CC BY
44
Химия растительного сырья. 2011. №1. С. 137-140.
УДК 615.322:615.453.6
ВЛИЯНИЕ ОБРАБОТКИ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ ПЛАЗМОЙ НА ХИМИЧЕСКИЙ СОСТАВ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ*
© М.В. Богма1 , H.A. Османова2, A.A. Ерузин3, Т.С. Потехина4, Л.М. Манойлова1
1 Медицинская академия последипломного образования, Заневский пр., 1/82, Санкт-Петербург, 191015 (Россия) e-mail: [email protected] 2Университет Гамбурга, Edmund-Siemers-Allee 1, Hamburg, 20146 (Germany) e-mail: [email protected]
3Санкт-Петребургский государственный технологический институт (техническийуниверситет), Московский пр., 26, Санкт-Петербург, 190013 (Россия) e-mail: [email protected]
4Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия,
ул. проф. Попова, 14, Санкт-Петербург, 197022 (Россия) e-mail: [email protected]
Изучено влияние низкотемпературной плазмы на качественный состав и количественное содержание биологически активных веществ в трех видах лекарственного растительного сырья (ЛРС) (цветках бессмертника Helichrysum arenarium (L.) Moench, листьях мяты Mentha piperita L. и корнях одуванчика Taraxacum officinale F. H. Wigg). Установлено, что воздействие низкотемпературной плазмой (НП) на измельченное ЛРС не вызывает изменений его химического состава и не приводит к снижению содержания в нем действующих веществ. Установлено, что НП обладает выраженным фунгицидным и бактерицидным действием, причем плесневые грибы более чувствительны к воздействию плазмы, чем бактерии.
Ключевые слова: низкотемпературная плазма, неравновесная плазма, Helichrysum arenarium (L.) Moench, Mentha piperita L., Taraxacum officinale Wigg., химический состав, деконтаминация.
Введение
Лекарственные средства из растительного сырья продолжают оставаться самой популярной формой на -родной медицины. По данным Всемирной организации здравоохранения, на сегодняшний день более чем в 100 странах имеется правовое регулирование использования препаратов из лекарственного растительного сырья. Препараты растительного происхождения признаются безопасными и эффективными благодаря тому, что сложный комплекс природных биологически активных соединений оказывает выраженное терапевтическое действие с минимальным количеством побочных эффектов [1].
Чаще всего растительное сырье - это порошки различной степени дисперсности. Тонко измельченное сырье может использоваться для получения таблетированных лекарственных форм, которые являются наиболее эффективными, так как содержат весь комплекс фармакологически активных соединений в неизмененном виде. Применение такой лекарственной формы обеспечивает непосредственный контакт активных веществ с поверхностью желудочно-кишечного тракта и, как следствие, лучшее усваивание организмом и пролонгированное лечебное действие.
Цель настоящего исследования - изучение возможности применения НП для микробиологической деконтаминации измельченного ЛРС, а также выявление влияния НП на химический состав и количественное содержание действующих веществ в ЛРС.
* Данная статья имеет электронный дополнительный материал (приложение), который доступен читателям журнала по адресу http://www.chem.asu.ru/chemwood/volume15/2011_01/1101-137app.pdf.
Автор, с которым следует вести переписку.
Материалы и методы
Растительное сырье было приобретено через аптечную сеть: цветки бессмертника песчаного Helichrysum arenarium (L.) Moench (ООО «Медицинская компания "Народная медицина”», серия 381107), листья мяты перечной Mentha piperita L. (ООО «Апекс», серия 010108) и корни одуванчика лекарственного Taraxacum officinale F.H. Wigg. (ООО «Алтай-Фарм», серия 0407).
Обработка низкотемпературной плазмой. Для обработки измельченного растительного сырья использовали неравновесную плазму в среде кислорода, азота, аргона и смеси азот-кислород на ионно-плазменной камерной вакуумной установке ННВ-6.6-И1 (Булат, Россия). Время воздействия - 5 сек., частота разряда -1,76 МГц; рабочее давление газа плазмы - 0,1 Па.
ИК-спектроскопия. Анализ проводился на ИК-Фурье спектрометре ФСМ 1202 (ООО «Ифраспек», Россия). До и после обработки НП снимались ИК-спектры изучаемого сырья в дисках KBr (1 : 250), в области 4000-400 см-1.
Высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ). ВЭТСХ проводили на пластинах Si 60 F254s HPTLC LiChrospher (Merck, Германия). В качестве подвижной фазы были использованы системы растворителей: этилацетат - муравьиная кислота - вода в соотношении 88 : 6 : 6 (флавоноиды) и этанол - вода 55 : 45 (фруктоза и олигофруктаны) [2]. Пластины осматривали после проявления реактивами: 5% раствор FeCl3 в этаноле (флавоноиды) и 25% H2SO4 в этаноле (фруктоза). Хроматограммы, обработанные H2SO4, нагревали на устройстве для сушки пластин TLC Plate Heater III (5 мин, 110 °С) (Camag, Швейцария). Регистрацию хроматограмм проводили с применением системы Desaga-system (Desaga GmbH, Германия). Документирование и обработку полученных изображений выполняли на приборе Cab UVIS UV-unit с фотокамерой HV-C20 (Hitachi, Ltd., Япония) в программе ProViDoc VD 40 3.01.510 (Desaga GmbH, Германия). В качестве веществ-свидетелей использовали 0,01% спиртовые растворы рутина и кверцетина для H. arenarium, лютеолина - для M. piperita, а также 0,05% водный раствор фруктозы - для T. officinale.
ВЭЖХ. Анализ осуществляли метанольными извлечениями из перечисленных видов измельченного сырья. Извлечения были получены методом мацерации в соотношении сырья и экстрагента 1 : 1. Для ускорения процесса экстракции использовали ультразвуковую ванну Bransonic 52 (Bransonic, Швейцария). Анализ полученных экстрактов проводился на хроматографе Мерк Хитачи (Merck Hitachi LaChrom) с программным обеспечением Version 4.1 P/N: 810-8652-01 (интерфейс D-7000, автоматический пробоотборник L-7200, насос L-7100); колонка - LiChroCART® 125-4 LiChrospher® 100 RP-18e (размер частиц 5 мкм, Merck, Германия). В качестве подвижной фазы применяли градиентную систему растворителей: А: ацетонитрил - вода (5 : 95+0,1% НСООН), Б: ацетонитрил - вода (95 : 5+0,1% НСООН):
Время (мин) Растворитель А, % Растворитель Б, %
00 100 0
15.0 0 100
20.0 0 100
21,0 100 0
33,0 100 0
Детектор диодно-матричный L-7455 (Hitachi, Ltd., Япония) в диапазоне длин волн от 220 до 500 нм, измерения производились при длине волн 254 и 366 нм. Объем анализируемых проб - 10 мкл.
Количественный анализ. Количественное определение суммарного содержания флавоноидов в пересчете на рутин в цветках H. arenarium и листьях M. piperita проводили по модифицированной методике с применением дифференциальной спектрофотометрии. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья с размером частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,25 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 250 мл, прибавляют 100 мл 95% этанола и 0,01% твин-80, присоединяют холодильник и нагревают на капящей водяной бане в течение 45 мин. Извлечение охлаждают и фильтруют в мерную колбу вместимостью 100 мл. Объем фильтрата доводят 95% этанолом до метки и перемешивают (раствор А). В мерную колбу вместимостью 25 мл переносят 2 мл раствора А, доводят 95% этанолом до метки и перемешивают (раствор Б). В мерную колбу вместимостью 25 мл переносят 10 мл раствора Б, прибавляют 1 мл 5% раствора AlCl3 в 95% этаноле и 4 капли разбавленной хлороводородной кислоты, доводят объем раствора 95% этанолом до метки и перемешивают (раствор В).
Оптическую плотность раствора В определяют через 20 мин при 410 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Для приготовления раствора сравнения в мерную колбу вместимостью 25 мл переносят 10 мл раствора Б,
прибавляют 4 капли разбавленной хлороводородной кислоты, доводят объем раствора 95% этанолом до метки и перемешивают (раствор В). Параллельно определяют оптическую плотность раствора ГСО рутина, приготовленного аналогично раствору В.
Суммарное содержание флавоноидов в одной таблетке (X, г) рассчитывают по формуле:
_ D ■ т0 -100 • 25 • 25 • m1
X —---------------------,
D0 • m ■ 2-10 • 25-100
где D - оптическая плотность испытуемого раствора; D0 - оптическая плотность раствора ГСО рутина; m -навеска сырья, г; m0 - масса ГСО рутина, г; m1 - средняя масса одной таблетки, г.
