CC BY
94. Расчетные ASSR-пороги имеют высокую степень корреляции с величиной ПВД КСВП.
5. Недостатком методики являются трудности регистрации ASSR в состоянии бодрствования, так как фоновый шум ЭЭГ во многих случаях превышает полезный сигнал ASSR, что в свою очередь требует оптимизации условий стимуляции и анализа данных. Представленная работа не является законченным исследованием, а отражает промежуточные результаты. Дальнейшие исследования в этом направлении представляются нам необходимыми и целесообразными.
ЛИТЕРАТУРА
1. Auditory steady-state response evaluation of auditory thresholds in cochlear implant patients / Menard M. [et al.]. // Audiology - 2004. - Vol. 43, S. 1, - S39-S43.
2. Comparison of auditory steady-state response and auditory brainstem response thresholds in children / Vander Werff K. R. [et al.] // Journal of the American Academy of audiology. - 2002. - Vol. 13, N5 - P 227-235.
3. Dimitrijevic A., John M. S., Picton T. R. Auditory steady-state responses in normal-hearing and hearing-impaired adults // Ear and Hearing. -2004. - Vol. 25,N1,-P 68-84.
4. Frequency-specific audiometry using steady-state responses / O. G. Lins [et al.] // Ear and Hearing. - 1996. - Vol. 17, N4,-P 81- 96.
5. Hearing threshold estimation in infants using auditory steady-state responses / G. Rance [et al.] // Journal of the American Academy of Audiology. - 2005. - Vol. 16, N5,- P. 291-300.
6. Herdman A. T., Stapells D. R. Auditory steady-state responses thresholds of adults with sensorineural hearing impairments // Audiology. - 2003. - Vol. 42, N5,- P 237- 248.
7. Human auditory steady-state responses / Picton T. W. [et al.] // Audiology. - 2003. - Vol. 42, N4,- P 177- 219.
8. Loudness and auditory steady-state responses in normal-hearing subjects / F. Z. Castro [et al.] // Audiology. - 2008.
- Vol. 47, N5,- P 269- 275.
9. Luts H., Wouters J. Hearing assessment by recording multiple auditory steady-state responses: the influence of test duration // Audiology. - 2004. - Vol. 43, N8,- P. 471-478.
10. Range G., Rickards F. Prediction of hearing threshold in infants using auditory steady-state evoked potentials // Journal of the American Academy of Audiology - 2002. - Vol. 13, N5,- P 236-245.
11. The ASSR: clinical application in normal-hearing and hearing- impaired infants and adults, comparison with click-evoked ABR and pure- tone audiometry / Scherf F. [et al.] // Audiology. - 2006. - Vol. 45, N5,- P. 281- 286.
УДК: 616. 216—002: 616. 155. 3—008. 13: 575. 191
ВЛИЯНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ IL-1E НА ФУНКЦИОНАЛЬНУЮ АКТИВНОСТЬ НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ГРАНУЛОЦИТОВ
Л. Э. Тимчук1, Ю. К. Янов1, Д. Ю. Семенюк1,
А. С. Симбирцев2, В. Г. Конусова2, А. Ю. Громова2 INFLUENCE OF POLYMORPHISM OF GENES ON FUNCTIONAL ACTIVITY OF NEITROPHYLY GRANULOCITES L. E. Timchuk, Yr. K. Janov, D. Yr. Semenyuk,
A. S. Simbirzev, V. G. Konusova, A. Y. Gromova 1ФГУ СПб НИИ уха, горла, носа и речи Росмедтехнологий (Директор - Засл. Врач РФ, проф. Ю. К. Янов)
2 СПб НИИ особо чистых биопрепаратов ФМБ Агентства (Директор - докт. мед. наук В. П. Добрица)
Функциональный полиморфизм генов IL-1 определяет структуру кодируемых белков и меняет характер экспрессии и продукции провоспалительных цитокинов, влияя на характер течения воспалительного процесса в околоносовых пазухах. Продукция IL-1e влияет на показатели функционального состояния фагоцитирующих клеток.
Российская оториноларингология №6 (43) 2009
Ключевые слова: цитокины, риносинусит, полиморфизм, гены, фагоцитоз.
