CC BY
11Российская оториноларингология №1 (38) 2009
3. Темираева З. К. Объективная оценка результатов консервативной терапии односторонних параличей гортани методом акустического анализа голоса/ З. К. Темираева // Рос. оторинолар. - 2008. - № 1 (32). - С. 142-147.
4. Чернобельский С. И. Клинико-функциональная оценка результатов лечения больных с односторонним парезом гортани методом многопараметрового акустического анализа голоса / С. И. Чернобельский // Вестн. оторинолар. - 2005. - № 3. - С. 17-19.
5. A basic protocol for functional assessment of voice pathology, especially for investigating the efficacy of (phonosurgical) treatments and evaluating new assessment techniques / P. H. Dejonckere, P. Bradley, P Clemente and al. // Eur. Arch. Otorhinolaryngol. - 2001. - № 258. - P 77-82.
6. Eskenazi L. Acoustic correlates of vocal quality / L. Eskenazi, D. G. Childers, DM. Hicks // J. Speech Hear Res. -1990. - № 33. - P 298-306.
7. Perceptual evaluation of voice quality: review, tutorial and a framework for future research. / J. Kreiman, B. R. Gerratt,
G. B. Kempster et al. // J. Speech Hear Res. - 1993. - № 36. - P 21-40.
8. Vocal cord paralysis following carotid endarterectomy: the paradox of return to function. / Sannela N. A., Tober R. L., Cipro R. P, et al. // Ann Vasc Surg. - 1990. - Vol. 4 - P 42-45
УДК: 616. 216-002: 616. 155. 3-008. 13: 575. 191
РОЛЬ ФУНКЦИОНАЛЬНОГО ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ СЕМЕЙСТВА 1Ь-1 В АКТИВАЦИИ ФАГОЦИТИРУЮЩИХ КЛЕТОК НЕЙТРОФИЛЬНОГО ЗВЕНА ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ РИНОСИНУСИТЕ Л. Э. Тимчук, Д. Ю. Семенюк
ФГУ «Санкт-Петербургский НИИ ЛОР Росмедтехнологий»
(Директор - засл. врач РФ, проф. Ю. К. Янов)
Несмотря на более чем 100-летнюю историю теоретической и практической оториноларингологии вопрос этиопатогенеза и лечения риносинуситов остаётся открытым. Последние 15 лет были отмечены поистине революционными событиями в фундаментальной науке. Так при хронических риносинуситах выявлен ряд бактерий, грибов и вирусов, провоцирующих развитие воспаления [8, 9, 17, 18], изучены механизмы нарушения мукоцилиарного клиренса, особенности иммунологических реакций и сделаны первые шаги в понимании данной патологии с позиции иммуногенетики [1, 2, 3, 5,]. Однако вопрос о единой причине возникновения гнойного процесса в околоносовых пазухах остаётся открытым. Изучение цитокинового профиля в периферической крови и местно в очаге воспаления у больных ХГРС является основополагающим для определения иммунологического статуса т. к. известно, что провоспалительные цитокины играют доминантную роль в развитии воспалительной реакции в тканях [4, 6]. Активация общих и местных факторов защиты определяется уровнем цитокинов в токе крови и местно в очаге воспаления. ^-1е -провоспалительный цитокин регулирующий ключевые моменты в развитии воспалительного процесса [12]. Выработка ^-1е балансируется уровнем ^-ША, выполняющим роль стабилизатора продукции цитокинов семейства ^-1. Описанный дисбаланс в продукции ^-1е и ^-ША в сторону увеличения доли последнего [10, 11] при ХГРС, указывает на несостоятельность факторов защиты как в очаге воспаления так и в целом организме. В настоящее время доказано, что функциональный полиморфизм генов, кодирующих белки ^-1 несущих точечные замены нуклеотидов приводят к сбою всей системы цитокинового профиля. Так при всплеске ^-1е синтезируется про-воспалительный цитокин ^-8 который в свою очередь стимулирует фагоцитарную активность нейтрофильного звена [7, 14, 16]. Хемокины необходимы для привлечения лейкоцитов в места проникновения инфекции для инактивации и удаления из организма патогенов[13, 15]. Однако хроническое накопление лейкоцитов при персистирующей инфекции играет патогенетическую роль в развитии воспаления в околоносовых пазухах. ^-8 синтезируется самими привлечёнными в очаг воспаления нейтрофилами. Продукция хемокинов приводит к ещё большему привлечению лейкоцитов и формированию хронического гнойного очага.
