CC BY
23
УДК 577. 152.192.3.
СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ БИОКАТАЛИТИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ С УЧАСТИЕМ ВЫСОКО- И НИЗКОПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ГРИБНЫХ И ДРЕВЕСНОЙ ЛАККАЗ В ГОМОГЕННЫХ И ГЕТЕРОГЕННЫХ РЕАКЦИЯХ
М.А. Горбачева1, Г.П. Шумакович1, О.В. Морозова1, А.В. Стрельцов1, Е.А. Зайцева2, С.В. Шлеев1
(Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 2кафедра химической этимологии; e-mail: gorbacheva-marina@yandex.ru)
Проведено сравнение гомогенных каталитических и гетерогенных биоэлектрокаталитических свойств высокопотенциальных грибных и низкопотенциальной древесной лакказ. Показано принципиальное различие в каталитической активности по субстратам-донорам электронов и донорам атомов водорода и электронов для грибных и древесных лакказ при различных значениях рН, а также в биоэлекторокаталитической реакции восстановления молекулярного кислорода. Высказано предположение о зависимости различия между биокаталитическими свойствами изученных ферментов и их ролью в процессах метаболизма лигнина.
Лaккaзы (и-дифeнoл:киcлopoд oкcидopeдyктaзa, КФ 1.10З.2) oтнocятcя к ^упте "гoлyбыx" oкcидaз и га-тaлизиpyют peaкции oкиcлeния m^ororo ^yra opгaни-чecкиx и нeopгaничecкиx cyбcтpaтoв мoлeкyляpным киcлopoдoм c coпyтcтвyющим вoccтaнoвлeниeм toc-лeднeгo дo вoды, минуя стадию oбpaзoвaния ^porc-cидa вoдopoдa [1, 2]. B штивный цeнтp лaккaз вxoдят чeтыpe иoнa мeди, кoopдиниpoвaннoe взaимoдeйcтвиe rare^ix пpивoдит к coпpяжeнию пpoцecca oднoэлeкт-poннoгo oкиcлeния cyбcтpaтoв-дoнopoв c чeтыpexэ-лeктpoннoй peaкциeй вoccтaнoвлeния дикиcлopoдa. Иoны мeди пpинятo paздeлять нa тpи типa: T1 -"гoлyбoй" мeдный цeнтp, xapaктepизyющийcя пoлocoй пoглoщeния нa элeктpoнныx cпeктpax в oблacти 600 нм и агабым cвepxтoнким pacщeплeниeм в cпeктpax ЭПР; T2 - мoнoядepный цeнтp, ш дeтeктиpyющийcя в УФ и видимoй oблacтяx cпeктpa пoглoщeния фep-мeнтa, нo имeющий xapaктepный cпeктp ЭПР; T3 -биядepный диaмaгнитный ^шр, кoтopый пpoявляeт ceбя нa rae^pax пoглoщeния в oблacти ЗЗ0 нм в видe дocтaтoчнo paзмытoгo плeчa. Цeнтpы T2 и T3 oбъeдинeны в тpexъядepный мeдный клacтep, oтвeт-cтвeнный зa вoccтaнoвлeниe дикиcлopoдa дo вoды [З]. B зaвиcимocти oт oкиcлитeльнo-вoccтaнoвитeльнoгo пoтeнциaлa иoнa мeди тиш T1 лaккaзы пpинятo шд-paздeлять нa выcoкo- и низкoпoтeнциaльныe [4]. ^и-нятo cчитaть, чтo мexaнизм кaтaлизa лaккaзaми включaeт тpи стадии: 1) вoccтaнoвлeниe иoнa мeди тиш T1 cyбcтpaтoм-дoнopoм элeктpoнa; 2) внyтpимo-лeкyляpный пepeнoc элeкгpoнa иoнaми мeди aктивнoгo цeнтpa; З) вoccтaнoвлeниe мoлeкyляpнoгo киcлopoдa c
образованием воды трехъядерным медным кластером [2].
