CC BY
59
ХИМИЧЕСКАЯ КИНЕТИКА
УДК 547.565.2:547.565.3:678.048:544.421:535.379
ИССЛЕДОВАНИЕ АКТИВИРОВАННОЙ ЛЮМИНОЛОМ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ В РЕАКЦИЯХ ПЕРОКСИРАДИКАЛОВ 2,2'-АЗОБИС(2-АМИДИНОПРОПАН)ДИГИДРОХЛОРИДА С ГИДРОКСИБЕНЗОЛАМИ В НЕЙТРАЛЬНЫХ СРЕДАХ
Н.И.Белая, А.В.Белый, К.В.Глушенко
STUDY OF LUMINOL-ACTIVATED CHEMILUMINESCENCE IN REACTIONS OF PEROXYL RADICALS OF 2,2'-AZOBIS(2-AMIDINOPROPANE)DIHYDROCHLORIDE WITH HYDROXYBENZENES IN A NEUTRAL MEDIUM
N.I.Belaia, A.V.Belyi, K.V.Glushenko
Донецкий национальный университет, [email protected]
Определены кинетические параметры реакции ди- и тригидроксибензолов с пероксильными радикалами 2,2'-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлорида (rOO') в водной среде при рН = 7,35 и Т = 323±2 К методом хемилюминесценции, активированной люминолом. Константа (k7) скорости исследуемой реакции является характеристикой антирадикальной активности изученных гидроксибензолов. Показано, что величины констант зависят от способности фенолов к диссоциации и активности образующихся ионов. Для изученного ряда соединений установлена двухпараметрическая корреляционная зависимость In k7 от константы диссоциации фенола и потенциала ионизации фенолята. Полученная корреляция свидетельствует о протекании реакции преимущественно по механизму одноэлектронного переноса от активных фенолят-ионов к rOO' в водной среде. Экспериментально это подтверждается увеличением реакционной способности гидроксибензолов при переходе от кислой к щелочным средам.
Ключевые слова: 2,2'-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлорид, люминол, свободный радикал, гидроксибензол, антиоксидант, антирадикальная активность, хемилюминесценция
We determined the kinetic parameters of reaction of di- and threehydroxybenzenes with peroxyl radicals of 2,2'-azobis(2-amidinopropane)dihydrochIoride (rOO') in aqueous medium at pH = 7,35 and T = 323±2 K by the luminol-activated chemiluminescence. The rate constant (k7) of the investigated reaction is the characteristic of antiradical activity of studied hydroxybenzenes. It is shown that the constants depend on the phenols' dissociation ability and on the formed ions' activity. The two-parametric correlation of In k7 with the dissociation constants of phenols and the ionization potentials of phenolates was established for studied compounds. The obtained correlation indicates on the occurrence of reaction proceeding mainly by the mechanism of single electron transfer from the active phenolates to the rOO' in aqueous medium. It is experimentally confirmed by the increase in antiradical activity of hydroxybenzenes during the transition from acidic to alkaline mediums.
Keywords: 2,2'-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride, luminol, free radical, hydroxybenzene, antioxidant, antiradical activity, chemiluminescence
Введение
Возникновение многих сердечно-сосудистых, воспалительных и онкологических заболеваний сопряжено с интенсификацией процессов неферментативного окисления липидов мембран клеток в организме человека. Подавлять такие патологические состояния призваны лекарственные препараты на основе соединений (антиоксидантов), способных замедлять окислительные процессы в живых клетках [1,2].
Наиболее распространены в качестве лекарственных средств антиоксидантного назначения вещества фенольного типа как в индивидуальном виде, так и в виде природных смесей — растительных экстрактов [3]. Большинство фенольных соединений, обладающих антиоксидантным действием в отношении
процессов свободнорадикального окисления [4], имеют в ароматическом кольце две и более гидро-ксильные группы, что придает фенолам водорастворимый характер и направленность действия.
Антиоксидантную активность фенольных соединений важно исследовать во взаимосвязи с их строением по отношению к различным субстратам органического и неорганического происхождения. Для определения активности антиоксидантов обычно используется модельная реакция окисления какого-либо индивидуального соединения, протекающая по радикальному механизму, либо же создаются условия для генерирования кислородцентрированных радикалов как наиболее близких к активным формам кислорода путем использования различных инициаторов свободных радикалов.