Таким образом, присутствие в геноме больных ХГРС сочетаний ^-1е#(+3953)+/^ША*2, ^-1е#(+3953)У^ША*2+ и ^-1е#(+3953)+/^ША*2+ может оказывать существенное влияние на уровень продукции этих белков, а соответственно снижать выработку ^-8, который оказывает воздействие на фагоцитирующие клетки [13,15].
Цель. В данной работе анализировались распределение нормальных и полиморфных вариантов генов ^-1е (+3953) и ^-ША*2 у пациентов страдающих ХГРС, а также оценивалось влияние этих полиморфизмов на фагоцитарную активность нейтрофильного звена в мононук-леарах периферической крови и в клетках промывной жидкости верхнечелюстных пазух.
Материалы и методы. Отбор больных для исследования проводился на базе СПбНИИ уха, горла, носа и речи. Нами было обследовано 98 больных ХГРС и 152 здоровых донора возрасте от 18 до 60 лет. Всего 250 человек, из них 115 мужчин и 135 женщин. Большинство отобранных для исследования больных имели давность заболевания от 5-ти до 10-ти лет. Следовательно, заболевание имело достаточно длительное течение. Благодаря этому, можно объективно оценить результаты обследования больных.
Метод хемилюминесценции (ХЛ), получивший в последние годы широкое распространение, основан на том, что любой биологический процесс в живом организме сопровождается выбросом кванта света. Однако световой импульс очень мал, уловить его можно только многократно усилив, с помощью специальных реагентов аплификаторов (люминол, люцегинин). Регистрация усиленного сигнала производится приборами люминометрами. Наши исследования были проведены с помощью мультисканирующего люминометра, позволяющего использовать очень малые количества реагентов.
Для исследования использовали венозную кровь, стабилизированную гепарином (20 МЕ/мл) и смыв из верхнечелюстных пазух. Воспалительные клетки, содержащиеся в смыве отмывали изотоническим раствором дважды при 1500 об/мин в течение 10 минут, ресуспендировали в растворе Хенкса в концентрации 1х106 клеток/мл и использовали в реакции.
Алгоритм проведения реакции:
В лунки 96-луночной белой, непрозрачной платы раскапывали по 20 мкл исследуемого материала (кровь, смыв из околоносовых пазух), добавляли вещества стимулирующие функциональную активность клеток воспаления (форбол-миристат ацетат, опсонизированный зи-мозан), содержащихся в исследуемом материале, 40 мкл раствора люминола в конечной концентрации 10-4 М, общий объем реактогенной среды доводили раствором Хенкса до 200 мкл. Все исследования проводили в 3-х параллелях. Регистрацию реакции проводили в течение 1 часа, при 37о С.
Результат реакции выражали светосуммой, т. е. количеством импульсов накопленных за время эксперимента.
Приготовление реагентов:
Люминол - является веществом акцептирующим на себя весь пул свободнорадикальных форм кислорода (супероксидрадикал, гидроксил радикал, синглентный кислород), а также перекиси водорода и миелопироксидазы продуцируемых клетками воспалительной реакции (нейтрофилы, макрофаги) при их активации. 17,7 мг люминола, растворяли в 10 мл диметил-сульфоксида (ДМСО), получали маточный раствор, который хранили при температуре холодильника в течение 1 месяца. Перед исследованием приготовляли рабочий раствор, растворяя
1 объем маточного раствора люминола в 10 объемах раствора Хенкса.
Форбол-миристат ацетат (ФМА) относится к группе форболовых эфиров, является неспецифическим активатором функциональной активности клеток воспаления, действует непосредственно через протеинкиназный путь активации, минуя рецепторный аппарат. ФМА вызывает ряд последовательных реакций в клетке, приводя к мощному оксидативному взрыву и выбросу свободнорадикальных форм кислорода. Использование данного активатора, по мнению большинства исследователей, позволяет оценить оксидативный потенциал клетки. ФМА использовали в реакции в концентрации 10 нг/мл.