Лакказы широко распространены в различных грибах [5] и растениях [6]. Лакказоподобные оксидазы обнаружены также в микроорганизмах [7] и в организме животных [2]. Считается, что лакказы растений участвуют в свободно-радикальных реакциях синтеза лигнина, в то время как функции грибных лакказ значительно шире. Они участвуют в морфогенезе грибов, защите их от стресса, а также в деградации лигнина [8]. Возможно, локализация лакказ в клетке и рН среды, при которой функционируют эти ферменты, коррелируют с их физиологической активностью, что в свою очередь определяет набор субстратов для этих ферментов и условия их функционирования. В проявлении субстратной специфичности лакказ особую роль играет редокс-потенциал Т1 - центр ферментов.
Цель настоящей работы - проведение сравнительных исследований биокаталитических реакций, протекающих с участием высоко-редокс-потенциальных грибных лакказ Trametes hirsuta и Cerena maxima и низко-редокс-потенциальной лакказы из сока лакового дерева Rhus vernicifera.
Методы исследования
Условия культивирования организмов и очистка ферментов
Глубинное культивирование штаммов-продуцентов базидиальных грибов T. hirsuta и C. maxima проводили по методу, описанному в работе [9]. Использовали
следующую последовательность стадий очистки ферментов: осаждение белков из культуральной жидкости сульфатом аммония в диапазоне насыщения 0-90%; ионообменная хроматография низкого давления на носителе "Сервацел ДЭАЭ 52" ("Reanal", Венгрия); адсорбционная хроматография на носителе "HTP BioGel" ("Bio-Rad", C0A); рехроматография на носителе "DEAE-Toyopearl 65GM" ("Toyo Soda", Япония). Заключительный этап очистки всех ферментов - стадия жидкостной хроматографии высокого давления на колонке "BioSep-SEC-S 2GGG Phenomenex" (C0A) с использованием HPLC - системы "Стайер" ("Аквилон", Россия). Все стадии очистки ферментного препарата проводили при температуре 4°C.
Ферментный препарат из латекса лакового дерева R. vernicifera был любезно предоставлен проф. B. Рейнхаммером (Швеция). Он также был дополнительно очищен методом хроматографии высокого давления. Все исследуемые ферментные препараты были гомогенны по данным ДДC-электpофоpеза.
Определение молекулярной массы. Молекулярную массу лакказ определяли методом ДД^электро-фореза в градиенте ÏAAE В качестве белков-метчиков использовали (кДа): целлюлазу (94,6), ÁCA (66,2), овальбумин (45,0), карбоангидразу (31,0), ингибитор трипсина (21,5), лизозим (14,4). Концентрацию белка в использованных растворах определяли по методу, описанному в работе [10].
Кинетические исследования. Aктивность лакказ в реакциях окисления органических и неорганических субстратов определяли спектрофотометрически по скорости образования продукта и электрохимическим методом с использованием кислородного электрода типа Кларка по уменьшению тока восстановления ди-кислорода, потребляемого в процессе ферментативной реакции при потенциале рабочего электрода -600 мВ. Кинетические параметры реакций окисления субстратов рассчитывали с учетом стехиометрии протекающих реакций.
Ферментативные реакции, катализируемые лакказа-ми, проводили в 40 мМ универсальном буферном растворе при выбранном значении рН
Биоэлектрокаталитические эксперименты проводили на вольтамперометрическом анализаторе "CV-5GW" ("Bioanalytical Systems", C0A), используя трехэлектродную электрохимическую ячейку. В качестве рабочего электрода использовали стержень спектрального графита ("Ringsdorff Werke", Германия). Иммобилизацию ферментов на поверхности рабочего электрода осуществляли путем адсорбции 10 мкл того или иного ферментного препарата в течение
30 мин. Неадсорбироваииый фермент удаляли путем многократной помывки электрода рабочим буферным раствором.
Циклические вольтамперограммы записывали на обновленной поверхности электрода при различных значениях рН рабочего буфера в интервале потенциалов от -200 до 1000 мВ относительно Ag/AgCl (потенциал 210 мВ относительно нормального водородного электрода (отн. НВЭ)) при скорости развертки потенциала 10 мВ/с.