Целью данной работы является исследование кинетики и механизма реакции ди- и тригидрокси-бензолов с пероксильными радикалами ААПГ в водной среде при рН = 7,35 и Т = 323±2 К методом хеми-люминесценции, активированной люминолом (ЪН2).
Экспериментальная часть
В качестве модельных фенольных антиокси-дантов использовали ди- и тригидроксибензолы отечественного производства, которые очищали либо синтезировали по литературным методикам [5,6].
Определенные в заданных условиях константа скорости инициирования пероксильных радикалов ААПГ (к) и выход радикалов из клетки (е) равны 7,67-Ш-6 сек-1 и 0,54 соответственно.
Для приготовления фосфатного буфера использовали бидистилированную воду, соли КН2РО4 и NаНРО4•2Н2О квалификации х.ч. дважды перекри-стализованные. Точное значение рН определяли с помощью лабораторного ионометра И-160МИ.
Кинетику реакции пероксирадикалов ААПГ с гидроксибензолами исследовали в фосфатном буфере
I - Ri=R2=OH, R3=R4=R5=H - пирокатехин,
II - Ri=R4=OH, R2=R3=R5=H - гидрохинон,
III - Rj=R3=OH, R2=R4=R5=H - резорцин,
IV - Rj=R2=R3=OH, R4=R5=H - пирогаллол,
V - Ri=R2=R4=OH, R3=R5=H - оксигидрохинон,
VI - Ri=R3=R5=OH, R2=R4=H - флороглюцин.
Прототипом свободных радикалов, образующихся в живой клетке, являются пероксиради-калы водорастворимого азоинициатора 2,2'-азобис(2-амидинопропан)дигидрохлорида (производства «Sigma-Aldrich», Германия).
Активатор свечения — 5-амино-2,3-дигидро-1,4-фталазиндион — люминол (производства «Sevra», Германия) применяли без предварительной очистки.
За кинетикой процесса генерирования (инициирования) пероксильных радикалов ААПГ в фосфатном буфере при pH=7,35 следили газоволю-мометрическим методом [7], измеряя количество поглощенного кислорода при постоянной температуре 323 К и постоянном парциальном давлении кислорода 760 мм рт. ст. на установке, описанной в
[8]. В основе исследуемой реакции лежит способность ААПГ распадаться (1) с постоянной скоростью при определенной температуре в водной среде с выделением газообразного азота N2 и двух ал-кильных радикалов (г'), которые быстро реагируют с кислородом воздуха (2) с образованием перок-сильных (rOO') и алкоксильных радикалов (гО')
[9]:
методом хемилюминесценции на установке, описанной в работе [10]. рН = 7,35 соответствовал среднему показателю рН сыворотки крови. Рабочие концентрации фенолов — 10-5-10-6 моль-л-1, ААПГ — 3-10-2 моль-л-1. Усиливали хемилюминесцентное свечение введением водорастворимого активатора — люмино-ла в концентрации 2-10-5 моль-л-1. Температура опыта 323±2 К обеспечивала минимальное время проведения эксперимента при длительном периоде (до 40 мин), в течение которого хемилюминесценция (ХЛ) находилась в стационарном режиме. Скорость барбо-тирования реакционной смеси кислородом воздуха иО = 0,6 мл-сек-1 соответствовала протеканию исследуемой реакции в кинетической области.
Расчет констант диссоциации фенолов и распределение их ионных форм в зависимости от рН среды проводили полуэмпирическим методом QSPR в программе Marvin 5.11.3.
Параметры структуры молекул фенолов и образующихся из них фенолят-ионов рассчитывали в водной среде с геометрической оптимизацией всех частиц квантовохимическим полуэмпирическим методом PM7 в программном пакете MOPAC 2012:
PIPhOH = ДHf phO •+H)- AHf(phOH ), (3)
где PIPhoH — потенциал ионизации молекулы, кДж-моль-1; AHf(PhO.+H) — стандартная теплота образования катион-радикала фенола, кДж-моль-1; AH f phOH) — стандартная теплота образования молекулы фенола, кДж-моль-1.