Зимозан - фрагмент клеточной стенки пекарских дрожжей, употребляется в реакции также в качестве активатора клеток воспалительной реакции. Использование данного активатора
позволяет оценить интенсивность оксидативного взрыва, возникающего в нейтрофильных клетках в результате рецепторного взаимодействия опсонизированного компонентами комплемента зимозана с С3в рецепторами на поверхности клетки. Проведение реакции с опсонизи-рованным (опс) зимозаном, является вариантом реакции фагоцитоза.
Зимозан в количестве 10мг разводят в 10 мл раствора NaCl 0,9 %, кипятят в течение 30 минут для получения гомогенной взвеси, дважды отмывают изотоническим раствором, ресуспедиру-ют в 2,5 мл того же раствора, добавляют эквивалентное количество пулированной (не менее 4 человек) сыворотки крови человека и помещают на 40 минут в термостат при температуре 37оС. После отмывания от избытка сыворотки зимозан разводят 10 мл изотонического раствора и аликвотируют по 500 мкл в пластиковые пробирки. Хранят при t-18° С в течение месяца.
Уровни цитокинов в сыворотках крови, лаважах и супернатантах клеток определяли методом твердофазного ИФА, используя полистироловые планшеты, тест-системы (IL-1 и IL-8). Концентрацию конкретного цитокина в образце определяли по калибровочной кривой соотношения оптической плотности раствора в лунке и известной концентрации данного цитоки-на в качестве стандарта, умножая на соответствующее разведение образца.
Материалом для молекулярно-генетического анализа полиморфизма генов IL-4e и IL-1RA служили образцы высокомолекулярной ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической крови больных и здоровых лиц с использованием раствора для выделения ДНК. Варианты аллелей гена IL-e, нормальные и несущие точечные замены нуклеотидов C/Т в районе 5-го экзона в позиции +3953, определялись методом ПДРФ-анализа (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома. ПЦР-реакцию проводили в 10 мкл реакционной смеси, с использованием TE-Taq-ДНК-полимеразы и соответствующего готового буфера, праймеров 5‘ - GTT GTC ATC AGA CTT TGA CC - 3‘, 5‘ -TTC AGT TCA TAT GGA CCA GA - 3‘ [6], синтезированных в НПО. Режим амплификации составлял 35 циклов (940C 2 мин, 550C 1 мин, 720C 1 мин) с конечной инкубацией продукта реакции в течение 10 мин при 720С. Длина получаемого фрагмента составляла 249 п. о. полученный амплификат инкубировали с ферментом рестрикции TaqI (0,25 ед/мкл, 3 часа при 650С). Продукты рестрикции разделяли электрофоретически в 2-3 %-ном агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ-свете. В качестве маркера размера фрагментов ДНК использовали набор маркеров молекулярного веса с шагом 50 п. о.. При наличии в геноме нормального аллеля детектировались два фрагмента (135 и 114 п. о.), при полиморфной мутации продукт амплификации оставался целым, у гетерозиготных индивидов определялись три фрагмента ДНК (114, 135, 249 п. о.). Генотипирование IL-1RA проводили в тех же условиях методом ПЦР: амплифицировался участок ДНК, содержащий тандемные повторы по 86 п. о. в районе интрона 2, аллельный тип определялся по длине получаемого продукта амплификации при электрофоретическом разделении. Нормальный вариант гена IL-1RA содержит четыре таких повтора (размер получаемого фрагмента 410 п. о.), наиболее значимым из полиморфных вариантов является аллель IL-1RA*2, несущий два повтора (240 п. о.) (рис. 1), остальные варианты (325, 500, 595 п. о.) встречаются крайне редко - суммарно менее, чем у 1 % популяции [10] и в данной работе не рассматривались. Использовались праймеры 5‘ - CTC AGC AAC ACT CCT AT - 3‘, 5‘ - TCC TGG TCT GCA GGT AA - 3‘ [10], режим амплификации составлял 35 циклов (940C 1 мин, 600C 1 мин, 720C 1 мин) с конечной инкубацией продукта реакции в течение 10 мин при 720С. Для краткого обозначения аллелей генов IL-1e и IL-1RA были приняты следующие сокращения: нормальный, не несущий выявляемую мутацию, аллель обозначался цифрой 1, полиморфный - 2, гомозиготные варианты - «1/1» и «2/2», гетерозиготный - «1/2».
