CC BY
105
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.60
БИОКАТОДЫ НА ОСНОВЕ ЛАККАЗ В БИОТОПЛИВНЫХ ЭЛЕМЕНТАХ. МИНИ-ОБЗОР
В.И. Голикова, Т.А. Гордеева, С.В. Алферов
В обзоре просуммирована актуальная и наглядная информация, касающаяся ферментных биотопливных элементов (ФБТЭ) на основе лакказ. Данный обзор помогает сделать необходимые выводы для дальнейшей разработки эффективного биотопливного элемента, использующего лакказы на катоде для достижения прямого переноса электронов.
Ключевые слова: лакказа, ферментный биотопливный элемент, биосенсор, прямой перенос электрона, лакказный катод, иммобилизация лакказ.
Ферментные биотопливные элементы
Необходимость электрического питания миллиардов электронных устройств, таких как мобильные телефоны или компьютеры, приводит к производству бесчисленного количества литиевых батарей, создавая при этом реальную проблему для здоровья человека. Кроме того, постоянно увеличивающееся истощение запасов ископаемого топлива и необходимость в «чистых» методах производства электроэнергии поспособствовали появлению новых источников устойчивой и возобновляемой электроэнергии без выбросов парниковых газов или загрязнения окружающей среды. Среди этих альтернативных источников производство электроэнергии благодаря биотопливным элементам (БТЭ) представляет собой быстро развивающуюся область.
Несмотря на то что первый пример биотопливного элемента был представлен в 60-х г. [1], эти перспективные устройства оставались малоизученными вплоть до конца 90-х гг. С начала 2000-х гг. были достигнуты колоссальные успехи в области биотопливных элементов, о чём свидетельствует экспоненциальный рост научных публикаций, посвящённых данной теме. Так, например, согласно базе данных ScienceDirect с ключевым словом «biofuel cell» (биотопливный элемент) в 2000 году опубликовано 36 статей, в 2010 году уже - 368, а в 2019 количество статей достигло 1507.
Ферментный биотопливный элемент (ФБТЭ) является подклассом топливных элементов, где используются очищенные окислительно-восстановительные ферменты для специфического окисления субстратов (спиртов, водорода, лактата, сахаров, таких как глюкозы, фруктозы, лактозы или целлобиозы) на аноде и восстановления окислителей (O2, H2O2) на катоде с целью получения электроэнергии [2]. Подавляющее
большинство этих биотопливных элементов вырабатывают электроэнергию за счет электро-ферментного расщепления глюкозы и восстановления кислорода.
В связи с присутствием некоторых видов субстратов (глюкозы и лактата) в физиологических жидкостях другой важной мотивацией для развития биотопливных элементов является производство электроэнергии для использования in vivo в организме человека. На данный момент исследования в этой области развиваются в двух направлениях. Первое направление - это ферментативные имплантированные биотопливные элементы, которые используют в качестве биотоплива глюкозу, присутствующую в крови или интерстициальных жидкостях. Второе - это неинвазивные топливные элементы, использующие лактат из систем потоотделения человека. Первый подход предназначен для питания имплантированных медицинских устройств, таких как кардиостимуляторы, мышечные стимуляторы, неврологические стимуляторы, датчики, вторые же используются для сбора энергии от человека для питания носимой электроники [3 - 5].
Общим аспектом во всех этих примерах ФБТЭ является необходимость кислород-восстанавливающего биокатода. Подавляющее большинство таких устройств базируется на лакказах или билирубиноксидазах (БОД).
Общая характеристика лакказ
Лакказа - фермент, относящийся к классу голубых медьсодержащих оксидаз, преимущественно распространённых среди растений и грибов. Впервые этот фермент был обнаружен в японском лаковом дереве Rhus vernicifera [6]. С тех пор эти ферменты идентифицировали в различных видах растений, насекомых и бактерий [7, 8]. Большинство детально изученных в настоящее время лакказ выделены из различных грибов [9, 10]. Основными функциями грибных лакказ считаются участие в процессах образования и деградации лигнина, в морфогенезе гриба, во взаимодействии паразит / хозяин, а также в защите от стресса. Большинство грибов продуцируют несколько изоформ и изоферментов лакказ. Хотя большинство грибных лакказ являются мономерными белками, в литературе описаны ферменты, состоящие из нескольких субъединиц. Молекулярный вес мономера варьируется от 50 до 130 кДа. Лакказы являются гликопротеинами. Содержание углеводной части, состоящей, как правило, из маннозы, N-ацетилглюкозамина и галактозы, составляет от 10 до 45 % от массы белка. Считается, что углеводная часть отвечает за стабильность фермента [11, 12].
