CC BY
48
УДК 577.151.45+542.943:547.56
ОСОБЕННОСТИ МЕХАНИЗМА ФЕРМЕНТАТИВНОГО ОКИСЛЕНИЯ МНОГОАТОМНЫХ ФЕНОЛОВ МОЛЕКУЛЯРНЫМ КИСЛОРОДОМ
Е.М.Кравченко, И.Д.Одарюк
PARTICULARITIES OF MECHANISM OF ENZYMATIC OXIDATION OF POLYATOMIC PHENOLS BY MOLECULAR OXYGEN
E.M.Kravchenko, LD.Odariuk
Донецкий национальный университет, elena_grazhina@mail.ru
Впервые обнаружена хемилюминесценция (ХЛ) в реакции ферментативного окисления двух- и трехатомных фенолов молекулярным кислородом в присутствии лакказы Trametes versicolor и в реакции окисления пирогаллола катион-радикалом диаммониевой соли 2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиазолин-6-сульфоната) — ABTS. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют в пользу осуществления процесса по радикальному механизму. Сложная форма кинетических ХЛ-кривых при лакказном окислении фенолов и зависимости параметров этих кривых от концентрации субстратов и фермента не согласуются с описанием кинетики процесса в рамках общепринятых схем ферментативных реакций. Спектральные характеристики эмиттеров ХЛ-свечения и значения волновых максимумов их полос излучения указывают на хиноидную природу ответственных за свечение интермедиатов. В предложенной схеме предполагается наличие реакции обратимой диссоциации одной из форм фермент-субстратного комплекса с высвобождением из сферы активного центра фермента соответствующих семихинонных радикалов. Неферментативные реакции последних приводят к образованию эмиттеров ХЛ-свечения.
Ключевые слова: лакказа, окисление, многоатомные фенолы, хемилюминесценция, эмиттер, радикальные реакции
First-ever the chemiluminescence has been observed in the reaction of enzymatic oxidation of two and three atomic phenols by molecular oxygen in the presence of laccase Trametes versicolor, and also in the reaction of oxidation of pyrogallol by the cation-radical of 2,2'-azinobis-(3-etylbenztiazoline-6-sulfonic acid). The experimental data confirmed the radical mechanism of laccase oxidation of phenols. The complex form of the chemiluminescence kinetic curves in the laccase oxidation of phenols and the dependence of the curve parameters on the concentration of substrates and the enzyme did not agree with the kinetics of the process according to generally accepted schemes of enzymatic reactions. The spectral characteristics of the emitters of chemiluminescence and the values of the wave maxima of their emission bands pointed to the quinoid structure of the luminescent intermediates. In the proposed scheme, a reversible dissociation of the enzyme-substrate complex with the release of the corresponding semiquinone radical was assumed. Non-enzymatic reactions of semiquinone radicals lead to the formation of the chemiluminescence emitters. Keywords: laccase, oxidation, polyatomic phenols, chemiluminescence, emitter, radical reactions
Введение
до воды. Фермент обнаружен у высших деревораз-рушающих грибов, растений и бактерий [2] и его Относящаяся к медьсодержащим оксидазам применяют в органическом синтезе, в биосенсорах, лакказа катализирует окисление широкого круга при биодеградации отходов. При разработке новых органических и неорганических субстратов [1] мо- технологических процессов и модернизации уже лекулярным кислородом, восстанавливая последний имеющихся, получении иммобилизованных препа-
ратов фермента с заданными свойствами, использовании фермента в аналитических целях необходимо знать принципиальный механизм лакказного действия.
Согласно представлениям о работе активного центра фермента, восстановление в нем четырех ионов меди завершается образованием соответствующего бензохинона. Далее следует четырех-электронное восстановление O2 до воды. Однако единого мнения о механизме этого процесса пока нет. В щелочных и сильнокислых водных средах субстраты лакказ — фенолы подвергаются автоокислению. Скорость этого процесса наименьшая в пределах pH 3-6, но незначительные примеси хи-нонов, ионов металлов переменной валентности, активных форм кислорода могут инициировать данный процесс [3]. Начинается радикальное неферментативное окисление с образования фенок-сильных или семихинонных радикалов, дальнейшие превращения которых зависят от их природы и условий процесса. Если скорости этих реакций будут соизмеримыми с ферментативным окислением, то общий механизм превращения фенолов в присутствии лакказы будет более сложным, чем полагали ранее.
