целях электрокатализа вызывают повышенный интерес. Постоянно в центре внимания исследователей находится практическая область применения биокатализаторов - ферментные электроды (ФЭ) [1-4].
Уникальные свойства катализаторов белковой природы: высокая каталитическая активность и селективность - делают их особенно привлекательными при создании аналитических сенсорных систем. Такие системы могут обеспечить проведение мониторинга и экспресс-анализа без предварительной
International Scientific Journal for Alternative Energy and Ecology № 06/1 (127) 2013
© Scientific Technical Centre «TATA», 2013
подготовки проб, в том числе окрашенных и суспендированных образцов.
Ферментные электроды, промотированные лакка-зой, представляются интересными объектами для изучения с целью создания биоспецифических электродов для определения концентрации фенольных соединений. Наиболее перспективной областью применения таких устройств является медицинская практика. Например, интерес со стороны медико-биологических исследований представляет определение катехоламинов: адреналина, норадреналина, допамина, которые выполняют в живых организмах роль нейротрансмиттеров, определение их концентрации необходимо для диагностики образования некоторых опухолей.
ФЭ для определения фенолов, обсуждаемые в литературе, являются, как правило, электродами ампе-рометрического типа, которые регистрируют ток восстановления продуктов ферментативного окисления фенолов оксидазами [5, 6]. Основное внимание исследователей при разработке ФЭ сосредоточено на поисках методов иммобилизации фермента, позволяющих в наибольшей степени сохранить каталитическую активность белка и повысить чувствительность и стабильность электрода [5, 7-9].
Параметры ФЭ в большинстве случаев подбираются эмпирическим путем. Сущность процессов и механизм реакций, протекающих на электродах при определении тех или иных субстратов, позволяющие сформулировать теоретические представления о методах и путях использования биокатализаторов для аналитических целей, остаются не выясненными.
Для выяснения закономерностей и оптимизации условий биоамперометрического определения фе-нольных субстратов с помощью ФЭ было исследовано влияние потенциала электрода на ток восстановления продуктов их ферментативного окисления лакказой.
В ферментативном катализе лакказа осуществляет четырехэлектронное восстановление кислорода, используя в качестве доноров электронов различные ароматические амины и фенолы [10]:
лакказа
субстрат + О2 ^ продукт + Н2О.
HO
NH2
NH,
Cl
b
Рис. 1. Структурные формулы фенольных соединений: а - пирокатехин; b - допамин; c - 2-амино-4-хлорфенол Fig. 1. Schematic of the molecular structure of phenolic compounds: a - pyrocatechol; b - dopamine; c - 2-amino-4-chlorophenol
Электрохимическое поведение электронодонор-ных субстратов лакказы пирокатехина (ПКХ), допамина и 2-амино-4-хлорфенола (рис. 1) было исследовано на электроде из пироуглерода.
Из данных, представленных на рис. 2, следует, что квазиобратимое окисление субстратов происходит при потенциалах, близких к 0,35 В, с образованием электрохимически активных продуктов.
Рис. 2. Циклические вольтамперограммы, полученные на электроде из пироуглерода в цитратно-фосфатном буферном растворе, содержащем в концентрации 10-4 М: 1 - пирокатехин; 2 - допамин; 3 - 2-амино-4-хлорфенол. Атмосфера - аргон, рН 4,5, v = 0,05 В/с Fig. 2. Cyclic voltamperograms, obtained on the electrode from pyro-carbon in the citrate-phosphate buffer solution, which contains in the concentration 10-4 M: 1 - pyrocatechol; 2 - dopamine; 3 - 2-amino-4-chlorophenol. Atmosphere - argon, рН 4.5, v = 0.05 V/s
Поскольку при ферментативном окислении ПКХ, допамина и 2-амино-4-хлорфенола образуются те же продукты, что и в электрохимическом процессе, а реакция, катализируемая лакказой, имеет высокую скорость, определение концентрации этих соединений возможно по току восстановления продуктов ферментативного окисления.
Для изучения механизма и выяснения параметров процессов, протекающих на ферментном электроде в присутствии фенольных субстратов, использовали электрод из пироуглерода, модифицированный композитом лакказа-нафион. Методика изготовления композитного электрода подробно изложена в [11].
На электроде с композитом в присутствии кислорода устанавливается потенциал, близкий по величине к равновесному кислородному потенциалу, и протекает реакция электровосстановления кислорода по механизму прямого биоэлектрокатализа [12]. При этом фермент в иммобилизованном на электроде состоянии участвует в переносе электронов между
Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология» № 06/1 (127) 2013 © Научно-технический центр «TATA», 2013
а
c
электродом и кислородом, роль электронодонорного субстрата лакказы выполняет электрод. Схема процесса представлена на рис. 3, а.