Библиография: 10 источников.
1L-1 gene functional polymorphism is responsible for the cytokine expression and production levels in patients with chronic rhinosinusitis. Genomic DNA variations are connected with the inflammation mode in sinuses. 1L-1 production level influences the functional activity of phagocytes.
Key words: cytokines, rhinosinusitis, functional gene polymorphism, phagocytosis.
Bibliography: 10 sources.
Все формы хронического риносинусита (ХРС) имеют свои особенности в этиологии, патогенезе и клиническом течении периодов обострений и длительности ремиссий. Это может объясняться рядом причин - например, анатомические особенности строения полости носа и околоносовых пазух; увеличение числа возбудителей бактериальных инфекций, устойчивых к антибактериальной терапии; нарушение нормального функционирования факторов общего и местного иммунитета и изменение мукоциллиарного клиренса.
Иммунная система, созданная для защиты организма от внедрения чужеродных агентов, имеет огромный потенциал функционально активных веществ, способных выстроить мощный барьер. К факторам защиты можно отнести: клетки иммунной системы (лейкоциты, лимфоциты, фагоциты, вспомогательные клетки и т. д.) и растворимые медиаторы (антитела, цитоки-ны, комплемент, интерфероны). Иммунная система представляет собой хорошо отлаженный механизм, при внедрении в него чужеродной частицы возникает каскад иммунологических реакций, приводящих к элиминации патогена.
Одну из ведущих ролей играют цитокины, участвующие в инициации, развитии и быстром завершении воспалительного процесса. К настоящему времени у человека идентифицировано уже более ста различных цитокинов, и постоянно появляются сообщения об открытии новых [4, 5, 6]. IL-1e - цитокин, относящийся к важнейшему семейству IL-1, оказывает типичное для всех цитокинов разноплановое воздействие на многие системы органов.
Патогенез ХРС рассматривается с позиции иммунного ответа при воспалительном процессе. Однако, данные об иммунном статусе человека достаточно противоречивы. Одни ученые в своих исследованиях доказывают отсутствие активации, другие, наоборот, говорят о гиперреактивности иммунных механизмов при хронически протекающем процессе в околоносовых пазухах. Этот факт заставляет учёных всего мира вести поиск новых этиопатогенетических данных, объясняющих развитие хронической гнойной патологии.
Современная наука развивается стремительно благодаря успешному внедрению нанотехнологий, позволяющих взглянуть на различные по своей этиологии заболевания с позиции генетически обусловленных состояний. За последние годы в области молекулярной генетики открытие метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) стало одним из значимых событий. Это позволяет поднять медицинскую лабораторную диагностику на качественно новый уровень.
Несомненно, постановка диагноза на раннем этапе развития даёт возможность благоприятного прогноза и лечения возникающего заболевания. В рамках проекта «Геном человека» учёные продолжают искать мутации, которые ассоциированы с различными патологиями.
Известно, что различные заболевания, как воспалительного так и не воспалительного ге-неза, могут быть определены функциональным полиморфизмом генов [7, 8, 9].
Так, в ранних исследованиях показано, что хронические гнойные заболевания околоносовых пазух обусловлены нарушением баланса выработки провоспалительных цитокинов IL-1e и IL-1RA. Точечные замены нуклеотидов, несущие мутационные изменения в кодирующем белке семейства IL-1, приводят к сбою функционирования всей цитокиновой системы [1].
Цитокины регулируют процессы активации, пролиферации и дифференцировки клеток в ходе иммуногенеза [2]. Из литературных источников известно, что белки IL-1e и IL-8 тесно связаны между собой как цитокины, обеспечивающие взаимодействие клеток иммунной системы [5, 6]. Так - при низких показателях IL-1e должны быть невысокие показатели хемо-кина - активатора фагоцитоза[4], которому отводится одна из ведущих ролей в иммунологическом ответе.