AHH+ = (ah ;f(pho-) + AH;f(H+))-AH f (pho'+H), (4)
где AHH + — энтальпия отрыва протона водорода от катион-радикала фенола, кДж-моль-1; AHf(phO.) — стандартная теплота образования радикала фенола, кДж^моль-1; AHf (H+) — стандартная теплота образования протона водорода, кДж-моль-1.
PIPhO = AH f PhO')- AHf (PhO-), (5)
где PIphO- — потенциал ионизации аниона фенола, кДж-моль-1; AHf (PhO ) — стандартная теплота образования аниона фенола, кДж-моль-1.
AHo-h =(AH f (PhO-) + AH f (H+))-AH f (PhOH), (6)
где AHO -H — энтальпия диссоциации О-Н связи молекулы фенола, кДж-моль-1.
Статистическую обработку полученных данных проводили в системе Statistica Demo 6.0.
Результаты и обсуждение
В процессе распада ААПГ в водной среде при Т = 323±2 К источником фиксируемой ХЛ является реакция рекомбинации пероксирадикалов азоинициа-тора как самая экзотермическая реакция из всех протекающих в данной системе:
rOO* + rOO*-^ M * ^ M + hv, (7)
где М", М — молекулярные продукты в электронно-возбужденном и основном состояниях.
Была определена константа скорости реакции (7) k6 = 7,6-104 молыл-1хек-1 путем установления нестационарного режима за счет введения генератора свободных радикалов в нагретый до температуры опыта буферный раствор [10]. Однако интенсивность свечения реакции (7) оказалась недостаточной для удобного проведения эксперимента, поэтому в систему вводили водорастворимый активатор свечения — люминол, что позволило многократно усилить аналитический сигнал.
Поскольку интенсивность хемилюминесцен-ции пропорциональна концентрации пероксильных радикалов [10], то введение в систему акцептора пе-роксильных радикалов (рис.1) должно приводить к ослаблению свечения в той мере, в какой антиокси-дант уменьшает концентрацию пероксильных радикалов по реакции:
rOO* + PhOH (PhO ")—^ rOOH+PhO *. (8)
По виду хемилюминесцентных кривых (рис.1) видно, что в периоде индукции процесс дезактивации радикалов замедляется, но не останавливается. Продукты превращения гидроксибензо-
лов практически не проявляют антирадикального действия, поскольку после выхода из периода индукции (т) кинетические кривые практически достигают исходного предельного значения /0. Установлена линейная зависимость т от СРИОН, которая свидетельствует о гибели тОО' на молекулах ингибитора.
Рис.1. Изменение интенсивности ХЛ свечения (/) во времени в зависимости от концентрации пирогаллола [PhOH]: 1 — 310-5 мольл-1; 2 — 1,5-10-5 мольл-1; 3 — 0,710-5
Параметры АРА гидроксибензолов — константа скорости (к7) и коэффициент ингибирования (/) их реакции с пероксирадикалами ААПГ — были определены исходя их классической схемы механизма действия ингибиторов свободно-радикальных реакций [10]:
T=323K
>2r'-°^ rOOT,
/-
тОО'+ тОО'—к±^ М *,
тОО" + PhOH —^ РИО' + тООН, [ (9) тОО' + РИО' —^ продукты, PhO* + РИО' к > продукты.
На основе кинетической схемы (9) в предположении о стационарности концентраций образующихся в системе радикалов тОО' и РИО' рассчитывали величину константы скорости (к7) реакции тОО' с РИОН из зависимости относительного изменения интенсивности хемилюминесценции от концентрации ингибитора (рис.2) по уравнению [10]:
^ к7
I0 = (1,1+0,1)- г-
1 л1к6 -Ц
■[PhOH ],
(10)
где /0 — интенсивность хемилюминесценции без ан-тиоксиданта; / — интенсивность хемилюминесцен-ции в присутствии антиоксиданта; к6 — скорость рекомбинации тОО'; и, — скорость генерирования тОО'.