Активный центр лакказы содержит четыре иона меди. Их классифицируют на три группы в зависимости от характеристик, полученных с помощью излучения УФ видимой области и электронного
парамагнитного резонанса (ЭПР). Один из медных центров относится к первому типу (Т1), а остальные образуют трехъядерный Т2/Т3 кластер, содержащий один ион меди второго типа (Т2) и два иона меди третьего типа (Т3) [13, 14]. Ион меди Т1 отвечает за интенсивную голубую окраску фермента и имеет ярко выраженное электронное поглощение, приблизительно 600 нм (ЭПР). Ион меди Т2 бесцветен, но обнаруживается с помощью ЭПР; ион меди Т3 состоит из пары атомов меди, которые характеризуются слабым поглощением вблизи УФ-спектра и отсутствием сигнала ЭПР [15, 8]. Ион меди Т1 расположен на расстоянии около 12 Á от Т2/Т3 кластера, а расстояние между ионами меди Т2 и Т3 составляет порядка 4 Á. Т1 центр лакказ является первичным акцептором электронов от субстратов-доноров. Для некоторых лакказ определён редокс-потенциал Т1 центра, который для большинства грибных лакказ составляет ~750-780 мВ (отн. НВЭ), а для растительных лакказ 420-440 мВ (отн. НВЭ) [16]. Значение редокс-потенциалов Т1 центра лакказ имеет большое значение при каталитическом окислении различных субстратов.
В течение последних двух десятилетий повышенное внимание уделяется биоэлектрохимическим аспектам функционирования лакказ. В этой области лакказы применяли для создания биосенсоров по обнаружению фенолов в сточных водах и детекции полифенольных соединений в пищевой промышленности и для разработки биотопливных элементов. Лакказы также используются в целлюлозно-бумажной промышленности для отбеливания, делигнификации целлюлозы и для производства новых бумажных изделий.
Методы иммобилизации лакказ в ФБТЭ
Достижение низкопотенциального четырёхпротонного / четырёхэлектронного восстановления кислорода в воде при нейтральном значении рН является одной из наиболее сложных электрокаталитических реакций. В то время как большинство металлических катализаторов требуют высоких перенапряжений, иммобилизованные на электроде медьсодержащие оксидазы, такие как лакказы и билирубиноксидазы, продемонстрировали исключительные характеристики для реакции восстановления кислорода при среднем значении рН [17]. При рН=5 термодинамический редокс потенциал пары O2/H2O достигает +0,93 В (отн. НВЭ). При эффективной сшивке на поверхности электродов лакказы из таких организмов, как Trametes versicolor или Trametes hirsuta, электрокаталитическое восстановление O2 достигается при значении рН=4-7 при низком перенапряжении в 30-70 мВ [18 - 20].
Какими бы ни были методы иммобилизации лакказы (ковалентными или нековалентными), для доставки электронов в медный кластер T2/T3, где происходит связывание и разрывание связей кислород-
кислород, используются два способа переноса электронов - медиаторный и прямой перенос электронов.
Прямой перенос электрона (ППЭ). Если медные активные центры фермента находятся достаточно близко к поверхности электрода, то может осуществиться ППЭ между ферментом и электродом. Поскольку электрон может быть транспортирован лишь на расстояние около 2,5 нм [21], ППЭ между поверхностью электрода и лакказой возможен только в том случае, если фермент удачно ориентирован относительно поверхности электрода. Фермент считают удачно ориентированным, если его активный центр Т1 находится достаточно близко к электроду для осуществления прямого переноса (рис. 1).