Функциональный полиморфизм генов ^-1, изменяя структуру кодируемых белков, меняет характер экспрессии и продукции провоспалительных цитокинов, влияя на характер течения воспалительного процесса в околоносовых пазухах. Больные, имеющие высокопродуци-рующие гены ^-1е*2, реагируют на воспаление остро. Клинические проявления заболевания характеризуются высокими цифрами температуры тела, болями в области проекции околоно-совых пазух и головы, обилием отделяемого из носа, выраженным отёком слизистой оболочки носа и т. д. Этот феномен объясняется повышенным выбросом в ток крови и местно в очаг воспаления LI-1e, известного как цитокин острофазового ответа, позволяющий воспалительному процессу пройти все стадии развития и завершиться выздоровлением.
^-1 стимулирует специфическое звено иммунитета, воздействуя на функциональную активность фагоцитарных клеток, инфильтрирующих слизистую оболочку носа и околоносовых пазух. Увеличение уровня ^-1 ускоряет выход нейтрофильных гранулоцитов в кровяное русло с развитием нейтрофилии. Белок ^-1 является пусковым фактором, заводящим работу целой плеяды цитокинов, регулирующих каскад ответных механизмов, направленных на эвакуацию патогена из организма.
Цель. Анализ фагоцитарной активности нейтрофилов у больных гнойным риносинуси-том с различными генотипами.
Пациенты и методы исследования
Отбор больных для исследования проводился на базе СПбНИИ уха, горла носа и речи. Нами было обследовано 93 пациента ХРС в возрасте от 18 до 60 лет. Большинство отобранных для исследования больных имели давность заболевания от 5-ти до 10-ти лет. Следовательно, заболевание имело достаточно длительное течение.
Метод хемилюминесценции (ХЛ), получивший в последние годы широкое распространение, основан на том, что любой биологический процесс в живом организме сопровождается выбросом кванта света. Однако световой импульс очень мал, уловить его можно только многократно усилив, с помощью специальных реагентов - аплификаторов (люминол, люцегинин). Регистрация усиленного сигнала производится приборами люминометрами. Наши исследования были проведены с помощью мультисканирующего люминометра Victor-2, позволяющего использовать очень малые количества реагентов.
Для исследования использовали венозную кровь, стабилизированную гепарином (20 МЕ/мл).
Алгоритм проведения реакции
В лунки 96-луночной белой, непрозрачной платы раскапывали по 20 мкл исследуемого материала (кровь, смыв из околоносовых пазух), добавляли вещества, стимулирующие функциональную активность клеток воспаления (форбол-миристат ацетат, опсонизированный зи-мозан), содержащихся в исследуемом материале, 40 мкл раствора люминола в конечной концентрации 10-4 М, общий объем реактогенной среды доводили раствором Хенкса до 200 мкл. Все исследования проводили в 3-х параллелях. Регистрацию реакции проводили в течение 1 часа, при 37о С.
Результат реакции выражали светосуммой, т. е. количеством импульсов, накопленных за время эксперимента.
Приготовление реагентов
Люминол - является веществом, акцептирующим на себя весь пул свободнорадикальных форм кислорода (супероксидрадикал, гидроксил радикал, синглентный кислород), а также перекиси водорода и миелопироксидазы, продуцируемых клетками воспалительной реакции (нейтрофилы, макрофаги) при их активации. 17,7 мг люминола, растворяли в 10 мл диметил-сульфоксида (ДМСО), получали маточный раствор, который хранили при температуре холодильника в течение 1 месяца. Перед исследованием приготовляли рабочий раствор, растворяя 1 объем маточного раствора люминола в 10 объемах раствора Хенкса.
Форбол-миристат ацетат (ФМА) относится к группе форболовых эфиров, является неспецифическим активатором функциональной активности клеток воспаления, действует непосредственно через протеинкиназный путь активации, минуя рецепторный аппарат. ФМА вызывает ряд последовательных реакций в клетке, приводя к мощному оксидативному взрыву
Российская оториноларингология №6 (43) 2009
и выбросу свободнорадикальных форм кислорода. Использование данного активатора, по мнению большинства исследователей, позволяет оценить оксидативный потенциал клетки. ФМА использовали в реакции в концентрации 10 нг/мл.
Зимозан - фрагмент клеточной стенки пекарских дрожжей, употребляется в реакции также в качестве активатора клеток воспалительной реакции. Использование данного активатора позволяет оценить интенсивность оксидативного взрыва, возникающего в нейтрофильных клетках в результате рецепторного взаимодействия, опсонизированного компонентами комплемента зимозана с С3в рецепторами на поверхности клетки. Проведение реакции с опсонизи-рованным (опс) зимозаном является вариантом реакции фагоцитоза.