мольл
Рис.2. Зависимость относительного изменения интенсивно-
1п
сти ХЛ ^у | от концентрации пирогаллола [PhOH], построенная в координатах уравнения (10)
Коэффициент ингибирования / рассчитывали, исходя из зависимости периода индукции т от концентрации гидроксибензолов [10]:
х-Ц
/ = 1
(11)
[РИОН ]
Согласно литературным данным [11,12], в полярных средах реакция (8) может протекать или по механизму переноса электрона от молекулы фенола РНОН
РИОН + тОО' ^ PhO*+Н + гОО_,
РНО *+Н + гОО_ ^ РНО * + гООН,. или от его фенолята РИС1
(12)
РЪОН РНО~ + гОО'
РкО'+ н
РкО' + гОО
+ н
(13)
Тогда полученные значения констант ^ должны зависеть:
а) согласно механизму (12) — от потенциала ионизации молекулы Р1РИОН и энтальпии отрыва протона водорода от образующегося катион-радикала фенола АНЯ+;
б) согласно механизму (13) — от энтальпии диссоциации О-Н связи молекулы фенола АНО_Н и потенциал ионизации образующегося фенолята Р1
1 1РИО_ •
Анализ полученных значений ^ показал (см. табл.), что АРА фенолов в водных средах зависит как от их способности к диссоциации, так и от активности образующихся фенолят-ионов. Чем больше константа диссоциации фенолов и меньше потенциал ионизации фенолятов, тем выше значение а значит, и АРА вещества. Так, для тригидрок-сибензолов — пирогаллола и оксигидрохинона — наблюдаются самые высокие значения что связано с низкими потенциалами ионизации их молекул и ионов. М-фенолы — флороглюцин и резорцин — проявляют высокую способность к диссоциации, доля их ионных форм при рН = 7,35 достигает 8%, но значения ^ крайне низкие. Это объясняется большими значениями Р1рИО_, а значит, их
более низкой активностью в реакциях с радикалами ААПГ.
Для изученного ряда веществ более выражена зависимость 1п ^ от Р1рИО_ :
1п £7 =(32 ± 7)_(4,7 ±1,4)-10_2 Р1 ~ = 0,859, ^ = 11,4, р < 0,028, чем 1п k7 от Р1РИОН :
РИО
(14)
1п £7 = (41 ± 15) _ (5,4 ± 2,6) -10_2 Р1РИОН, (15) ~ = 0,728, ^ = 4,5, р < 0,101,
Экспериментальные параметры АРА гидроксибензолов и расчетные характеристики структуры их молекул и ионов
Соединение л-моль ^сек 1 Г РКа(1) [РИО ], % Р1РИОН , кДж-моль-1 АНн + , кДж-моль 1 Р1 кДж-моль-1 АНо _Н , кДж-моль-1
I (5,47±0,29)-103 2,05 8,95 1,01 1,01 599 790 792 483 476 906 915
II (4,3±0,4)-103 2,10 9,26 0,47 0,47 589 803 803 475 475 917 917
III (5,3±1,2)-102 0,84 8,88 2,65 2,65 620 798 794 518 514 901 902
IV (3,96±0,16)-104 2,15 8,58 1,76 1,71 1,76 600 793 781 793 495 464 487 898 917 906
V (2,99±0,26>104 2,10 8,99 0,18 1,18 0,45 580 801 803 808 460 490 482 921 893 905
VI (1,25±0,12>103 0,94 8,75 7,74 7,74 7,74 642 789 789 789 537 537 537 894 894 894
Примечания
рКа(1) — константа диссоциации для I ступени диссоциации при Т = 323 К;
[РйО~] — концентрация ионной формы по I ступени диссоциации при рН = 7,35 и Т = 323 К.
что свидетельствует о большем вкладе в АРА гидро-ксибензолов механизма (13) переноса электрона от активных фенолят-ионов, несмотря на то, что их доля в системе невелика.