Экспрессия генов IL-1e и IL-1RA на уровне мРНК тестировалась у 27 случайно выбранных больных до начала лечения методом ОТ-ПЦР с конечной электрофоретической детекцией количества полученного амплификата. Образцы тотальной РНК выделялись из 3-5*106 клеток, выделенных из промывной жидкости верхнечелюстных пазух, с использованием раствора TRI-Reagent. Синтезировалась кДНК в реакции обратной транскрипции при инкубации 1 мкг тотальной РНК в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 100Е обратной транскрип-
тазы M-MuLV, по 1мМ каждого dNTP, готовый реакционный буфер, 10Е ингибитора РНК-аз и
0,1 мкг гексануклеотидных праймеров. Инкубация продолжалась 1 час: 10 мин. при 940С, 45 мин. - 420С, 5 мин. - 950С. ПЦР с кДНК проводили в 20 мкл реакционной смеси, в присутствии специфических праймеров для IL-1e, IL-1RA [GeneBank], синтезированных в НПО. Режим амплификации составлял 30 циклов (45 сек. 940С, 45 сек. 610С, 1 мин. 720С) с финальной инкубацией 10 мин. при 720С. Пластины с гелем помещали на стекло трансиллюминатора и фотографировали видеокамерой, результаты интенсивности флюоресценции полос обрабатывали с помощью пакета программ Gel Imager и Gel Analysis. В качестве позитивного контроля для каждой пробы определялась экспрессия фермента GAPDH, постоянно экспрессирующегося в клетке. Индекс экспрессии генов цитокинов на уровне мРНК рассчитывался для каждой пробы как соотношение интенсивности флуоресценции в геле полосы цитокина и GAPDH.
Результаты
Проводился детальный анализ распределения сочетаний полиморфных вариантов генов IL-1e и IL1RA у больных ХГРС и здоровых доноров (табл. 1).
Таблица 1
Носительство сочетаний вариантов генов 1Ь-1е и 1Ь-ША в группах больных ХГРС и здоровых доноров (больные / %)
Сочетание генов IL-1e IL-1RA I группа n=27 II группа n=43 III группа n=28 Всего больных n=98 Доноры n=152
1/1 1/1 0 2 5 7/7,14% 33/21,7%
1/1 1/2 1 3 8 12/12,2% 29/19%
1/1 2/2 8 2 1 11/11,2% 7/4,6%
1/2 1/1 0 2 7 9/9,2% 49/32,2%
1/2 1/2 8 16 0 24/24,4% 25/16,4%
/2 2/ /2 10 15 0 25/25,5% 3/1,9%
2/2 1/1 0 3 7 10/10,2% 6/3,9%
Полиморфизм гена ^-ША оказывал влияние на низкую фагоцитарную активность у больных I группы. Все больные этой группы являлись носителями варианта ^-ША*2. Наиболее низкие значения в сравнении с группой здоровых доноров имели носители гаплотипов «1/1» ^-1е +«2/2»^-№А, «1/2»^-1е +«1/2»^-№А и «1/2»^-1е +«2/2»^-№А.
Больные II группы имели смешанные гаплотипы. Однако наиболее обращает на себя внимание сочетание генотипов «1/2»^-1е+»1/2»^-ША и «1/2»^-1е+»2/2»^-ША. Больные данной группы по сумме клинических признаков и сопутствующих патологий были наиболее разнообразны. Так хроническая патология нёбных миндалин отмечалась у 59 % пациентов, среднего уха 36 %, а также 15 % больных страдали хронической сенсоневральной тугоухостью.
