CC BY
13Научные статьи
Панкова Вера Борисовна - докт. мед. наук, профессор, зав. отделением клинических исследований и проф-патологии Всероссийского НИИ железнодорожной гигиены. 105275, Москва, Пакгаузное шоссе, д. 1; тел.: 8(499) 153-42-10; 8-916-459-60-92, е-шаП: pankovaVB@gmail.com
Капцов Валерий Александрович - докт. мед. наук, профессор, зав. лабораторией комплексных проблем Всероссийского НИИ железнодорожной гигиены. 105275, Москва, Пакгаузное шоссе, д. 1; тел.: 8(499) 153-36-28, е-таП: kapcovva@rambler.ru
Синёва Елена Ливерьевна - докт. мед. наук, профессор, руководитель отделения разработки клинико-диагностических методов исследования Института общей и профессиональной патологии ФНЦГ им. Ф. Ф. Эрисмана. 141000, г. Мытищи, Московская обл, ул. Семашко, д. 2; тел.: 8-903-784-41-39, е-mail: elena-sinewa@yandex.ru
Федина Ирина Николаевна - докт. мед. наук, вед. н. с. отделения разработки клинико-диагностических методов исследования Института общей и профессиональной патологии ФНЦГ им. Ф. Ф. Эрисмана. 141000, г. Мытищи, Московская обл., ул. Семашко, д. 2; тел.: 8-903-785-79-13, е-mail: infed@yandex.ru
Таварткиладзе Георгий Абелович - докт. мед. наук, профессор, директор научно-практического центра аудиологии и слухопротезирования. 117513, Москва, Ленинский пр., д. 123; тел.: 8-499-4084201, е-mail: Gtavartkiladze@audiolodgy.ru
Мухамедова Гульфия Рафаэловна - канд. мед. наук, вед. н. с. Научно-практического центра аудиологии и слухопротезирования. 117513, Москва, Ленинский пр., д. 123; тел.: 8-499-4084201, е-mail: gmukhamedova@ audiology.ru
УДК 616.216.1-002-036.12:615.37:578.52
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ
В ИММУНОПАТОГЕНЕЗЕ ХРОНИЧЕСКОГО РИНОСИНУСИТА
Д. Ю. Семенюк1, С. А. Артюшкин2, Л. Э. Тимчук3, А. Н. Мироненко4, В. Г. Конусова5, А. С. Симбирцев5
IMMUNO-GENETIKE AND IMMUNOLOGICAL MARKERS
IN THE IMMUNE-PATHOGENESIS OF CHRONIC RHINOSINUSITIS
D. Y. Semeniuk, S. A. Artyushkin, L. I. Timchuk, A. N. Mironenko, V. G. Konusova, A. S. Simbirtsev
1 ГБУЗ «Городская Мариинская больница», Санкт-Петербург (Главный врач - О. В. Емельянов)
2 ГБОУ ВПО «Северо-Западный ГМУ им. И. И. Мечникова», Санкт-Петербург (Ректор - проф.О. Г. Хурцилава)
3 ФБГУ «СПб НИИ уха горла и речи Минздрава России» (Директор - засл. врач РФ, член-корр. РАМН, проф. Ю. К. Янов)
4 ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова» МО РФ (Начальник - проф. А. Н. Бельских)
5 ФБГУ «СПб НИИ особо чистых биопрепаратов» (Директор - проф. А. С. Симбирцев)
Полиморфизм генов цитокинов семейства IL-1 оказывает влияние на фагоцитарную активность нейтрофильных гранулоцитов. Метод люминолзависимой хемилюминесценции, в том числе индуцированной форболмиристат ацетатом и зимозаном, позволяет оценить функциональную активность ней-трофилов, праймированных провоспалительными цитокинами при воспалении слизистой оболочки околоносовых пазух.
Ключевые слова: цитокины, риносинусит, полиморфизм, гены, фагоцитоз.
Библиография: 8 источников.
Cytokine gene polymorphism of IL-1 family influence on the phagocytic activity of neutrophils. Luminol chemiluminescence method, including induced forbolmiristat acetate and zymosan to evaluate the functional activity of neutrophils, primed by pro-inflammatory cytokines in inflammation of the mucous membranes of the paranasal sinuses.