Экспериментальная часть
В исследованиях использовали коммерческий препарат лакказы из макромицета Trametes versicolor, фирмы «SIGMA». Тролокс, ABTS, триме-тил-, трет.-бутил-, 2,3-дициано-, 2,5-дибром-, 2,5-дихлоргидрохинон и 4-трет.-бутилпирокатехин (>98%), дополнительно не очищали. Пирогаллол, гидрохинон, метилгидрохинон, резорцин, пирокатехин очищали возгонкой, фенол и о-крезол — дистилляцией. Очистка моно- и полигидроксибензой-ных, аскорбиновой кислот, флороглюцина, орцина, персульфата калия, лимонной кислоты производилась путем перекристаллизации из бидистиллиро-ванной воды или водно-спиртовых растворов.
Цитратный буферный раствор готовили согласно методике, изложенной в [4]. Буферные системы и раствор фермента хранили в холодильнике (+4°С), что обеспечивало их стабильность в течение времени исследования. Раствор катион-радикала ABTS готовили за день до опытов по методике [5]. Концентрацию катион-радикала проверяли перед работой спектрофотометрически.
В работе использовали ХЛ-установку с цифровой обработкой сигнала посредством АЦП L-305, LCARD, Россия. Интегральную интенсивность свечения регистрировали фотоумножителем ФЭУ-38. Скоростью подачи воздуха и перемешивания обеспечивали протекание процесса в кинетической области. Анализ спектрального состава ХЛ-свечения, проводили с помощью набора стандартных светофильтров — ГОСТ 9411-66 согласно описанной в [3] методике. Кинетику расходования многоатомных фенолов и накопления продуктов их лакказного окисления исследовали спектрофо-тометрически на приборе SPECORD S300 UV VIS (Германия).
Результаты и их обсуждение
Исследован широкий круг субстратов лакказы Trametes versicolor (23 соединения) на предмет наличия ХЛ при их ферментативном окислении (см. таблицу). Ни для одного из исследованных одноатомных фенолов ХЛ не зафиксирована. Также свечение не обнаружено при окислении классических субстратов лакказ — гидрохинона и пирокатехина. Однако в случае ферментативного окисления алкил-производных гидрохинона ХЛ имеется. Также она наблюдается в ходе превращения ди- и тригидрокси-бензойных кислот за исключением 2,5-дигидроксибензойной, т.е. соединения, расположение гидроксильных групп в котором соответствует гидрохинону. Интересными объектами для исследования механизма окисления фенолов, катализируемого лак-казой Trametes versicolor, являются трехатомные фенолы. Ферментативное окисление пирогаллола, фло-роглюцина, галловой и 2,3,4-тригидроксибензойной кислот сопровождается ХЛ (табл.).
Максимальная интенсивность хемилюминесценции (Imax) в реакции лакказного окисления фенолов
Названия субстратов 1max, мВ
Одноатомные
1 фенол —
2 о-крезол —
3 и-гидроксибензойная кислота —
4 тролокс —
Двухатомные
5 гидрохинон* —
6 метилгидрохинон* 14
7 2,3-дицианогидрохинон —
8 трет. -бутилгидрохинон 7
9 триметилгидрохинон 19
10 2,5 -дибромгидрохинон —
11 2,5 -дихлоргидрохинон —
12 пирокатехин* —
13 трет. -бутилпирокатехин —
14 2,3-дигидроксибензойная кислота 5
15 2,5- дигидроксибензойная кислота —
16 2,4- дигидроксибензойная кислота 4
17 3,4- дигидроксибензойная кислота 2,5
18 резорцин* 3
19 орцин —
Трехатомные
20 флороглюцин 210
21 галловая кислота 135
22 пирогаллол 130
23 2,3,4- тригидроксибензойная кислота 14,5
*Окисление изучено при [E]0 > 300 мг/л; [E]0 = 50 мг/л.
O
O_
OH + OH
H2O
+ H+
+ HO2
3O*
O
O
/ O V
O
O
+ h^490-510 n
(1)
O
(2)
+ h\
При ферментативном окислении флороглю-цина, соединения, которое при отщеплении двух электронов не образует хиноидной структуры, интенсивность ХЛ практически сразу после смешения реагентов выходит на максимум и затем медленно снижается (рис.1, кривая 1). Начальный этап превращения пирогаллола и галловой кислоты сопровождается невысоким по отношению к темно-вому току свечением, которое поддерживается на стационарном уровне. Далее оно возрастает до максимума с последующим снижением (рис.1, кривые 2 и 3). ХЛ-кривые при окислении всех исследованных соединений похожи на изображенные на рис.1, их форма сложная и вряд ли может быть описана только в рамках тех схем, которые предлагают для объяснения каталитического действия лакказ [6,7].