При анализе гаплотипов ^-1е+^-ША установлено, что индивидуумы гомозиготных нормальных вариантов этих генов имели высокий ответ на оба индуктора и вошли в III группу, у этих больных ответ на ФМА 30,6±2,6 имп/сек был также выше в сравнении с той же группой здоровых доноров 20,7±2,1 имп/сек (табл. 2).
Однако больные III группы кроме носителей «1/2»^-1£ +«1/2»^-ША и «1/2»^-1£ +«2/2» ^-ША, имели достаточно низкий уровень спонтанной ЛЗХЛ 5,1±0,1 имп/сек в сравнении с реакцией на зимозан и ФМА, что обуславливало нарушение очерёдности фаз фагоцитоза, но дефекта фагоцитарной системы у этих больных не отмечалось.
Таким образом, носительство варианта ^-ША*2 определяло снижение функциональной активности клеток венозной крови больных ХГРС.
С диагностической и лечебной целью проводили пункции верхнечелюстных пазух по общепринятым стандартным методикам в условиях местной анестезии. Исследование ЛЗХЛ пунктата было проведено 98-ми пациентам страдающим хроническим гнойным риносинуситом.
Также изучалось влияние полиморфизма генов ^-1е и ^-ША на функциональную ак-
тивность нейтрофилов непосредственно в очаге воспаления - в клетках промывной жидкости верхнечелюстных пазух.
Клеточный состав смывов в основном был представлен нейтрофильными клетками. Изучение ЛЗХЛ проводили также с использованием 2-х индукторов. Для того чтобы результаты исследования были сопоставимы, перед исследованием проводили количественный подсчет клеток смывов.
Содержание клеток в исследуемом смыве после 2-х кратного отмывания изотоническим раствором доводили до 1 млн/мл. Исследование ЛЗХЛ смывов проводили до лечения.
Первоначальный анализ полученных результатов показал, что уровни ЛЗХЛ смывов из околоносовых пазух колебались в широком диапазоне от 12,2 имп/сек за время исследования (30 минут) до 2495,4 имп/сек в связи, с чем нами было выделено 3 группы больных в зависимости от интенсивности ЛЗХЛ (табл. 3).
Таблица 2
Особенности ответа клеток периферической крови больных хроническими гайморитами на различные индукторы в реакции ЛЗХЛ (имп/сек)
Группы обследованных больных Количество человек в группе Уровень спонтанной ЛЗХЛ Уровень ЛЗХЛ в ответ на ФМА Уровень ЛЗХЛ в ответ на опс. Зимозан
1-я 27 5,3±0,1 12,7±0,5 13,6±0,5
2-я 43 5,1±0,1 14,4±0,5 30,2±2,0
3-я 28 5,1±0,1 30,6±2,6 70,6±4,5
Здоровые доноры 152 5,3±0,1 20,7±2,1 25,3±1,9
Таблица 3
Особенности спонтанной и индуцированной ЛЗХЛ клеток смывов из гайморовой пазухи (имп/сек)
№ гр. Уровни интенсивности ЛЗХЛ Кол-во больных Уровень спонтанной ЛЗХЛ Уровень ЛЗХЛ в ответ на ФМА Уровень ЛЗХЛ в ответ на опс. Зимозан
1 Низкий 23 11,2±2,0 35,8±5,6 28,9±4,8
2 Средний 43 67,3±22,0 290,8±33,4 253,8±38,2
3 Высокий 32 141,3±3,7 1012,1±147 1180,3±144
Уровни ответа:
1. низкий
2. средний
3. высокий
Как видно из таблицы 3, при низком уровне ответа, ответ на ФМА не превышал 35,8±5,6 имп/сек за 30 мин исследования, а опсонизированный зимозан был равен 28,9±4,8 имп/сек. В то время как уровень спонтанной ЛЗХЛ был наименьшим 11,2±2,0 имп/сек.