о г
ж-
ог
'Н]0 пирокатехин + Oj
пирокатехин
н:о a
b
Рис. 3. Схема катодных процессов на электроде с иммобилизованной лакказой: а - в отсутствие; b - в присутствии электронодонорного субстрата Fig. 3. Diagram of cathodic processes on the electrode with the immobilized laccase: a - in the absence; b - in the presence of electrondonor substrate
Рис. 4. Поляризационные кривые, полученные на вращающемся дисковом электроде из пироуглерода с нанесенным композитом лакказа-нафион - 1, 2 и без композита - 3, 4. Кривые 1, 3 - получены в атмосфере кислорода в отсутствие в растворе пирокатехина; 2, 4 - в присутствии в объеме раствора пирокатехина в концентрации 10-5 М; 5 - аддитивная кривая, полученная при сложении кривых 2, 4 Fig. 4. The polarograms, obtained on the revolving disk electrode from pyrocarbon with the substituted composite
laccase-Nafion - 1, 2 and without composite - 3, 4. Curves 1, 3 - are obtained in a atmosphere of oxygen in the absence in the solution pyrocatechol; 2, 4 - in the presence in the volume of the solution pyrocatechol in the concentration 10-5 M; 5 - the additive curve, obtained during the addition of curves 2, 4
Поляризационная кривая, наблюдаемая на электроде с композитом в растворе, содержащем кислород, и отвечающая процессу биоэлектрокаталитиче-ского восстановления кислорода, представлена на рис. 4 (кривая 1). Восстановление кислорода на композитном электроде протекает непосредственно до воды в области потенциалов 0,70-0,10 В (здесь и далее все потенциалы приведены относительно АЕ/ЛМС1).
При введении в объем раствора органического субстрата, например, пирокатехина, в системе параллельно протекают три реакции: ферментативное окисление ПКХ кислородом, биоэлектрохимическое восстановление кислорода лакказой и электрохимическое восстановление продукта ферментативного окисления ПКХ - хинона (рис. 3, Ь). Вид поляризационной кривой восстановления кислорода на электроде с композитом изменяется (рис. 4, кривая 2). Прежде всего, стационарный потенциал смещается в сторону более отрицательных значений (кривые 1, 2). Величины тока, регистрируемые при записи поляризационной кривой, при Е > 0,3 В уменьшаются по сравнению с токами восстановления кислорода (при соответствующих потенциалах) и увеличиваются при Е < 0,3 В. Наблюдаемые изменения величин тока био-электрокаталитического восстановления кислорода могут быть вызваны протеканием двух параллельных процессов: ферментативного окисления ПКХ в каталитическом слое и его электроокисления/восстановления на пироуглероде. Для выяснения природы токов, наблюдающихся на композитном электроде в растворе, содержащем кислород и ПКХ, необходимо рассмотреть окислительно-восстановительные превращения последнего на электроде из пироуглерода.
Поляризационная кривая, записанная от потенциала 0,7 В на электроде из пироуглерода в растворе, содержащем ПКХ и О2, приведена на рис. 4 (кривая 4). Анодный участок кривой, наблюдаемый вплоть до Е = 0,3 В, соответствует электроокислению ПКХ. При увеличении поляризации электрода в системе протекает катодный ток. Наблюдаемый предельный ток соответствует восстановлению о-хинона, незначительное количество которого образуется при электрохимическом окислении ПКХ и находится в объеме раствора. Потенциалы точек пересечения кривой 4 с нулевой линией тока и кривых 1 и 2 близки между собой и соответствуют значению потенциала ре-докс-превращения ПКХ (0,3 В). Это указывает на то, что перегиб на поляризационной кривой 2 обусловлен началом электровосстановления продукта окисления ПКХ.