Рис.1. Кинетические кривые ХЛ в реакции лакказного окисления трехатомных фенолов. Цитратный буфер рН 4,6; 308 К; [Е]о = 50 мг/л. 1 — флороглюцин, = 0,1 мМ; 2 — галловая кислота, = 1,0 мМ; 3 — пирогаллол,
Ио = 0,6 мМ
На данном этапе исследований четкой взаимосвязи между структурой соединения, которое окисляется, и отсутствием или наличием в ходе процесса ХЛ
свечения не прослеживается. Так, неферментативное окисление гидрохинона и его производных ведет к образованию хинонов в электронно-возбужденном триплетном состоянии, которые могут быть эмиттерами свечения, образуясь, например, в элементарных реакциях (1) и (2) [3]. Однако в реакции ферментативного окисления многих фенолов, превращающихся в ходе процесса в соответствующие п- и о-бензохиноны, ХЛ отсутствует (см. таблицу). Кроме того, свечение есть при окислении флороглюцина и резорцина.
Кривые зависимости /тах от концентрации субстратов имеют сложный вид (см. рис.2). Форма данной зависимости общая для всех исследованных соединений, а оптимальные концентрации субстратов, при ферментативном окислении которых наблюдаются максимальные значения интенсивности ХЛ, отличаются несильно и находятся в интервале 0,150,5 мМ. От концентрации фермента тот же параметр зависит нелинейно, кривые имеют четкий излом (рис.3). При увеличении содержания фермента время выхода ХЛ на максимум (/тах) падает по гиперболе.
Рис.2. Зависимость /max от концентрации субстрата в реакции лакказного окисления многоатомных фенолов ([Е]0 = 50 мг/л). 1 — 2,3,4-тригидроксибензойная кислота; 2 — галловая кислота; 3 — пирогаллол; 4 — флороглюцин; 5 — триметил-гидрохинон
O
O
O
О 100 200 300
Рис.3. Зависимость /тах от концентрации фермента в реакции лакказного окисления многоатомных фенолов. 1 — 2,3,4-тригидроксибензойная кислота; 2 — флороглюцин; 3 — пирогаллол; 4 — галловая кислота; 5 — триметилгидрохинон
С одной стороны, наличие ХЛ-свечения в реакции лакказного окисления многоатомных фенолов может подтверждать радикальный механизм процесса, к чему склоняются авторы работ [8,9]. С другой стороны, это явление указывает на наличие элементарных реакций, которые должны протекать вне сферы активного центра фермента и приводить к образованию эмиттеров свечения. Кроме соответствующих молекул хинонов эмиттерами ХЛ могут быть димолярные ком-
плексы синглетного кислорода [10]. Поскольку круг элементарных реакций возникновения электронно-возбужденных интермедиатов, испускающих кванты света, достаточно узкий, то установление природы эмиттеров может дать ценные сведения об особенностях механизма ферментативного процесса.
Описанный в экспериментальной части метод получения спектральных полос излучения эмиттеров ХЛ является неточным. Как правило, ошибка при определении Хтах полосы испускания находится в интервале 5-20 нм. Но этого обычно достаточно для сопоставления спектров и выяснения природы эмиттеров ХЛ. Значения Хтах полос испускания эмиттеров, образующихся при лакказном окислении изученных соединений, изменяются несильно. Для пяти соединений они практически находятся в пределах 100 нм. К тому же, значения полуширины полос испускания при окислении галловой кислоты, триметилгидрохи-нона и флороглюцина, находятся приблизительно в диапазоне 60-80 нм (см. рис.4). Если ХЛ-свечение происходит в результате кооперативных переходов синглетного кислорода, то имеет место наложение нескольких полос и, следовательно, волновой диапазон суммарной полосы будет широким, что не наблюдается в нашем случае. К тому же, значения Хтах полос излучения эмиттеров, образующихся при лак-казном окислении различных фенолов, достоверно отличаются (см. рис.4). Эти экспериментальные факты ставят под сомнение гипотезу о возникновении свечения вследствие дезактивации димолярных комплексов синглетного кислорода.