У больных носителей варианта «2/2»^-ША, также отмечались низкие значения ответа на ФМА, опсонизированный зимозан и спонтанную ЛЗХЛ (табл. 3), однако обращают на себя внимание гаплотипы «1/1»^-1е +«2/2»^-ША и «1/2»^-1е +«2/2»^-ША, носительство сочетаний этих генов влияло на клиническую симптоматику. Так клинический анализ больных с низким уровнем ответа ЛЗХЛ показал, что (по данным анамнеза) длительность рецидива заболевания в данной группе больных превышала 15 дней до момента обращения в стационар. Больные отмечали наличие слизисто-гнойного отделяемого и в межрецидивный период. Данный факт косвенно подтверждает нарушение фагоцитоза и невозможность полного завершения воспалительного процесса в околоносовых пазухах.
Средний уровень ответа на ФМА был отмечен у больных ХГРС и равнялся 290,8±33,4 имп/сек, на опсонизированный зимозан 253,8±38,2 имп/сек. Больные имеющие средний уровень ответа были носителями различных гаплотипов, однако большинство из них являлись носителями «1/2»^-1е +«1/2»^-ША и «1/2»^-1е +«2/2»^-ША. Следует отметить, что больные имеющие средний уровень ответа местно в очаге воспаления относились к II группе больных при определении хемилюминесцентной активности периферической крови (табл. 2).
В группе с высокими показателями средние показатели ответа на ФМА - 1012,1±1472 имп/ сек, на опсонизированный зимозан - 1180,3±144 имп/сек.
Наиболее высокий уровень отмечался в III группе больных, наивысшие медианы значений спонтанной и индуцированной ЛЗХЛ клеток отмечались у больных носителей гаплоти-пов «1/1»^-1е +«1/1»^-№А, «1/2»^-1е +«1/1»^-№А и «2/2»^-1е +«1/1»^-№А. Уровень спонтанной ЛЗХЛ у больных III группы превышал в 12, 8 раз уровень спонтанной ЛЗХЛ,
II группы, уровень ЛЗХЛ в ответ на ФМА в 28,9 раз, а уровень ЛЗХЛ в ответ на опсонизированный зимозан в 42,1 раза. Данное наблюдение сочетаний гаплотипов «1/1»^-1е +«1/1»^-ША, «1/2»^-1е +«1/1»^-ША и «2/2»^-1е +«1/1»^-ША с высокой фагоцитарной активностью характеризует остроту воспаления в околоносовых пазухах. Больные, имеющие высокий уровень интенсивности имели в анамнезе наименьшее число рецидивов в год. Однако возникающие периоды обострений сопровождались яркой клинической картиной - обилием слизистогнойного отделяемого из носа, повышением температуры тела до 38,5°С, головными болями.
Обращает на себя внимание высокий спонтанный уровень ЛЗХЛ во всех 3-х группах больных (табл. 3). Даже в группе с низкой активностью ЛЗХЛ спонтанный уровень реакции в 2 раза превышал уровень фона (5-6 имп/сек). По-видимому, высокий спонтанный уровень ЛЗХЛ клеток содержащихся в смывах из носа обусловлен массивным фагоцитозом микрофлоры, содержащейся в полости околоносовых пазух хотя «качество» фагоцитоза значительно разнится.
Значительные различия в интенсивности хемилюминесцентного ответа на индукторы клеток из очага воспаления, по всей вероятности отражают уровень функциональной активности этих клеток.
Согласно проведённому скринингу, ХГРС ассоциирующийся с полиморфизмом гена ^-ША*2 (VNTR) (73,4 %) и сочетаниями «1/1»^-1е +«2/2»^-№А, «1/2»^-1е +«1/2»^-№А и «1/2» ^-1е +«:2/2»^-ША обуславливают снижение функциональной активности нейтрофилов, как в периферической крови, так и в очаге гнойного воспаления. Следовательно, полиморфизм этих генов может являться одной из главных причин нарушения фагоцитоза. Так снижение уровня сывороточной продукции ^-1е (2,37±1,2) в сравнении со здоровыми донорами ^-1е (33,1±20,1) гарантированно пролангирует снижение синтеза ^-8(3,4±2,1), относительно тех же доноров ^-8(36,1±29,1) - ответственного за стимуляцию фагоцитоза (рис. 2).