В предположении, что ферментативный процесс в каталитическом слое отсутствует, величина тока на композитном электроде в присутствии О2 и пирокатехина (/Е) включает следующие составляющие:
L = IO + Г
Ъ O9 П]
при Е > 0,3 В;
(1)
1ъ= IС2 + 1ПР
при Е < 0,3 В,
(2)
International Scientific Journal for Alternative Energy and Ecology № 06/1 (127) 2013
© Scientific Technical Centre «TATA», 2013
где /0 - ток биоэлектрокаталитического восстановления О2, С, /ПР - токи электрохимического окисления ПКХ и восстановления образовавшегося при этом продукта соответственно. Аддитивная кривая, полученная при сложении тока, протекающего при поляризации пироуглеродного электрода в аэрированном растворе ПКХ (рис. 4, кривая 4), и тока биоэлектрокаталитического восстановления О2 на композитном электроде (рис. 4, кривая 1) показана на рис. 4 пунктирной линией (кривая 5). Данная кривая характеризует влияние электрохимических реакций окисления и восстановления ПКХ на вид поляризационной кривой электровосстановления О2 на композитном электроде. Из рисунка следует, что присутствие ПКХ в объеме раствора приводит к снижению токов восстановления кислорода на композитном электроде при Е > 0,3 В и их незначительному увеличению при Е < 0,3 В.
В реальных условиях, параллельно с реакциями биоэлектрокаталитического восстановления О2 на композите и электроокисления/восстановления ПКХ на пироуглероде, в композитном слое, содержащем лакказу, проходит ферментативное окисление пирокатехина. При Е > 0,3 В ферментативное и электрохимическое окисление являются конкурирующими процессами. Это приводит к снижению количества субстрата, окисляющегося на электроде электрохимическим путем. Выражение для величины тока, протекающего на композитном электроде при потенциалах более положительных, чем редокс-потенциал ПКХ, в данной ситуации приобретает вид
I = I +(р -1' )
O2 V пкх пкх / '
(3)
где величина /^ - ток, эквивалентный количеству ПКХ, окисленного ферментативным путем.
Таким образом, величины катодных токов, наблюдаемых в реальных условиях на композитном электроде в присутствии ПКХ (рис. 4, кривая 2), выше по сравнению с величинами, рассчитанными в предположении об отсутствии ферментативного процесса (кривая 5).
Так как ферментативное и электрохимическое окисление ПКХ протекает с образованием одинакового продукта - о-хинона, восстановление которого на пироуглероде наблюдается при Е < 0,3 В, величина тока на композитном электроде при потенциале ниже редокс-потенциала ПКХ, имеет следующие составляющие:
I = I + Г +1'
2Е Oj -'пр^-'пр-
(4)
где /_пр и /' - токи восстановления о-хинона, образовавшегося, соответственно, при электрохимическом и ферментативном окислении пирокатехина.
Данное уравнение отличается от (2) слагаемым /' . Это указывает на то, что рост катодного тока, наблюдаемый на композитном электроде в растворе,
содержащем О2 и ПКХ (кривая 2) при Е < 0,3 В, обусловлен восстановлением о-хинона, образующегося при ферментативном окислении ПКХ.
Близкое по характеру влияние на вид поляризационной кривой восстановления кислорода оказывают допамин и 2-амино-4-хлорфенол, окисляющиеся с образованием электрохимически активных продуктов.
В подтверждение данных по влиянию присутствия органических субстратов на ток восстановления О2 на композите лакказа-нафион при введении в объем раствора фенольного соединения в зависимости от потенциала электрода (рис. 5) наблюдается увеличение (кривые 3-8) или снижение (кривые 1, 2) катодного тока.
Рис. 5. Зависимость величин токов, измеренных на электроде с композитом, от концентрации фенольных субстратов при потенциале, В: 1 - 0,60; 2 - 0,40; 3, 5, 7 - 0,20; 4, 6, 8 - 0,10. Хроноамперометрические кривые получены при введении (указано стрелками) 1 мкМ: 1-4 - пирокатехина; 5, 6 - допамина; 7, 8 - 2-амино-4-хлорфенола. Время установления постоянного тока - 1 мин Fig. 5. Dependence of the current strengths, measured on the electrode with the composite, from the concentration of phenol substrata with the potential, V: 1 - 0.60; 2 - 0.40; 3, 5, 7 - 0.20; 4, 6, 8 - 0.10. Chronoamperometric curves are obtained during the introduction (indicate by pointers) 1 |xM:
1-4 - pyrocatechol; 5, 6 - dopamine; 7, 8 - 2-amino-4-chlorophenol. Time of the establishment of direct current - 1 min
Важно подчеркнуть, что в реальных растворах методика измерения тока превращения субстрата при потенциалах, где возможно его окисление на пироуг-лероде (при Е > 0,3 В), имеет существенный недостаток: отсутствует селективность определения. В то же время измерение концентрации фенольных производных по току восстановления продуктов ферментативного окисления обеспечивает их селективное определение в многокомпонентных растворах.
Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология» № 06/1 (127) 2013 © Научно-технический центр «TATA», 2013
Из данных, представленных на рис. 5, следует, что величина тока восстановления продукта ферментативной реакции (отклика электрода на введение субстрата) тем больше, чем отрицательнее значение потенциала (кривые 2, 4, 6). Смещение потенциала электрода в катодную область (< 0,1 В) хотя и способствует наиболее полному восстановлению продуктов ферментативного окисления, но приводит к значительному увеличению фонового тока (рис. 4, кр. 1), поскольку при потенциалах, близких к нулю, начинается реакция восстановления кислорода на пироуглероде.
Зависимости тока отклика ферментного электрода от концентрации фенолов были получены при Е = 0,1 В. Линейный интервал определения для пирокатехина, допамина и 2-амино-4-хлорфенола составил, мкМ: 0,50-50,0; 1,0-40,0 и 0,05-5,0 соответственно. Нижняя граница линейного диапазона отклика электрода в каждом случае соответствует пределу обнаружения субстрата.
Таким образом, совокупность данных, полученных при изучении электрохимических реакций субстратов лакказы на пироуглероде и их влияние на ток восстановления О2 на пироуглеродном электроде с композитом лакказа-нафион, позволила проанализировать механизм параллельных процессов, протекающих на композите лакказа-нафион в присутствии фенольных соединений, и определить область потенциалов, обеспечивающую селективное определение концентрации субстратов.
Работа выполнена при использовании оборудования ЦКП «Водородная энергетика и электрохимические технологии» и финансовой поддержке Минобр-науки РФ (ГК 16.552.11.7078).
Список литературы
1. Davis F., Higson S.P.J. Biofuel cells - recent advances and applications // Biosensors and Bioelectronics. 2007. Vol. 22. P. 1224-1235.
2. Tsujimura S., Kano K., Ikeda T. Bilirubin oxidase in multiple layers catalyzes-electron reduction of dioxygen to water without redox mediators // J. Electroanal. Chem. 2005. Vol. 576. P. 113-120.
3. Katz E., Shipway A.N., Willner I. Медиаторы электронного переноса.
http://chem.kcn.ru/science/Katz1/content.htm.
4. Brunel L., Denele J., Servat K., Jolivalt C., Innocent C., Cretin M., Rolland M., Tingry S. Oxygen transport through laccase biocathodes for a membrane-less glucose/O2 biofuel cell // Electrochem. Commun. 2007. Vol. 9. P. 331-336.93.
5. Ярополов А.И., Шлеев С.В., Морозова О.В., Зайцева Е.А., Марко-Варга Г., Эмнеус Е., Гортон Д. Амперометрический биосенсор для определения фенольных соединений на основе лакказы // Ж. аналитической химии. 2005. Т. 60. С. 624-628.
6. Dimcheva N., Horozova E. Horseradish peroxidase-bazed organic-phase enzyme electrode // Anal. Bioanal. Chem. 2005. Vol. 382. P. 1374-1379.
7. Bartlett P., Cooper J. A review of the I
'IT)
immobilization of enzymes in electropolymerized films // J. Electroanal.Chem. 1993. Vol. 362. P. 1-12.
8. Mao F., Mano N., Heller A. Long Tethers Binding Redox Centers to Polymer Backbones Enhance Electron Transport in Enzyme "Wiring" Hydrogels // J. Am. Chem. Soc. 2003. Vol. 125. P. 4951-4957.
о
9. Богдановская В.А. Биоэлектрокатализаторы и перспективы создания биотопливных элементов на их основе // Альтернативная энергетика и экология -ISJAEE. 2010. № 5. С. 129-131.
10. Solomon E.I, Sundaram U.M., Machonkin T.E. Multicopper oxidases and oxygenases // Chem. Rev. 1996. Vol. 96. P. 2563-2605.
11. Осина М.А., Богдановская В.А., Тарасевич М.Р. Биоамперометрическое определение производных фенола с использованием композита лакказа-нафион // Электрохимия. 2003. Т. 39. С. 450-456.
12. Тарасевич М.Р., Богдановская В.А., Кузнецова Л.Н. Биоэлектрокаталитическое восстановление кислорода в присутствии лакказы, адсорбированной на углеродных электродах // Электрохимия. 2001. Т. 37, № 8. С. 969-974.
International Scientific Journal for Alternative Energy and Ecology № 06/1 (127) 2013
© Scientific Technical Centre «TATA», 2013