Реактивы. В работе использовали следующие реактивы: борная кислота, АБТС (диаммониевая соль 2,2 -азино-бис-(3-этилбензтиазолин-6-сульфоната)) ("Sigma", США), гидрохинон ("Roth", Германия), K4Fe(CN)6 3H2O ("Alfa Aesar", Германия), NaOH ("Fluka", Германия), H3PO4, CH3COOH, NaF, пирокатехин (отечественные препараты марки "ос.ч."), серингалдазин ("ICN", Германия), гваякол ("Acros Organics", США).
Все растворы, за исключением растворов для ферментации, готовили с использованием деионизирован-ной воды, полученной на установке "Milli Q" ("Millipore", США).
Результаты и обсуждение
Одним из подходов для понимания физиологической роли грибных и древесных лакказ является выяснение активности этих ферментов по различным субстратам при разных значениях рН раствора как в гомогенных, так и гетерогенных системах. Профили зависимости активности высокопотенциальных ферментов из базидиальных грибов T. hirsuta и C. maxima от рН раствора, представленные в ряду различных субстратов, весьма близки и отличаются лишь формой для субстратов-доноров только электронов и субстратов-доноров одновременно водорода и электронов.
Как видно из рис. 1, высокопотенциальная грибная лакказа базидиального гриба T. hirsuta обладает каталитической активностью при значениях рН раствора до 6,5 по обоим типам субстратов. Для субстратов-доноров электронов (к которым относятся АБТС и K4Fe(CN)6) активность ферментов при возрастании рН раствора сначала практически не изменяется, а затем монотонно уменьшается. При использовании в качестве субстратов ферментов органических соединений-доноров атомов водорода (например, гидрохинона, серингалдазина) зависимость активности грибных лакказ от рН раствора имеет колоколообразный вид. Различие в рН-зависимости для субстратов лакказ, относящихся к различным типам доноров, можно
Ри^ 1. pH-Зaвиcимocть peaкций oкиcлeния дoнopoв элeктpoнoв (1 - AБTC, 2 - K4Fe(CN)6) и дoнopoв aтoмoв вoдopoдa (3 - ce-pингaлдaзин, 4 - гидpoxинoн) в пpиcyтcтвии лaккaзы Trametes hirsuta. Уcлoвия: 0,04 М yнивepcaльный бyфep; шн-цeнтpaция лaккaзы 0,8.10 8 М, AБTC - 1 мМ, K4Fe(CN)6 -10 мМ, гидpoxинoнa - 10 мМ, cepингaлдaзинa - 0,025 мМ
oбъяcнить cлeдyющим oбpaзoм. Для oбoиx типoв cyбcтpaтoв нaчaльнaя cкopocть фepмeнтaтивныx pe-aкций ^и cдвигe pH pacтвopa в cтopoнy щeлoчныx знaчeний yмeньшaлacь зa cчeт ингибиpoвaния pea^ ции гидpoкcил-иoнaми, ^TOpbie cвязывaютcя c тpexъядepным T2/T3 клacтepoм лaккaз [2]. Для opгaничecкиx cyбcтpaтoв гpибныx лaккaз (дoнopoв aтoмoв вoдopoдa), oтнocящиxcя к фeнoльным có6-cтpaтaм, пoтeнциaл иoнизaции yмeньшaeтcя пpи yвe-личeнии pH pacтвopa, и, cлeдoвaтeльнo, cкopocть pe-aкции вoзpacтaeт. Кмбитация этиx двyx пpoцeccoв oбъяcняeт кoлoкoлooбpaзнyю фopмy кpивoй pH-зaви-cимocти фepмeнтaтивнoй peaкции для cyбcтpaтoв-дo-нopoв aтoмoв вoдopoдa. Для AБTC и гeкcaциaнoфep-paтa (ÀÀ) кaлия, кoтopыe являются дoнopaми элeкт-poнoв, пoтeнциaл иoнизaции cyбcтpaтoв нe измeняeтcя
c измeнeниeм pH pacтвopa, в peзyльтaтe чeгo нa rpa-фикe pH-зaвиcимocти нaблюдaeтcя нeбoльшoe плaтo, a зaтeм плaвнoe пaдeниe cкopocти peaкции oкиcлeния cyбcтpaтoв.