Рис.3. Трехмерный график зависимости между 1п к7 и рКа, Р/
Поскольку рКа фенолов и потенциалы ионизации их фенолятов Р/РИО- являются параметрами,
характеризующими механизм (13) одноэлектронного переноса от иона, а их взаимная корреляция не превышает ~ = 0,607, то была установлена двухпарамет-рическая корреляция (рис.3) 1п к7 с указанными величинами:
1п к7 =(61±11)-(2,3 ± 0,8)рКа-(6,6 ±1,1)-10"2 Р/РО ,(16) ~ = 0,963, F = 19,2, р < 0,019, Видно, что по сравнению с парным коэффициентом корреляции ~ = 0,859 для зависимости 1п к7 от Р/РИО - (14) установленный множественный коэффициент корреляции увеличивается до ~ = 0,963.
Исходя из полученных данных можно констатировать, что исследуемая реакция пероксирадика-лов ААПГ с ди- и тригидроксибензолами при pH = 7,35 протекает при конкуренции двух механизмов с преобладанием в нейтральных средах механизма (13) одноэлектронного переноса от PhO' к rOO'. Это подтверждается экспериментальными данными по исследованию кинетики реакции при разных pH среды. Видно (рис.4), что при переходе от кислых к щелочным средам период индукции, в течение которого дезактивируются радикалы ААПГ, закономерно возрастает.
Выводы
Определены величины констант скоростей (k7) и коэффициент ингибирования f) реакции ди- и тригидроксибензолов с пероксирадикалами ААПГ в водной среде при pH = 7,35 и Т = 323±2 К методом хемилюминесценции, активированной люминолом (LH2). Показано, что значения k7 зависят от способности фенолов к диссоциации (pKa) и активности их ионов (PIphO- ). Наибольшая величина k7 характерна для пирогаллола и оксигидрохинона, диссоциирующих на феноляты с низкими потенциалами ионизации. На основании установленной двухпарамет-рической корреляции ln k7 от pKa и PIphO- предложено, что исследуемая реакция протекает при конкуренции двух механизмов с преобладанием в нейтральных средах механизма одноэлектронного переноса от PhO' к rOO'. Полученные результаты могут быть использованы как для прогнозирования АРА веществ в процессах in vivo, так и при моделировании синтеза соединений с высокими антирадикальными свойствами.
Рис. 4. Зависимость периода индукции (г) от рН среды при концентрации пирогаллола [РЮН] = 310-5 мольл-1
1. Меньщикова Е.Б., Зенков Н.К., Ланкин В.З. и др. Окислительный стресс: патологические состояния и заболевания. Новосибирск: АРТА, 2008. 480 с.
2. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. и др. Окислительный стресс: прооксиданты и антиоксиданты. М.: Слово, 2006. 556 с.
3. Максютина Н.П., Комиссаренко Н.Ф., Прокопенко А.Г. и др. Растительные лекарственные средства: Справочник. Киев: Здоровье, 1985. 280 с.
4. Зенков Н.К., Кандалинцева Н.В., Ланкин В.З., Меньщикова Е.Б. Фенольные биоантиоксиданты. Новосибирск: СО РАМН, 2003. 41 с.
5. Физер Л. Современные методы эксперимента в органической химии. М.: Госхимиздат, 1960. 369 с.
6. Вульфсон Н.С. Препаративная органическая химия. М.: ГХИ, 1959. 889 с.
7. Эмануэль М.Н., Денисов Е.Т., Майзус З.К. Цепные реакции окисления углеводородов в жидкой фазе. М.: Наука, 1965. 375 с.
8. Эмануэль Н.М., Заиков Г.Е., Майзус З.К. Роль среды в радикально-цепных реакциях окисления органических соединений. М.: Наука, 1973. 173 с.
9. Шкурупий В.А., Куликов В.Ю., Меньщикова Е.Б. и др. Влияние бальнеологического фактора курорта Белокури-ха на антиоксидантную активность сыворотки крови и на ее изменение в динамике хронического неспецифического гранулематозного воспаления // Бюллетень СО РАМН. 2006. Т. 120. № 2. С. 159-165.
10. Шляпинтох В.Я., Карпухин О.Н., Постников Л.М. и др. Хемилюминесцентные методы исследования медленных химических процессов. М.: Наука, 1966. 299 с.
11. Litwinienko G., Ingold K.U. Abnormal Solvent Effects on Hydrogen Atom Abstractions. 3. Novel kinetics in sequential proton loss electron transfer chemistry // J. Org. Chem. 2005. Vol.70. №68. P.8982-8990.