Зимозан в количестве 10мг разводят в 10 мл раствора №С1 0,9%, кипятят в течение 30 минут для получения гомогенной взвеси, дважды отмывают изотоническим раствором, ре-суспедируют в 2,5 мл того же раствора, добавляют эквивалентное количество пулированной (не менее 4 человек) сыворотки крови человека и помещают на 40 минут в термостат при температуре 37о С. После отмывания от избытка сыворотки зимозан разводят 10 мл изотонического раствора и аликвотируют по 500 мкл в пластиковые пробирки. Хранят при М8о С в течение месяца.
Результаты
Как было отмечено ранее в разделе «Пациенты и методы исследования», нами было предложено изучение люминолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ), используя два индуктора: неспецифический индуктор «кислородного взрыва» - форболовый эфир ФМА (форбол миристат ацетат) и специфический индуктор - опсонизированный сывороткой крови человека зимозан, включающий окислительно-восстановительные процессы в клетке через С3Ь рецепторы, опосредующие фагоцитарный процесс. Данная схема исследования позволяет одновременно оценивать окислительно-восстановительный потенциал воспалительных клеток, а также их фагоцитарную активность.
Анализ полученных результатов при обследовании 93 больных хроническим риносинуси-том (ХРС) показал, что 30 пациентов являлись носителями генотипа «1/1»1Ь-1е& имели спонтанную реакцию хемилюминесценции 5,2(±0,2) (рис. 1), ЛЗХЛ в ответ на ФМА 13,7(±0,9) (рис. 2) и ответ на зимозан 22(±3,4) (рис. 3). Больные с низким хемилюминесцентным ответом на оба индуктора имеют резко сниженную функциональную активность фагоцитирующих клеток: у них угнетены окислительно-восстановительные процессы, а также снижена экспрессия рецепторов, опосредующих фагоцитоз.
Рис. 1. Уровень спонтанной ЛЗХЛ у больных с различными аллелями генов К-1е1
^110Ь.
о ■
1 \1 1 \2 2\2
Рис. 2. Особенности ответа клеток периферической крови у больных с различными аллелями генов К-1е на ФМА в реакции ЛЗХЛ.
Рис. 3. Особенности ответа клеток периферической крови у больных с различными аллелями генов К-1е на опсонизированный зимозан в реакции ЛЗХЛ.
Обращают на себя внимание 53 пациента, являющиеся носителями гетерозиготы «1/2»^-1е, у которых спонтанная продукция ХЛ была низкая 5(±0,1), ЛЗХЛ в ответ на ФМА не превышал 20,6(±1,8) и ответ на зимозан в среднем равнялся 42,6(±3,8). У больных этой группы был снижен окислительный потенциал, но фагоцитарная активность клеток была сохранна.
У 10 больных, носителей высокопродуцирующих аллелей гена «2/2»^-1е, отмечались пиковые значения хемилюминесценции: так, спонтанная реакция равнялась 5,3(±0,1), ЛЗХЛ в ответ на ФМА 26,1(±1,9) и ответ на зимозан 69,6(±7,1). Больные с высокими показателями ЛЗХЛ в ответ на оба индуктора имели ответ на опсонизированный зимозан, иногда в 3-4 раза превышающий нормальные показатели.
Больные с высокими показателями ХЛ отмечали в периодах обострения заболевания высокую температурную реакцию с максимальными цифрами, доходящими до 39°С, обилие гнойного отделяемого из носа, головные боли пульсирующего характера, заложенность носа. Рецидив у данной группы больных купировался несколькими курсами антибактериальной терапии и заканчивался назначением респираторных фторхинолонов. Наступающий период выздоровления, возможно, обусловлен способностью хинолонов связываться с сывороточными белками на 46% и проникать в различные органы, ткани и клетки, создавая в них концентрации, превышающие во многих случаях сывороточные [3], соответственно, действуя на моноциты человека, а также влияя на гуморальный и клеточный иммунитет, «сглаживая» острофазовый ответ. Известно, что фторхинолоны, накапливаясь в сывороточных белках крови, подавляют выработку ^-1е, ^-18, TNF-5, ф-интерферона, колоний стимулирующего фактора (СSF) и ^-12 и повышают уровень ^-2 - противовоспалительного цитокина, проявляя иммуномодулирующую активность посредством увеличения продукции простагландина Е2 и тем самым оказывая терапевтический эффект при острой воспалительной реакции, обусловленной каскадом иммунных - цитокино-вых взаимодействий, пусковым механизмом которого считается ^-18 (^-1)[10].