Дoпoлнитeльным пoдтвepждeниeм oпиcaнныx вышe ocoбeннocтeй ^иб^^ лaккaз являeтcя ингибиpoвaниe фтopид-aниoнaми кaтaлитичecкиx peaкций oкиcлeния oбoиx титов cyбcтpaтoв (pиc. 2, а, б). Фтopид-aниoн пoдoбнo гидpoкcил-aниoнy cвязывaeтcя c тpexъядep-ным T2/T3 клacтepoм и нapyшaeт внyтpимoлeкyляp-ный пepeнoc элeктpoнoв oт cyбcтpaтa фepмeнтa нa мoлeкyляpный киcлopoд. Ингибиpoвaниe фepмeнтa-товны* peaкций oкиcлeния AБTC и гидpoxинoнa 1 мМ NaF cocтaвляeт 95 и 96%, cooтвeтcтвeннo.
Инaя кapтинa нaблюдaeтcя пpи фepмeнтaтивнoм oкиcлeнии cyбcтpaтoв oбeиx гpyпп в пpиcyгcтвии низ-кoпoтeнциaльнoй лaккaзы из лaкoвoгo дepeвa R. vernicifera. B oтличиe oт выcoкoпoтeнциaльныx гpибныx лaккaз Т. hirsuta и C. maxima, низкoпoтeнци-aльнaя дpeвecнaя лaккaзa cпocoбнa кaтaлизиpoвaть oкиcлeниe opгaничecкиx cyбcтpaтoв-дoнopoв aтoмoв вoдopoдa в нeйтpaльныx и cлaбoщeлoчныx pacтвopax, ocтaвaяcь пpи этoм кaтaлитичecки нeaктивнoй пpи ки^ьк знaчeнияx pH. B тo œe вpeмя дaнный фep-мeнт пpoявляeт кaтaлитичecкyю aктивнocть пo orao-шeнию к cyбcтpaтaм-дoнopaм элeктpoнoв тoлькo в киcлoй oблacти pH (pиc. 3). Это oзнaчaeт, чтo для cyбcтpaтoв-дoнopoв aтoмoв вoдopoдa дaнный фep-мeнт cлaбo ингибиpyeтcя гидpoкcил-aниoнaми. B o^ личиe oт выcoкoпoтeнциaльныx гpибныx лaккaз, a^ тивнocть низкoпoтeнциaльнoй дpeвecнoй лaккaзы ата-6o ингибиpyeтcя иoнaми фтopa в нeйтpaльнoй и щe-лoчнoй oблacти пpи иcпoльзoвaнии cyбcтpaтoв-дoнo-poв aтoмoв вoдopoдa. Oднaкo пoдoбнo выcoкoпoтeнци-
Pиc. 2. Ингибиpoвaниe нaчaльнoй c^pocra peaкций oкиcлeния AБTC (а) и гидpoxинoнa (б), кaтaлизиpyeмыx лaккaзoй Cerrena maxima. 1, 1' - в oтcyтcтвии ингибитopa; 2, 2' - в ^^ут^^ии 1 мМ NaF; 3, 3' - фoн в oтcyтcтвиe лaккaзы. Уcлoвия: кoнцeнтpaция лaккaзы 3,3.10-8 М, 0,04 М yнивepcaльный бyфep pH 4,0, 1 мМ AБTC, 10 мМ гидpoxинoн
И-'-1-'-1-1-1-»-1-'-1-■-1-'-1---1—
23456789 10
рН
Рис. 3. рН-Зависимость реакций окисления доноров электронов (1 - АБТС, 2 - K4Fe(CN)6) и доноров атомов водорода (3 - гваякол, 4 - гидрохинон, 5 - пирокатехин) в присутствии лакказы Rhus vernicifera. Условия: 0,04 М универсальный буфер. Концентрация лакказы 9,2* 10-8 М, АБТС - 1 мМ, пирокатехина - 10 мМ, гидрохинона - 10 мМ, K4Fe(CN)6 - 10 мМ, гваякола - 10 мМ
альным ферментам из базидиальных грибов, лакказа R. vernicifera теряет свою активность в присутствии галогенид-анионов в реакциях окисления субстратов-доноров электрона в кислых значениях рН раствора.