12. Litwinienko G., Ingold K.U. Abnormal Solvent Effects on Hydrogen Atom Abstractions. 2. Resolution of the Curcumin Antioxidant Controversy. The Role of Sequential Proton Loss Electron Transfer // J. Org. Chem. 2004. Vol.69. №18. P.5888-5896.
References
1. Men'shchikova E.B., Zenkov N.K., Lankin V.Z., Bondar' I.A., Trufakin V.A. Okislitel'nyi stress: patologicheskie sostoianiia i zabolevaniia [Oxidative stress: pathological states and medical conditions], Novosibirsk, ARTA Publ., 2008. 480 p.
2. Men'shchikova E.B., Lankin V.Z., Zenkov N.K., Bondar' I.A., Krugovykh N.F., Trufakin V.A. Okislitel'nyi stress: prooksidanty i antioksidanty [Oxidative stress: prooxidants and antioxidants]. Moscow, "Slovo" Publ., 2006. 556 p.
3. Maksiutina N.P., Komissarenko N.F., Prokopenko A.G., Pogodina L.N., Linkin G.N. Rastitel'nye lekarstvennye sredstva: spravochnik [Herbal medicine. Handbook], Kiev, "Zdorov'e" Publ., 1985. 280 p.
4. Zenkov N.K., Kandalintseva N.V., Lankin V.Z., Men'shchikova E.B. Fenol'nye bioantioksidanty [Fenolic bio-antioxidants]. Novosibirsk, Siberian Department of RAMS, 2003. 41 p.
5. Fizer L. Sovremennye metody eksperimenta v organicheskoi khimii [Modern methods of experiments in organic chemistry], Moscow, "Goskhimizdat" Publ., 1960. 369 p. [Russian translation]
6. Vul'fson N.S. Preparativnaia organicheskaia khimiia [Preparative organic chemistry]. Moscow, "GKhI" Publ., 1959. 889 p. [Russian translation]
7. Emanuel' M.N., Denisov E.T., Maizus Z.K. Tsepnye reaktsii okisleniia uglevodorodov v zhidkoi faze [Chain reactions of oxidation of hydrocarbons in liquid]. Moscow, "Nauka" Publ., 1965. 375 p.
8. Emanuel' N.M., Zaikov G.E., Maizus Z.K. Rol' sredy v ra-dikal'no-tsepnykh reaktsiiakh okisleniia organicheskikh soe-dinenii [The role of the medium in radical-chain reactions of oxidation of organic compounds]. Moscow, "Nauka" Publ., 1973. 173 p.
9. Shkurupii V.A., Kulikov V.Iu., Men'shchikova E.B., Zenkov N.K., Zhilianov I.V. Vliianie bal'neologicheskogo faktora ku-rorta Belokurikha na antioksidantnuiu aktivnost' syvorotki krovi i na ee izmenenie v dinamike khronicheskogo nespetsi-ficheskogo granulematoznogo vospaleniia [Influence of the Belokurikha balneal factor on serum antioxidative activity and its alteration in the course of chronic nonspecific granu-lomatous inflamations]. Biulleten' SO RAMN, 2006, vol. 120, no. 2, pp. 159-165.
10. Shliapintokh V.Ia., Karpukhin O.N., Postnikov L.M., Zakharov I.V. et al. Khemiliuminestsentnye metody issledovaniia medlennykh khimicheskikh protsessov [Chemiluminescence techniques of investigation of slow chemical processes], Moscow, "Nauka" Publ., 1966. 299 p.
11. Litwinienko G., Ingold K.U. Abnormal Solvent Effects on Hydrogen Atom Abstractions. 3. Novel kinetics in sequential proton loss electron transfer chemistry. Journal of Organic Chemistry, 2005, vol. 70, no. 68, pp. 8982-8990.
12. Litwinienko G., Ingold K.U. Abnormal Solvent Effects on Hydrogen Atom Abstractions. 2. Resolution of the Curcumin Antioxidant Controversy. The Role of Sequential Proton Loss Electron Transfer. Journal of Organic Chemistry, 2004, vol. 69, no. 18, pp. 5888-5896.