Проблема иммунологической резистентности организма постоянно находится под пристальным вниманием учёных, поскольку от функционирования всех факторов системы «защиты» зависит ответ организма на внедрение патогенов извне. Выброс основных медиаторов воспаления координирует механизмы иммунного ответа и является одним из основополагающих рычагов для возможности полноценного завершения фаз воспаления в околоносовых пазухах.
Мультикаскадные цитокиновые реакции активизируют макрофагальное звено, осуществляющее элиминацию микроорганизмов из очага воспаления. Активированные нейтрофилы, как клеточные факторы неспецифической резистентности, в числе первых отвечают за развитие и исход заболевания, следовательно способность нейтрофилов к полноценному фагоцитозу играет принципиальную роль в патофизиологическом процессе.
Выводы:
Больные носители высокопродуцирующих генов IL-1e*2 имеют высокие уровни ответа хемилюминесценции (ХЛ).
Больные носители низкопродуцирующих генов IL-1e*1 имеют низкие уровни ответа ХЛ. Функциональный полиморфизм генов IL-1I опосредованно определяет функциональную активность клеток нейтрофильного звена.
ЛИТЕРАТУРА
1. Влияние функционального полиморфизма генов семейства интерлейкина-1 на предрасположенность и характер течения хронического гнойного риносинусита и эффективность терапии рекомбинантным-1 бета (Беталейкин). II. Влияние полиморфизма генов семейства интерлейкина-1 на степень эффективности местной терапии рекомбинантным интерлейкином-1 бета (Беталейкин) / Тимчук Л. Э. [и др.] // Рос. оторинолар. -2005. - №2. - С. 84-87.
2. Исследование содержания интерлейкина-1е в сыворотке крови больных системной красной волчанкой и ревматоидным артритом / Кетлинский С. А. [и др.] // Терапевтический архив. - 1993. - Т. 65. - N12. - С. 51-54.
3. Лучихин Л. А., Троицкий С. А. Этиотропная терапия спарфлоксацином в ЛОР - практике / Вестн. оторинолар.
- 2005. - №6. - С. 43-45.
4. Ройт А., Иммунология: Пер. с англ. Дж. Бростофф, Д. Мейл. - М.: Мир, 2000. - 581 с.
5. Руководство по клинической иммунологии, аллергологии, иммуногенетике и иммунофармакологии / А. А. Михайленко [и др.] - М.: Триада, 2005. - Т. 1. - 511 с.
6. Руководство по клинической иммунологии, аллергологии, иммуногенетике и иммунофармакологии / А. А. Михайленко[и др.] - М.: Триада, 2005. - Т. 2. - 559 с.
7. A polymorphism of the interleukin-1 beta gene at position +3953 influences progression and neuro-pathological hallmarks of Alzheimer’s disease / Licastro F. [et al.] // Neurobiol Aging. -2004. - Vol. 25(8). - Р 1017-1022.
8. Assessment of the interleukin 1 gene cluster and other candidate gene polymorphisms in host susceptibility to tuberculosis / Bellamy R. [et al.] // Tuber Lung Dis. - 1998. - Vol. 79 (2). - Р 83-89.
9. Cytokine gene polymorphisms and the susceptibility to liver cirrhosis in patients with chronic hepatitis C / Bahr M. J. [et al.] // Liver Int. - 2003. - Vol. 23 (6). - Р 420-425.
10. Effect of Ciprofloxacin-Induced Prostaglandin E2 on Interleukin-18-Treated Monocytes / Hideo Kohka Takahashi [et al.] // Antimicrob Agents Chemother. - 2005. - Vol. 49 (8). - P. 3228-3233.