Рис. 1. Возможный механизм прямого переноса электрона
для лакказ [22]
В работе [23, 24] изучали медные ферментно-модифицированные углеродные электроды. Оказалось, что важным преимуществом ППЭ является то, что биоэлектрокаталитическое восстановление кислорода достигается при редокс-потенциале медного активного центра Т1, который отвечает за электронный перенос от электрода к медному кластеру Т2/Т3. При этом не требуется редокс-медиатор, и кислород может быть восстановлен при исключительно низких потенциалах, особенно для высокопотенциальных лакказ. С практической точки зрения, отсутствие окислительно-восстановительных посредников упрощает процесс изготовления биокатодов и устраняет их токсичное влияние, возникающее в результате возможного выделения дополнительных редокс-соединений. Таким образом, ППЭ является оптимальным методом переноса для биокатодов.
Одним из наиболее простых методов иммобилизации является физическая адсорбция на графитовых электродах [24]. Данный метод иммобилизации основан на случайной адсорбции молекул белка на поверхности электрода, что может привести к полному отсутствию
правильной ориентации фермента и, как следствие, отсутствию ППЭ. Например, золотые электроды не показали никакого ППЭ для лакказ лакказ Coriolus h. и Rhus v. [25], однако наноструктурированные поверхности золота и наночастицы золота могут способствовать ППЭ с лакказы [26]. Именно поэтому перед закреплением фермента проводят модификацию электродов с помощью наноструктурированных материалов [27 - 30].
Электроды также могут быть модифицированными различными полициклическими ароматическими соединениями. В качестве таких соединений могут использоваться аналоги субстрата лакказ (антрацен, антрахинон, нафталин), которые связываются с активными центрами ферментов, способствуя их правильной ориентации на поверхности электрода. Пример последнего - модификация графитовых поверхностей антраценовыми соединениями, которые эффективно связываются с лакказами [31]. Процесс модификации включает в себя использование ариламина, который после обработки кислотой и нитритом при температуре 0 - -5 °C превращается в диазониевую соль Ar-N2+. Далее Ar-группа электрохимически прикрепляется к поверхности электрода (2A-PGE), выделяя N2 (рис. 2).
+
Электрод Ш
Рис. 2. Модификация графитовых поверхностей антраценовыми
соединениями
Однако в приведенных выше примерах электрохимический сигнал был низок из-за потери белка вследствие его денатурации или десорбции. Решением последней проблемы может быть использование ковалентной иммобилизации белка на поверхности. Ковалентное прикрепление к электродам возможно путем формирования слоя карбоксильных (амино) групп и взаимодействием с амино (карбоксильной) группой биомолекулы с образованием амидной связи [29, 32, 33].
Термическое амидирование через прямую конденсацию карбоновых кислот и аминов, как правило, требует очень жестких условий (Т> 180 °С). Чтобы избежать денатурации белков, используют активаторы карбоксильных групп. В качестве такого активатора чаще всего
используют 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDC) -водорастворимый карбодиимид. Схема образования пептидной связи с использованием EDC представлена на рис. 3.
к он
ЕБС
Рис. 3. Схема образования пептидной связи под действием EDC
Другой способ ковалентного связывания лакказ с поверхностью электродов основан на образовании имино-связей между окисленным периодатом углеводным компонентом на поверхности молекулы лакказы и аминогруппами на поверхности электрода [25, 29].
Предполагается, что такой подход приведет к иммобилизации фермента с меньшим расстоянием между активным центром Т1 и электродом для осуществления переноса электронов, чем при
использовании EDC (рис. 4).
д^-Лакказа
Р О-
ЫаЮ4 рН4
д^-Лакказа
СОО"
О
/
,Т-—Лакказа
Рис. 4. Химическая модификация углеводных остатков в лакказе с последующей иммобилизацией на поверхности электродов
Заключение
Следует отметить, что не существует универсального метода иммобилизации лакказ. Выбранный метод должен обеспечивать ППЭ, а
также обязан поддерживать стабильность фермента в экспериментальных растворах. Однако иммобилизация лакказы потенциально выгодна по сравнению со свободным ферментом, поскольку такая система проще в эксплуатации, может обеспечить значительное снижение потерь фермента, а также позволить его повторное использование.
Список литературы
1. Yahiro A. T., Lee S. M., Kimble D. O. Bioelectrochemistry: I. enzyme utilizing bio-fuel cell studies. // Biochim Biophys Acta. 1964. V. 88. P. 375383.