Рис.4. Спектры излучения эмиттеров ХЛ-свечения, образующихся при лакказном окислении фенолов. [Е]0 = 50 мг/л; 4,6; 308 К. а) флороглюцин — Лтах = 496 ± 25 нм; б) пирогаллол — Лтах = 548 ± 20 нм; в) галловая кислота — Лтах = 622 ± 12 нм; г) тримети-лгидрохинон — Лтах = 550 ± 20 нм
Разброс значений Хтах не очень велик и образующиеся в процессе окисления эмиттеры ХЛ могут принадлежать к одному классу органических соединений. Более того, Хтах полосы эмиттера (550 ± 8) нм при автоокислении гидрохинона совпадает с Хтах (550 ± 20 нм), полученным для эмиттера, образующегося при лакказном окислении триметилгидрохинона. Максимумы полос испускания эмиттеров, образующихся в процессе ферментативного и неферментативного окисления пирогаллола и галловой кислоты, при переходе из цитратного буфера (рН 4,6) к карбонатному (рН 9,2) смещаются в одну сторону — длинноволновую область. Величины смещения составляют соответственно 21 и 63 нм.
Для моделирования радикального процесса окисления фенолов был использован сгенерированный ABTS+•-радикал. При окислении пирогаллола и галловой кислоты этим катион-радикалом в цитрат-ном буфере также была зафиксирована ХЛ. Она длится короткое время — в пределах 5-15 с. Формы кинетических ХЛ-кривых в данном процессе и при лак-казном окислении пирогаллола близки. Значение Хтах полосы испускания эмиттера в этом процессе составила (510 ± 10) нм (рис.5), что ненамного меньше, чем полоса эмиттера излучения, образующегося при лакказном окислении пирогаллола (см. рис.4). Учитывая высокие ошибки при определении Хтах полос излучения веществ можно допустить, что эмиттеры, образующиеся в реакции ферментативного и неферментативного окисления пирогаллола, идентичны или
близки по структуре. В реакции пирогаллола с катион-радикалом их образование может идти по реакциям (3)-(6).
Рис.5. Спектр излучения эмиттера ХЛ-свечения, образующегося в реакции окислении пирогаллола катион-радикалом ABTS (Amax = 510 ± 10 нм). [Пирогаллол]о = 5,0 мкМ; [ABTS^]o = 22 мкМ; рН 4,6; 308 К
Таким образом, возможными эмиттерами ХЛ, которые образуются в процессе ферментативного окисления пирогаллола, галловой и 2,3,4-тригидроксибензойной кислот, триметилгидрохи-нона, а вероятно, и других многоатомных фенолов, являются соответствующие молекулы хинонов, образующиеся в элементарных актах рекомбинации свободных радикалов за пределами активного центра фермента. Образование хинонов в качестве
OH
HO
+ '
+ ABTS
OH
+
+ ABTS
OH
O
HO
+ O2
O
+ ABTS + H
+
(3)
+ ABTS + H
-hv
+
O
HO
O
(4)
ЧУ
O
+ HO2
(5)
OH
O
+ HO2
HO
O
+ H2O2
O
HO
-hv
O
.Си'
(3)
Си2+1) +
Си Си
(2)
(2)
НО
VR
Схема 1. Механизм возникновения ХЛ в реакции лакказного окисления фенолов
Е
первичных продуктов показано спектрофотометри-чески для реакции лакказного окисления гидрохинона и некоторых его производных. Природа эмиттеров, образующихся при лакказном окислении флороглюцина и резорцина, пока не ясна.
Исходя из вида ХЛ-кривых (см. рис.1) можно предположить наличие двух этапов образования эмиттеров свечения. На первом этапе, в режиме стационарного сверхслабого свечения, электронно-возбужденные продукты образуются за счет тех радикальных или ион-радикальных интермедиатов, которые с постоянной скоростью «выходят» из активного центра фермента (см. схему 1). Так как при ста-
ционарном или квазистационарном кинетическом режиме ферментативного процесса «утечка» семихи-нонных анион-радикалов будет постоянной, то интенсивность свечения определенное время изменяться не будет, что и наблюдается в эксперименте. Наличие Н2О2 в реакционной смеси подтверждено экспериментально с помощью кобальт-инициированного окисления люминола.
На втором этапе скорость элементарной реакции, в которой образуется эмиттер увеличивается до максимального значения, а затем снова снижается (см. рис.1). Видимо, ускоряют реакцию образования семихинонных радикалов продукты — соответст-
• • .....