Key words: cytokines, rhinosinusitis, functional gene polymorphism, phagocytosis.
Bibliography: 8 sources.
Российская оториноларингология № 4 (65) 2013 :
Гнойные формы хронического риносинусита в структуре ЛОР-заболеваний занимают одно из ведущих мест. Отмечается ежегодный рост заболеваемости, несмотря на совершенствование методов диагностики и способов лечения.. Рост заболеваемости может быть связан как с неоправданно длительным использованием лекарственных средств, вызывающих функциональные нарушения защитных свойств слизистой оболочки носа и околоносовых пазух, так и с увеличением в популяции числа лиц с нарушениями в иммунной системе [3, 4, 7, 8].
Нарушение местного иммунитета слизистой оболочки носа и околоносовых пазух приводит к неадекватному иммунному воспалению, которое всегда сопровождает локальный иммунный ответ. Главную роль в развитии иммунного воспаления играют провоспалительные цитокины, которые, в свою очередь, регулируют процессы активации, дифференцировки и пролиферации клеток, участвующих в местном и системном иммунном ответе. Дисбаланс в продукции провоспа-лительных и противовоспалительных цитокинов играет важную роль в иммунопатогенезе рецидивирующих хронических заболеваний околоносовых пазух инфекционно-воспалительной этиологии [1, 2, 4-6].
Ведущим в инициации иммунного воспаления является провоспалительный цито-кин - интерлейкин 1р [5, 6]. Установлено, что у больных гнойным риносинуситом с рецидивирующим и хроническим течением отмечается недостаточность продукции Ш-1Р [6]. Кроме этого, у больных гнойным риносинуситом отмечаются снижение функциональной активности клеток макрофагально-фагоцитарного звена, снижение содержания натуральных киллеров и угнетение Т-клеточного звена, т. е. данное заболевание характеризуется вторичными нарушениями параметров иммунитета, что способствует затяжному течению заболевания и низкой эффективности проводимой терапии [1, 2, 5].
Ранее установлено, что у больных гнойным риносинуситом имеются генетические предпосылки для развития заболеваний околоносовых пазух. Интенсивное развитие иммуногенети-ки позволило установить ассоциативную связь хронического гнойного риносинусита с носи-тельством варианта гена Ш-1ЯА*2 (УТСШ), Ш-1р (- 511) и И-1р (+3963) [1, 2, 6].
Цель исследования. Повышение эффективности диагностики хронического риносинусита методом оценки влияния полиморфизма генов цитокинов семейства Ш-1 на функциональную активность клеток нейтрофильного звена.
Пациенты и методы. Отбор больных для обследования проводился на базе СПб НИИ ЛОР в период 2007-2010 гг.
Материалом для молекулярно-генетическо-го анализа полиморфизма генов IL-1ß и IL-1RA служили образцы высокомолекулярной ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической крови с использованием раствора для выделения ДНК. Варианты аллелей гена IL-1ß, несущие точечные замены нуклеотидов C/Т в районе 5-го экзона в позиции +3953, определялись методом ПДРФ-анализа (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома.
ПЦР-реакцию проводили в 10 мкл реакционной смеси с использованием TE-Taq-ДНК-полимеразы и соответствующего готового буфера, праймеров 5' - GTT GTC ATC AGA CTT TGA CC - 3', 5" - TTC AGT TCA TAT GGA CCA GA - 3', синтезированных в НПО. Режим амплификации составлял 35 циклов (940 °C 2 мин, 550 °C 1 мин, 720 °C 1 мин) с конечной инкубацией продукта реакции в течение 10 мин при 720С. Длина получаемого фрагмента составляла 249 п. о., полученный ам-плификат инкубировали с ферментом рестрикции TaqI (0,25 ед./мкл, 3 ч при 650 °С). Продукты рестрикции разделяли электрофоретически в 2-3 %-ном агарозном геле, окрашивали бромистым этидием и визуализировали в УФ-свете. В качестве маркера размера фрагментов ДНК использовали набор маркеров молекулярного веса с шагом 50 п. о. При наличии в геноме нормального аллеля детектировались два фрагмента (135 и 114 п. о.), при полиморфной мутации продукт амплификации оставался целым, у гетерозиготных индивидов определялись три фрагмента ДНК (114, 135, 249 п. о.). Генотипирование IL-1RA проводили в тех же условиях методом ПЦР: амплифицировался участок ДНК, содержащий тандемные повторы по 86 п. о. в районе интрона 2, аллельный тип определяли по длине получаемого продукта амплификации при электрофоретическом разделении.