2. Meredith M. T., Minteer, S. D. Biofuel cells: enhanced enzymatic bioelectrocatalysis. // Annu. Rev. Anal. Chem. 2012. V. 5. P. 157-179. doi: 10.1146/annurev-anchem062011-143049.
3. Epidermal biofuel cells: energy harvesting from human perspiration. Angew. / Jia W., Valdés-Ramírez G., Bandodkar A. J. [et al]. // Chem. Int. Ed. 2013. V. 52. P. 7233-7236.
4. Katz E., MacVittie, K. Implanted biofuel cells operating in vivo -methods, applications and perspectives - feature article. // Energy Environ. Sci. 2013. V. 6. P. 2791-2803.
5. Cosnier S., Le Goff A., Holzinger, M. Towards glucose biofuel cells implanted in human body for powering artificial organs: review. // Electrochem. Commun. 2014. V. 38. P. 19-23.
6. Yoshida Н. Chemistry of lacquer (Urushi). Part I. Communication from the chemical society of Tokio // J. Chem. Soc. Trans. 1883. V. 43. P. 472486.
7. Laccases. Anonymous Advances in Agricultural and Food Biotechnology. / Loera O., Pérez Pérez M., Irma Cristina. [et al]. // Research Signpost. 2006. P. 323-40.
8. Madhavi V., Lele S.S. Laccase: properties and applications. // BioResour 2009. V. 4. P. 1694-717.
9. Baldrian P. Fungal Laccases—Occurrence and Properties // FEMS Microbiology Reviews. 2006. V. 30. P. 215-242.
10. Thurston C.F. The Structure and Function of Fungal Laccases // Microbiolodgy. 1994. V. 140. P. 19-26.
11. Claus H. Laccases: structure, reactions, distribution // Micron. 2004. V. 35. P. 93-96.
12. "Голубые" лакказы (обзор) / Морозова О.В., Шумакович Г.П., Горбачева М.А. [и др.] // Биохимия. 2007. Т. 72. С. 1136-1150.
13. Purification and preliminary crystallographic study of Trametes versicolor laccase in its native form / Bertrand, T., Jolivalt, C., Caminade, E., [et al]. // Acta Cryst. 2002. V.58. P. 319-321.
14. Structure of native laccase from Trametes hirsuta at 1.8 A resolution / Polyakov K.M., Fedorova T.V., Stepanova E.V. // Acta Cryst. 2009. V. 65. P. 611-617.
15. Applications of laccases and tyrosinases (phenoloxidases) immobilized on different supports: a review. / Duran N., Rosa M.A., D'Annibale A. [et al]. // Enzyme Microb Technol. 2002. V. 31. P. 907-31.
16. Лакказа-медиаторные системы и их использование (o63op) / Морозова О.В., Шумакович Г.П., Шлеев С.В. [и др.] // Прикл. биохимия и микробиология. 2007. Т. 43. Стр. 583-597.
17. Oxygen binding, activation, and reduction to water by copper proteins. / Solomon E.I., Chen P., Metz M. [et al]. // Angew Chem Int. Ed. 2001. V. 40. P. 4570-4590.
18. High power enzymatic biofuel cell based on naphthoquinone-mediated oxidation of glucose by glucose oxidase in a carbon nanotube 3D matrix. / Reuillard B., Le Goff A., Agne's C. [et al]. // Phys Chem. 2013. V. 15. P. 4892-4896.
19. Gold nanoparticles as electronic bridges for laccase-based biocathodes. / Gutierrez-Sanchez C., Pita M., Vaz-Domi'nguez C. [et al]. // J. Am. Chem. Soc. 2012. V. 134. P. 17212-17220.
20. Efficient direct oxygen reduction by laccases attached and oriented on pyrenefunctionalized polypyrrole/carbon nanotube electrodes. / Lalaoui N., Elouarzaki K., Le Goff A. et al. // Chem. Commun. 2013. V. 49. P. 9281-9283.
21. Improved chemical and physical stability of laccase after spherezyme immobilisation. / Jordaan J., Mathye S., Simpson C., Brady D. [et al]. // Enzyme Microb Technol. 2009. V. 45. N.432. P.5.