2л
500
- 5
I ООО
Рис.7. Кинетические ХЛ-кривые (1) и изменения оптической плотности субстратов и продуктов (2) в процессе лакказного окисления 2,3,4-тригидрокси-бензойной кислоты (а) и триметилгидрохинона (б). рН 4,6; 308 К, [Е]0 = 50 мг/л. а) = 0,2 мМ, Лтах = 277 нм; б) ^0 = 0,15 мМ, Лтах = 290 нм
вующие о- и и-бензохиноны. Последние относительно быстро реагируют с исходными фенолами, а продуктами реакции являются семихинонные радикалы [3]. Однако приведенные на рис.6 кривые свидетельствуют о том, что ХЛ-свечение на втором этапе может быть связано с дальнейшими превращениями самих хинонов, которые могут быть как ферментативными, так и неферментативными.
1. Mate D.M., Alcalde M. Laccase engineering: from rational design to directed evolution // Biotechnology Advances. 2015. Vol. 33(1). P.25-40.
2. Морозова О.В. и др. Лакказа-медиаторные системы и их использование: обзор // Прикладная биохимия и микробиология. 2007. Т.43. С.583-597.
3. Шендрик А.Н. и др. Автоокисление фенольных антиок-сидантов в водных средах: монография. Донецк: ДонНУ, 2013. С.39-40.
4. Досон Р. и др. Справочник биохимика / Пер. с англ. М.: Мир, 1991. 544 с.
5. Re R. et al. Antioxidant activity applying an improved abts radical cation decolorization assay. // Free Radical Biology & Medicine. 1999. Vol.26. P.1231-1237.
6. Thurston C.F. The structure and function of fungal laccases // Microbiology. 1994. Vol.140. P.19-26.
7. Hautphenne C., Debaste F., Penninckx M. Product formation from phenolic compounds removal by laccases: A review // Environmental Technology & Innovation. 2016. V.5. P.250-266.
8. Riva S. Laccases: blue enzymes for green chemistry // Trends in Biotechnology. 2006. Vol.24. №5. P.219-226.
9. Potti Ravindra Babu, Rajasekhar Pinnamaneni and Subramanyam Koona. Occurrences, Physical and Biochemical Properties of Laccase // Universal Journal of Environmental Research and Technology. 2012. V.2. Issue 1. P.1-13.
10. Slawinska D. Chemiluminescence and the formation of singlet oxygen in the oxidation of certain polyphenols and
quinines // Photochemistry und Photobiology. 1978. Vol.28. P.453-458.
References
1. Mate D.M., Alcalde M. Laccase engineering: from rational design to directed evolution. Biotechnology Advances, 2015, vol. 33(1), pp. 25-40.
2. Morozova O.V. et al. Lakkaza-mediatornye sistemy i ikh ispol'zovanie: obzor [Laccase-mediator systems and their applications: A review]. Prikladnaia biokhimiia i mikrobiologiia - Applied Biochemistry and Microbiology, 2007, vol. 43, no. 5, pp. 523-535.
3. Shendrik A.N. et al. Avtookislenie fenol'nykh antioksidantov v vodnykh sredakh [Autoxidation of phenolic antioxidants in aqueous media]. Donetsk, DonNU Publ., 2013, pp. 39-40.
4. Dawson R. Data for Biochemical Research. Oxford, Clarendon Press, 1986. 580 p. (Russ. ed.: Doson R. et al. Spravochnik biokhimika. Moscow, "Mir" Publ., 1991. 544 p.).
5. Re R. et al. Antioxidant activity applying an improved abts radical cationdecolorization assay. Free Radical Biology & Medicine, 1999, vol. 26, pp. 1231-1237.
6. Thurston C.F. The structure and function of fungal laccases. Microbiology, 1994, vol. 140, pp. 19-26.
7. Hautphenne C., Debaste F., Penninckx M. Product formation from phenolic compounds removal by laccases: A review. Environmental Technology & Innovation, 2016, vol. 5, pp. 250-266.
8. Riva S. Laccases: blue enzymes for green chemistry. Trends in Biotechnology, 2006, vol. 24, no. 5, pp. 219-226.
9. Potti Ravindra Babu, Rajasekhar Pinnamaneni, Subramanyam Koona. Occurrences, physical and biochemical properties of laccase. Universal Journal of Environmental Research and Technology, 2012, vol. 2, no. 1, pp. 1-13.
10. Slawinska D. Chemiluminescence and the formation of singlet oxygen in the oxidation of certain polyphenols and quinones. Photochemistry und Photobiology, 1978, vol. 28, pp. 453-458.