Нормальный вариант гена IL-1RA содержит четыре таких повтора (размер получаемого фрагмента 410 п. о.), наиболее значимым из полиморфных вариантов является аллель IL-1RA*2, несущий два повтора (240 п. о.) (рис.), остальные варианты (325, 500, 595 п. о.) встречаются крайне редко - суммарно менее, чем у 1% популяции - и в данной работе не рассматриваются. Использовались праймеры 5' - CTC AGC AAC ACT CCT AT - 3', 5' - TCC TGG TCT GCA GGT AA -3' , режим амплификации составлял 35 циклов (940 °C 1 мин, 600 °C 1 мин, 720 °C 1 мин) с конечной инкубацией продукта реакции в течение 10 мин при 720 °С. Для краткого обозначения аллелей генов IL-1ß и IL-1RA были приняты следующие сокращения: нормальный, не несущий выявляемой мутации, аллель обозначался цифрой 1, полиморфный - 2, гомозиготные варианты - 1/1 и 2/2, гетерозиготный - 1/2.
Аллели IL-1 Ra
маркер 2/2 1/2 1/2 1/1
ZOO — — ZU
10(1
Рис. Фотография агарозного геля с вариантами полос, визуально наблюдаемых при аллелях 1 и 2 гена IL-1RA (VNTR): 1/1 - ген, гомозиготный по варианту IL-1RA *1, 1/2- гетерозиготный ген, 2/2 - ген, гомозиготный по варианту IL-1RA *2.
Экспрессию генов IL-1ß и IL-1RA на уровне мРНК тестировали у 27 случайно выбранных больных до начала лечения методом ОТ-ПЦР с конечной электрофоретической детекцией количества полученного амплификата. Образцы тотальной РНК выделяли из суспензии клеток (концентрация 3-5*106), полученных из промывной жидкости верхнечелюстных пазух, с использованием раствора TRI-Reagent. Синтезировалась кДНК в реакции обратной транскрипции при инкубации 1 мкг тотальной РНК в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 100 Е обратной транскриптазы M-MuLV, по 1 мМ каждого dNTP, готовый реакционный буфер, 10 Е ингибитора РНК-аз и 0,1 мкг гексануклеотидных праймеров. Инкубация продолжалась 1 ч: 10 мин. при 940 °С, 45 мин - 420 °С, 5 мин - 950 °С. ПЦР с кДНК проводили в 20 мкл реакционной смеси, в присутствии специфических праймеров для IL-1ß, IL-1RA [GeneBank], синтезированных в НПО. Режим амплификации составлял 30 циклов (45 с 940 °С, 45 с 610 С, 1 мин 720 °С) с финальной инкубацией 10 мин при 720 °С. Пластины с гелем помещали на стекло трансиллюминатора и фотографировали видеокамерой, результаты интенсивности флюоресценции полос обрабатывали с помощью пакета программ Gel Imager и Gel Analysis. В качестве позитивного контроля для каждой пробы определяли экспрессию фермента GAPDH, постоянно экспрес-сирующегося в клетке. Индекс экспрессии генов цитокинов на уровне мРНК рассчитывали для каждой пробы как соотношение интенсивности флуоресценции в геле полосы ци-токина и GAPDH (рис.).