Сравнение рН-зависимостей высокопотенциальных грибных и низкопотенциальной древесной лакказ дает возможность объяснить их физиологическую функцию, в частности их роль в реакциях деградации или синтеза лигнина. Высокопотенциальные лакказы из древоразрушающих грибов, к которым относятся грибы белой гнили T. hirsuta и C. maxima, имеют ре-докс-потенциал 780±20 и 750±20 мВ отн. НВЭ [4, 11] соответственно, в то время как лакказа из латекса лакового дерева R. vernicifera относится к низкопотенциальным лакказам и имеет редокс-потенциал 440±20 мВ отн. НВЭ [4, 12].
Марганец в микроколичествах присутствует в различных лигноцеллюлозных материалах. Ионы марган-3+
ца Mn являются сильными окислителями и способны непосредственно окислять нефенольные подструктуры лигнина, способствуя деградации последнего.
3+
Ранее было показано[13], что ионы Mn образуются при ферментативном окислении ионов Mn2+ в присутствии хелатирующих агентов (щавелевой, винной и фумаровой кислот). Последние, как было показано в работе [14], необходимы для понижения редокс-по-
2+ 3+
тенциала пары Mn /Mn , тем самым делая возмож-
2+
ным окисление Mn молекулярным кислородом в присутствии высоко редокс-потенциальных лакказ. Так, потенциал начала реакции окисления комплекса
2+ 3+
Mn -тартрат в Mn -тартрат составляет приблизительно 950 мВ, что делает термодинамически воз-
можным его окисление дикислородом в присутствии высокопотенциальных лакказ из грибов белой гнили, имеющих значение редокс-потенциала в интервале от 750 до 800 мВ [4, 11-13]. Таким образом, высокопотенциальные лакказы способны непосредственно участвовать в реакциях деградации лигнина не только путем непосредственного окисления фенольных подструктур лигнина, но и опосредованно, в результате окисления нефенольных подструктур ионами трехвалентного марганца, образующимися в процессе ферментативной реакции, катализируемой грибными лак-казами. Было показано, что низкопотенциальный фермент из лакового дерева R. vernicifera, имеющий ре-докс-потенциал 440 мВ, не способен катализировать эту реакцию и как следствие не может участвовать в процессах деградации лигнина. Однако в области нейтральных и слабощелочных значений рН лакказа из лакового дерева эффективно катализирует окисление гваякола, гидрохинона и диметоксифенола, которые являются структурными единицами лигнина. Таким образом, в результате протекания свободно-радикальных реакций этот фермент может участвовать в синтезе лигнина из мономеров.
Биоэлектрокаталитические исследования
Исследованные лакказы были иммобилизованы путем физической адсорбции на поверхности графитового электрода, являющегося в данном случае субстратом-донором электронов в реакции электровосстановления дикислорода. Оба фермента катализируют реакцию электровосстановления молекулярного кислорода до воды. Потенциал полуволны реакции электровосстановления молекулярного кислорода близок к редокс-потенциалу ионов меди Т1 типа исследованных высоко- и низкоредокс-потенциальных ферментов (рис. 4).
Подобно гомогенной реакции, катализируемой низкопотенциальной лакказой из лакового дерева, биокаталитическая реакция электровосстановления дикис-лорода в присутствии этого фермента практически полностью ингибируется фторид-анионами в кислой области рН и слабо в нейтральной (рис. 4, а). При этом активность лакказы C. maxima полностью инги-бируется фторид-анионами в кислых значениях рН раствора (рис. 4, б). Кроме того, грибные лакказы не проявляют активность в нейтральных и слабощелочных растворах.
Авторы благодарят канд. биол. наук. А.В. Софьи-на за оказание помощи в процессе очистки ферментных препаратов.