22. Application of eukaryotic and prokaryotic laccases in biosensor and biofuel cells: recent advances and electrochemical aspects. / Zhang, Y., Lv, Z., Zhou, J. [et al]. // Applied Microbiology and Biotechnology. 2018.
23. Winkler J.R., Gray H.B. Long-range electron tunneling. // J. Am. Chem. Soc. 2014. V. 136. P. 2930-2939.
24. Characterization of graphite electrodes modified with laccase from Trametes versicolor and their use for bioelectrochemical monitoring of phenolic compounds in flow injection analysis / B. Haghighi, L. Gorton, T. Ruzgas [et al]. // Analytica Chimica Acta 2003. V. 487 P.3-14.
25. G. Gupta, V. Rajendran, P. Atanassov. Bioelectrocatalysis of Oxygen Reduction Reaction by Laccase on Gold Electrodes // Electroanalysis 2004. V. 16 N. 13-14 P. 1182-1185.
26. A. Goff, M. Holzinger, S. Cosnier. Recent progress in oxygen-reducing laccase biocathodes for enzymatic biofuel cells // Cell. Mol. Life Sci. 2015. V. 72 P. 941-952.
27. Majdecka D., Bilewicz R. Nanostructuring carbon supports for optimal electrode performance in biofuel cells and hybrid fuel cells // J. Solid. State Electrochem. 2016 V. 20 P.949-955.
28. Simplifying Enzymatic Biofuel Cells: Immobilized Naphthoquinone as a Biocathodic Orientational Moiety and Bioanodic Electron Mediator / Fabien G., Ross D. M., Bo-Xuan Tan. [et al]. // ACS Catal 2015 V.5 P. 1240-1244.
29. C. Gutiérrez-Sánchez. Enhanced direct electron transfer between laccase and hierarchical carbon microfibers/carbon nanotubes composite electrodes. Comparison of three enzyme immobilization methods // Electrochimica Acta 2012. V. 82 P. 218-223.
30. Mediatorless high-power glucose biofuel cells based on compressed carbon nanotube-enzyme electrodes / Zebda A., Gondran C., Le Goff A. [et al]. // Nat. Commun. V. 2. № 370 P. 1-6.
31. Blanford C. F., Heath R.S., Fraser A. A stable electrode for highpotential, electrocatalytic O2 reduction based on rational attachment of a blue copper oxidase to a graphite surface // Chem. Commun. 2007. P. 1710-1712.
32. M. Bandapati, B. Krishnamurthy, S. Goel. Fully assembled Membraneless Glucose Biofuel Cell with MWCNT Modified Pencil Graphite leads as Novel Bioelectrodes. IEEE Trans NanoBioscience 2019.
33. Laccase electrode for direct electrocatalytic reduction of O2 to H2O with highoperational stability and resistance to chloride inhibition / Vaz-Dominguez C., Campuzano S., Rüdiger O. [et al]. // Biosens Bioelectron 2008. V. 24 P. 531-537.
Исследование выполнено в рамках проекта по Государственному заданию Минобрнауки (номер FEWG-2020-008).
Голикова Виктория Игоревна, магистрант, bucherwurm9@,mail. ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Гордеева Татьяна Андреевна магистрант, neelami@,mail.ru, Россия, Тула, Тульский государственный университет,
Алферов Сергей Валерьевич, канд. хим. наук, доц., s.v.alferovagmail.com, Россия, Тула, Тульский государственный университет
LACCASE BIOCATHODES IN BIOFUEL CELLS. MINI-REVIEW
V.I. Golikova, T.A. Gordeeva, S.V. Alferov
Microbes are used in enzymatic biofuel cells (EBFC), that are bioelectrochemical devices, as to convert chemical energy directly into electricity. The creation of laccase-based biocathodes allows to increase the efficiency of EBFC. This article summarizes recent known methods for immobilization laccases to achieve direct electron transfer.
Key words: laccase, biosensor, enzymatic biofuel cells, Direct electron transfer
Golikova Victoria Igorevna graduate student, bucherwurm9@,mail. ru, Russia, Tula, Tula State University,
Gordeeva Tatyana Andreevna graduate student, neelami'a mail.ru, Russia, Tula, Tula State University,
Alferov Sergey Valerievich, candidate of chemical sciences, assistant professor, s. v. alferovaigmail. com, Russia, Tula, Tula State University