Исследование функциональной активности нейтрофилов, основных клеток воспалительной реакции проводили методом люми-нолзависимой хемилюминесценции (ЛЗХЛ). Люминолзависимый ответ клеток, опосредующих развитие воспалительной реакции, оценивали по трем параметрам: спонтанный уровень реакции, индуцированный форбол-миристат-ацетатом (ФМА) и индуцированный опсонизированным зимозаном (ОЗ). Получаемая в результате информация позволяет одновременно определять окис-
Научные статьи
лительно-восстановительный потенциал клеток (ответ на ФМА) и исследовать интенсивность фагоцитарной реакции, вызванной поглощением ОЗ. Для анализа использовали венозную кровь, стабилизированную гепарином (20 МЕ/мл).
Алгоритм проведения реакции
В лунки 96-луночной белой, непрозрачной платы (Costar) капали по 20 мкл исследуемого материала (кровь), добавляли 20 мкл растворов индукторов ФМА и ОЗ и 40 мкл раствора люми-нола в конечной концентрации 10-4 М, общий объем реактогенной среды доводили раствором Хенкса до 200 мкл. Для определения спонтанного уровня реакции к исследуемым клеткам добавляли вместо индукторов 20 мкл раствора Хенкса. Все исследования проводили в трех параллелях. Регистрацию реакции проводили в течение 30 мин при 37 °С с помощью сканирующего люми-нометра.
Результат реакции выражали светосуммой, т. е. количеством импульсов, накопленных за время эксперимента.
Используемые реагенты:
- люминол - вещество акцептирующее на себе весь пул свободнорадикальных форм кислорода, а также перекись водорода и миелопироксидазу, продуцируемые нейтрофилами и макрофагами при их активации;
- форбол-миристат ацетат (ФМА) - неспецифический активатор функциональной активности клеток воспаления, вызывающий ряд последовательных реакций в клетке, приводя к мощному оксидативному взрыву и выбросу сво-боднорадикальных форм кислорода;
- зимозан - фрагмент клеточной стенки пекарских дрожжей, активирующих нейтрофилы посредством взаимодействия опсонизирован-ного компонента комплемента зимозана с С3в-рецепторами на поверхности клетки.
Результаты. Формируя группы, мы оценивали варианты аллелей гена IL-ip и IL-1RA, несущие точечные замены нуклеотидов C/Т в районе 5-го экзона в позиции +3953, но акцент был сделан на уровень ответа реакции хемилюминесценции (ХМ).
Было выделено три группы больных в зависимости от интенсивности ЛЗХЛ (табл.) с низким, средним и высоким уровнем хемилюми-несцентного ответа. Уровень ЛЗХЛ смывов из пазух среди больных с низким уровнем ответа на индукторы не превышал 30-40 имп./с. Для этой группы больных соответствовал гомозиготный вариант гена «2/2»IL-1RA, встречающийся в гаплотипах «1/1»IL-ip+«2/2»IL-1RA и «1/2»IL-ip+«2/2»IL-1RA. Функциональная активность клеток больных, составивших группу со средним уровнем ответа на индукторы, на порядок превышала таковую среди предыдущей группы больных.
Российская оториноларингология № 4 (65) 2013
^^ =
Таблица
Особенности спонтанной и индуцированной ЛЗХЛ клеток смывов из гайморовой пазухи (имп/сек)
№ группы Уровни интенсивности ЛЗХЛ Количество больных Уровень спонтанной ЛЗХЛ Уровень ЛЗХЛ в ответ на ФМА Уровень ЛЗХЛ в ответ на опс. Зимозан
1 Низкий(«1/ЪЛ-1ß+«2/2»IL-1RA и «1/2»IL-1ß + «2/2»IL-1RA) 23 11±2 35±5 28±4
2 Средний («1/2»IL-1ß+«1/2»IL-1RA и «1/2»IL-1ß + «2/2»IL-1RA) 43 67±22 290±33 253±38
3 Высокий («1/1»IL-1ß+«1/1»IL-1RA, «1/2»IL-1ß + «1/1»IL-1RA и «2/2»IL-1ß + «1/1»IL-1RA) 32 141±3 1012±147 1180±144
Высокий уровень ЛЗХЛ был отмечен у больных носителей гаплотипов «1/1»Ш-1р+«1/1»Ш-1ЯА, «1/2»Ш-1р+«1/1»Ш-1ИА и «2/2»т-1р+«1/1»т-1ЯА. Уровень спонтанной ЛЗХЛ у пациентов этой группы превышал в 12,8 раза уровень спонтанной ЛЗХЛ во 2-й группе, уровень ЛЗХЛ в ответ на ФМА - в 28,9 раз, а уровень ЛЗХЛ в ответ на зи-мозан - в 42,1 раза. Наличие гаплотипов «1/1»Ш-lp+«1/1»IL-1RA, «1/2»Ш-1р+«1/1»Ш-1ИА и «2/2»Ш-1р+«1/1»Ш-1ЯА ассоциировалось с высокой фагоцитарной активностью нейтрофильных клеток, что определяло остроту воспаления в околоносовых пазухах. Больные, составившие 3-ю группу, в анамнезе имели наименьшее число рецидивов в год. Периоды обострений заболевания сопровождались яркой клинической картиной, с повышением температуры тела до 38,5 °С.