Потенциал, мВ (отн. НВЭ) Потенциал, мВ (отн. НВЭ)
Рис. 4. Циклические вольтамперограммы реакций электровосстановления молекулярного кослорода на графитовых электродах, модифицированных низкопотенциальной лакказой Rhus. vernicifera (а) и высокопотенциальной грибной лакказой Cerrena maxima (б). 1, 1' - фоновая реакция в отсутствие фермента; 2, 2' - в присутствии адсорбированного фермента; 3, 3' - в присутствии фермента и ингибитора. Условия: 0,04 М унивевсальный буфер рН 7,5 (а) и 4,0 (б)
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Yaropolov A.I., Skorobogat'ko O.V., Vartanov S.S., Varfolomeev S.D. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. 49. P. 257.
2. Solomon E.I., Sundaram U.M., Machonkin T.E. // Chem. Rev.
1996. 96. P. 2563.
3. Lyashenko A.V., Zhukhlistova N.E., Gabdoulkhakov A.G.,
Zhukova Y.N., Voelter W., Zaitsev V.N., Bento I., Stepanova E.V., Kachalova G.S., Koroleva O.V., Cherkashyn E.A., Tishkov V.I., Lamzin V.S., Schirwitz K., Morgunova E.Y., Betzel C., Lindley P.F., Mikhailov A.M. // Acta Cryst. 2006. 62. P. 954.
4. Shleev S., Tkac J., Christenson A., Ruzgas T., Yaropolov A.I.,
Whittaker J.W., GortonL. // Biosens. Bioelectron. 2005. 20. P. 2517.
5. BaldrianP. // FEMS Microbiol Rev. 2006. 302. P. 215.
6. Bao W., O'Malley D.M., Whetten R., Sederoff R.R. // Science
1993. 260. P. 672.
7. Alexandre G., Zhulin I.B. // Trends Biotechnol. 2000. 18. P. 41.
8. Leonowicz A., Cho N.-S., Luterek J., Wilkolazka A., Wojtas-
Wasilewska M., Matuszewska A., Hofrichter M., Wesenberg G., Rogalski J. // J. Basic Microbiol. 2001. 41. P. 185.
9. Горшина E.C., Русинова Т.В., Бирюков В.В., Морозова О.В.,
Шлеев С.В., Ярополов А.И. // Прикл. биохим. микробиол. 2006. 42. С. 638.
10. Ehresmann B., Imbault P., Well J.H. // Anal. Biochem. 1973. 54. P. 454.
11. Shleev S. V., Morozova O.V., Nikitina O.V., Gorshina E.S., Rusinova T.V., Serezhenkov V.A., Burbaev D.S., Gazaryan I.G., Yaropolov A.I. // Biochimie. 2004. 86. P. 693.
12. Reinhammar, B.R.M. // Biochim. Biophys. Acta. 1972. 275. P. 245.
13. Höfer C, SchlosserD. // FEBS Lett. 1999. 451. P. 186.
14. Никитина О.В., Шлеев С.В., Горшина E.C., Русинова Т.В., Ярополов А.И. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2005. 46. С. 267.
Поступила в редакцию 23.11.07
COMPARATIVE STUDIES OF BIOCATALYTIC REACTIONS OF HIGH- AND LOW-REDOX POTENTIAL LACCASES IN HOMOGENEOUS AND HETEROGENEOUS REACTIONS
M.A. Gorbacheva1, G. P. Shumakovich1, O.V. Morozova1, A.V. Streltsov1, E.A. Zaitseva2, S.V. Shleev1
(A.N. Bach Institute of Biochemistry, RAS)
The comparison of homogeneous catalytic and heterogeneous bioelectrocatalytic properties of high- and low-redox potential fungal and trees laccases has been performed. The significant differences in the catalytic activity of fungal and trees laccases towards electron-donor and proton-electron-donor substrates at different pH, as well as bioelectrocatalytic activity of oxygen reduction by these enzymes, were shown. A suggestion about dependence of different biocatalytical properties of studied enzymes and their possible roles in the metabolism of lignin was given.