У здоровых доноров сочетание генов «:1/2»^-1е+»2/2»^-ША встречался в 1,9 % случаев, а у обследованных лиц с ХГРС данный генотип встречался в 25,5 % случаев. Анализ показателей функциональной активности фагоцитирующих клеток нейтрофильного звена у больных ХГРС показал, что клетки смывов из верхнечелюстных пазух имели 2 типа ответа на используемые воспалительные индукторы. При 1-м типе ответа реакция на ФМА была ниже, таковой на опсонизированный зимозан. При 2-м типе ответа мы наблюдали снижение реакции на опсонизированный зимозан, по сравнению с ответом клеток на ФМА. По нашему мнению, этот тип ответа свидетельствует об уменьшении количества С3Ь рецепторов и соответственно о дефекте фагоцитоза клеток из очага воспаления. Интересно, что в группе с высоким ответом на индукторы (табл. 3) только у 4-х из 32 больных наблюдался 2 тип ответа. В то же время в группах с низким и средним уровнем реакции на воспалительные индукторы у большинства больных (62 %) отмечено снижение фагоцитарной активности воспалительных клеток, полученных их очага воспаления. По-видимому, снижение ответа на воспалительные стимулы отражает степень угнетения фагоцитарной активности воспалительных клеток.
Анализ результатов, полученных нами при определении функциональной активности фагоцитирующих клеток нейтрофильного звена в периферической крови и в смывах из околоно-
Российская оториноларингология №1 (38) 2009
совых пазух больных ХГРС, свидетельствует о корреляционной зависимости носительства варианта «2/2»^-ША и уровня хемилюминесценции клеток.
Аллели 1Ь-1 Р.а
маркер 2/2 1/2 1/2 1/1
п г.
с. и 1.1 1(10
Рис. 1. Фотография агарозного геля с вариантами полос, визуально наблюдаемых при аллелях 1 и 2 гена К-ША (VNTR), - 1/1 - ген, гомозиготный по варианту К-ША *1, 1/2- гетерозиготный ген, 2/2 - ген, гомозиготный по варианту К-ША *2.
Рис. 2. Медианы значений сывороточной продукции К-1е и К-8 в лейкоцитах периферической крови больных ХГРС и здоровых доноров (пг/мл).
Согласно этой версии сверх продукция ^-ША генетически обуславливает снижение выработки ^-1е° ^-8 и соответственно снижает активность фагоцитирующих клеток в ответ на внедрение патогенна.
Генетически пролонгируемая дисрегуляция продукции ^-1е /^-ША у больных ХГРС приводит к продолжительному воспалительному ответу и соответственно невозможности элиминации внедрившихся чужеродных агентов (бактерий, вирусов, грибов и т. д.) из очага воспаления.
Влияние функционального полиморфизма генов ^-1е и ^-ША на фагоцитарное звено иммунной системы, по-видимому, можно описать в виде следующих закономерностей:
- носительство нормальных вариантов генов определяет адекватную фагоцитарную активность фагоцитирующих клеток;
- у носителей генетического перевеса в сторону ^-1е, фагоцитоз протекает более интенсивно;
- у носителей генетически обусловленного перевеса в сторону выработки ^-ША, фагоцитоз замедлен или снижен, что может являться причиной торможения элиминации патогенна из очага воспаления, а тем самым способствовать хронизации гнойного процесса. Заключение
Механизм развития хронического гнойного риносинусита до сих пор не совсем ясен. Помимо прямого микробного фактора большое значение имеют механизмы, опосредованные состоянием внутренней среды - «факторами хозяина». В литературных источниках существуют разные точки зрения на удельный вес и преобладание каждого из патогенетических факторов в общей картине хронических гнойных риносинуситов. Совершенно очевидно, что цитокины играют важную роль в нормальной и патологической физиологии человека [6].
Таким образом, согласно полученным нами результатам, функциональный полиморфизм генов семейства IL-1 в развитии воспалительной реакции в ряде случаев обуславливают функциональные нарушения, которые приводят к качественным нарушениям фагоцитоза - защитной функции, и что соответственно сказывается на развитии и исходе хронических инфекционных заболеваний, а также иммунопатологических процессов в околоносовых пазухах.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гаращенко Т. И. Бактериальные иммунокорректоры в профилактике и лечении патологии ЛОРорганов в группе часто болеющих детей / Т. И. Гаращенко, М. Р. Богомильский, Т. П. Маркова. Мат. 16 съезда оторинолар. РФ. -СПб.: РИА-АМИ, 2001. - С. 348-354.