Более детальный анализ результатов исследования показал, что можно выделить два типа ответов на используемые воспалительные индукторы. При 1-м типе ответа реакция нейтрофилов
на ФМА была ниже, чем на опсонизированный зимозан. При 2-м типе ответа мы наблюдали снижение реакции на опсонизированный зимозан по сравнению с ответом клеток на ФМА. По нашему мнению, этот тип ответа свидетельствует об уменьшении количества С3Ь-рецепторов и соответственно о дефекте фагоцитоза клеток в очаге воспаления.
Интересно, в то же время в группах с низким и средним уровнями реакции на воспалительные индукторы у большинства больных отмечено снижение ответа клеток на опсонизированный зимозан по сравнению с ФМА, что, по-видимому, отражает степень угнетения фагоцитарной активности нейтрофильных клеток.
Взаимосвязь между аллелями генов Ш-1р и Ш-1RА, отвечающих за высокую и низкую продукции про- и противовоспалительных цитокинов, и уровнем индуцированной хемилюминесценции нейтрофилов отчасти объясняет особенности им-мунопатогеза хронического риносинусита.
Выводы
На основании проведенных исследований показана возможность использования достаточно простого и информативного теста хемилюминесценции фагоцитов как маркера активности воспалительного ответа при хроническом риносинусите.
ЛИТЕРАТУРА
1. Кетлинский С. А., Симбирцев А. С. Цитокины. - СПб.: Фолиант, 2008. - 552 с.
2. Коротяев А. И., Бабичев С. А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология: учеб. - СПб.: Спец. Лит., 1998. - 592 с.
3. Пискунов Г. З., Пискунов С. З. Клиническая ринология. - М.: Спец. лит., 2006. - 560 с.
4. Риногенный синусит: метод. рекомендации / Н. А. Арефьева [и др.]. - Уфа, 1997. - 19 с.
5. Симбирцев А. С. Интерлейкин-1. Физиология. Патология. Клиника. - СПб.: Фолиант, 2011. - 480 с.
6. Тимчук Л. Э. Роль функционального полиморфизма генов IL1ß и IL1Ra в иммунопатогенезе и лечении хронического гнойного риносинусита: автореф. дис. ... канд. мед. наук. - СПб., 2007. - 22 с.
7. Янов Ю. К. Современные возможности оптимизации медикаментозной терапии острых синуситов // Рос. оторинолар. - 2004. - № 4. - С. 10-15.
8. Wald E. R. Microbiology of acute and chronic sinusitis in children and adults // Am. J. Med. Sci. - 1998. - Vol. 316. -N 1. - P. 13-20.