2. Иммунология и аллергология для ЛОР-врачей / Д. К. Новиков, Л. Р. Выхристенко, П. Д. Новиков и др. - М.: МИА, 2006. - 498 с.
3. Козлов В. С. Синуситы: Современный взгляд на проблему / В. С. Козлов, В. В. Шиленкова, А. А. Шиленков // Consil. medicum. - 2003. - Т. 5. - № 4. - С. 212-219.
4. Конусова В. Г. Влияние беталейкина на функциональную активность нейтрофилов человека / В. Г. Конусова, А. С. Симбирцев// Мед. иммунолог. - 2000. - Т. 2. - С. 221-222.
5. Пискунов Г. З. Клиническая ринология / Г. З. Пискунов, С. З. Пискунов. - М.: МИА., 2006. - 559 с.
6. Cytokines in nasal polyposis, acute and chronic sinusitis / C. Rudack, et al. // Am. J. Rhinol. - 1998. - Vol. 12(6). -P. 383-388.
7. Differential regulation of cytokine release and leukocyte migration by lipopolysaccharide-stimulated primary human lung alveolar type II epithelial cells and macrophages / A. J. Thorley et al. // J Immunol. - 2007. N. 178(1). - P. 463-73.
8. Ethmoid sinus mycology of chronic rhinosinusitis / R. S. Jiang, K. L. Liang, J. Y. Shiao, et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2008, Jan 9 [Epub ahead of print]
9. Ferguson B. J., Eosinophilic bacterial chronic rhinosinusitis / B. J. Ferguson, R. Seethala, W. A. Wood // Laryngoscope. 2007. - N117(11). - P 2036-40.
10. IL-1 receptor antagonist (IL-1RA) gene polymorphism in Sjogren’s syndrome and rheumatoid arthritis / S. Perrier, C. Coussediere, J. J. Dubost et al. // Clin. Immunol. Immunopathol. - 1998. - Vol. 87. - P 309-313.
11. Influence of interleukin-1 receptor antagonist gene polymorphism on disease. S. S. Witkin et al. // Clin. Infect. Dis. -
2002. - Vol. 15. - P 204-209.
12. Interleukin-1 beta, interleukin-5, interleukin-6, interleukin-8, and tumor necrosis factor-alpha in chronic sinusitis: response to systemic corticosteroids / C. M. Lennard, E. A. Mann, L. L. Sun et al. // Am J. Rhinol. - 2000. -Vol. 14 (6). - P 367-373.
13. Microbicidal protein psoriasin is a multifunctional modulator of neutrophil activation. // Y. Zheng, F. Niyonsaba,
H. Ushio et al. // Immunology. - 2008, Jan 8 - [Epub ahead of print]
14. Neutrophil chemokines in cultured nasal fibroblasts / C. Rudack, W. Hermann, J. Eble et al. // Allerg. - 2002. -N57(12) - P 1159-64.
15. Neutrophil migration induced by IL-8-activated mast cells is mediated by CINC-1 / C. D. Ramos et ai. // Cytokin. -
2003. - Vol. 2, N5, P. 214-23
16. Rudack C. Primary role of growth-related oncogene-alpha and granulocyte chemotactic protein-2 as neutrophil chemoattractants in chronic rhinosinusitis / C. Rudack, F. Sachse, J. Alberty // Clin Exp Allergy - 2006. -N 36 (6). - P. 748-59.
17. Slavin R. G., Sinusitis: viral, bacterial, or fungal and what is the role of Staph? / R. G. Slavin // Allergy Asthma Proc. -2006. - N 27 (6). - P. 447-50.
18. The fungal debate: where do we stand today? / F. A. Ebbens, C. Georgalas, A. B. Rinia еt al // Rhinology /. - 2007. -N 45 (3). - P 178-89.