Научные статьи
Семенюк Дарья Юрьевна - врач-оториноларинголог Мариинской больницы. 191104, Санкт-Петербург, Литейный пр., д. 56; тел.: 8-812-275-71-95, е-mail: dasan@mail.ru
Артюшкин Сергей Анатольевич - докт. мед. наук, профессор, зав. каф. оториноларингологии СевероЗападного ГМУ им. И. И. Мечникова. 191015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д. 41; тел.: (812) 303-50-00, e-mail: Sergei.Artyushkin@spbmapo.ru
Тимчук Лола Эркиновна - канд. мед. наук, н. с. Санкт-Петербургского научно-исследовательского института уха, горла, носа и речи. 190013, Санкт-Петербург, ул. Бронницкая, д. 9; тел.: (812)316-15-23, е-mail: lola-timchuk@ mail.ru
Мироненко Александр Николаевич - докт. мед. наук, зам. начальника по клинической работе ВМА. 194044. Санкт-Петербург, ул. Лебедева, д. 6; е-mail: mironenko@hotbox.ru
Конусова Валентина Георгиевна - канд. мед. наук, ст. н. с. НИИ особо чистых биопрепаратов. 197110, Санкт-Петербург, ул. Пудожская, д. 7; тел.: (812)336-55-91, е-mail: onir@hpb-spb.com
Симбирцев Андрей Семёнович - докт. мед. наук, профессор, директор НИИ особо чистых биопрепаратов. 197110, Санкт-Петербург, ул. Пудожская, д. 7, тел.: (812)336-55-91, е-mail: onir@hpb-spb.com
УДК 616.327.2:611-018.73:575.172.1
ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА БЕТА-ДЕФЕНСИНА-1 ЧЕЛОВЕКА В СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКЕ НОСОГЛОТКИ
Е. В. Тырнова, Г. М. Алешина, В. Н. Кокряков
INVESTIGATION OF HUMAN BETA-DEFENSIN-1 GENE EXPRESSION ON THE MUCOSAL SURFACE OF THE NASOPHARYNX
E. V. Tyrnova, G. M. Aleshina, V. N. Kokryakov
ФГБУ «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт уха, горла, носа и речи»
Минздрава России
(Директор - засл. врач РФ, член-корр. РАМН, проф. Ю. К. Янов)
ФГБУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» СЗО РАМН,
Санкт-Петербург
(Директор - засл. деят. науки РФ, акад. РАМН, проф. Г. А. Софронов)
Целью работы явилась оценка экспрессии гена антимикробного пептида бета-дефенсина-1 человека (hBD-1) в эпителии слизистой оболочки носоглотки. Исследован операционный материал от больных гипертрофией аденоидов и миндалин (n = 4), хроническим декомпенсированным тонзиллитом (n = 4), гипертрофией аденоидов (n = 4), заболеваниями носа и околоносовых пазух (n = 14) (полипы носа и верхнечелюстных пазух, гипертрофический ринит, нижние носовые раковины в качестве контроля). Оценку экспрессии матричной РНК (мРНК) hBD-1, а также мРНК бета-2-микроглобулина проводили методом полимеразной цепной реакции в реальном времени. мРНК hBD-1 была экспрес-сирована во всех отделах носоглотки на уровнях, которые достоверно не различались (р >0,05; тест Манна-Уитни). Экспрессия hBD-1 характеризует базальный уровень защитных реакций врожденного иммунитета слизистой оболочки носоглотки. hBD-1 рассматривается в качестве защитной молекулы в отсутствие воспаления.
Ключевые слова: аденоиды, небные миндалины, нижние носовые раковины, полипы носа и верхнечелюстных пазух, бета-дефенсин-1 человека, полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.
Библиография: 28 источников.
The aim of the present study was to evaluate the human beta-defensin-1 (hBD-1) gene expression in the surface epithelium of the nasopharyngeal mucosa. Surgical samples from patients with hypertrophic adenoids and tonsils (n = 4), chronic decompensated tonsillitis (n = 4), hypertrophic adenoids (n = 4), and sinonasal disease (n = 14) (nasal polyps, sinus maxillaries polyps, inferior turbinate mucosa of hypertrophic rhinitis, inferior turbinate mucosa as control) were investigated. Total RNA was extracted and analysed by real-time reverse-transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) for hBD-1, as well as beta-2-microglobulin messenger ribonucleic acid (mRNA). The data obtained were analysed for significant differences using the Mann-Whitney-U test. Beta-defensin-1 mRNA was detected in all mucosal tissues samples, at levels that did not differ signifi-
4111^