Суммарное содержание фруктанов в пересчете на фруктозу в корнях одуванчика определяли спектрофотометрическим (резорциновым) методом [5].
Микробиологические методы. Количество жизнеспособных микроорганизмов (КОЕ) определяли микробиологическим методом, для этого делали смывы физиологическим раствором 1 : 10 в течение 30 мин при перемешивании и после разбавления высевали на плотные питательные среды №1 и 2 двухслойным агаровым методом [4]. Посевы инкубировали при 37 и 24 °С для бактерий и грибов соответственно. Исследовали образцы измельченного сырья, содержащие естественную микробиоту. Образцы, не подвергавшиеся обработке, были контрольными.
Обсуждениерезультатов
Первым этапом исследования было изучение влияния НП на качественный состав ЛРС. ИК-спектр измельченного ЛРС после обработки низкотемпературной плазмой имел полное соответствие со спектром исходного сырья по положению полос поглощения и их относительной интенсивности (см. приложение).
На следующем этапе оценивали влияние низкотемпературной плазмы на качественный состав сырья методом ТСХ. В извлечениях из H. arenarium (обработанном НП и исходном) были обнаружены характерные пятна, соответствующие по хроматографической подвижности рутину и кверцетину. В извлечениях из M. piperita подтверждено присутствие лютеолина, а в водных извлечениях из T. officinale - фруктозы и набора олигофруктанов. При анализе хроматограмм было установлено, что извлечения из сырья, обработанного НП, и интактного сырья идентичны (см. приложение).
Сравнительный анализ результатов хроматографического анализа (ВЭЖХ) не показал выраженных изменений в качественном составе образцах, обработанных НП (рис.).
Хроматограмма (ВЭЖХ) извлечения из H. arenarium. Ряд 1 - исходное сырье; ряд 2 - сырье, после обработки НП
Для исследования влияния НП на содержание действующих веществ в растительном сырье проводили количественное определение суммарного содержания флавоноидов в пересчете на рутин для H. arenarium и M. piperita и фруктанов в пересчете на фруктозу для T. officinale. В результате проведенных экспериментов установлено, что обработка НП измельченного ЛРС не приводит к снижению содержания в нем действующих веществ (табл. 1).
Микробиологическое исследование показало, что микробиота изученного ЛРС представлена грибами родов Aspergillus, Mucor и Penicillium, а бактерии - в основном спорообразующими палочками (Bacillus sp.). После обработки НП ЛРС происходит значительное снижение числа плесневых грибов (табл. 2). В образцах, обработанных кислородной или азотной плазмой, число грибов снижается в 20 раз по сравнению с контролем.
Таблица 1. Количественные показатели ЛРС до и после обработки НП
Среда H. arenarium, флавоноиды, % M. piperita, флавоноиды, % T. officinale, фруктаны, %
Контроль 9,26±G,29 1,83±G,G4 42,GG±1,5G
Кислород 9,87±G,14 1,78±G,G7 43,G6±1,31
Азот 9,52±G,14 1,81±G,G3 4G,G4±1,G4
Аргон 9,67±G,18 1,69±G,G7 41,48±1,56
Смесь азота и кислорода 9,59±G,45 1,89±G,G4 45,16±1,63
Таблица 2. Содержание жизнеспособных клеток в H. arenarium до и после обработки НП
Среда Содержание жизнеспособных клеток (КОЕ)/г
бактерий грибов
Контроль 2,G4G3 1,5-Ю3
Кислород 2,G4G2 7G
Азот 6,G1G2 6G
Аргон 4,G1G2 2,5-Ю2
Смесь азота и кислорода 3,G1G2 1,41G2
Выводы
В результате проведенных экспериментов доказано, что воздействие НП на измельченное ЛРС не вызывает изменений его химического состава. Идентичность качественного состава была доказана методами ИК-спектроскопии, ТСХ и ВЭЖХ. Показано, что обработка НП ЛСР не приводит к снижению содержания в нем действующих веществ. Установлено, что обработка НП обладает выраженным фунгицидным и бактерицидным действием, причем плесневые грибы более чувствительны к воздействию плазмы, чем бактерии. Фунгицидное действие плазмы зависит от состава газовой фазы.
Электронный дополнительный материал
В качестве приложения к статье в электронном дополнительном материале (http://www.chem.asu.ru/chemwood/ volume15/2011_01/1101-137app.pdf) приведены ИК-спектр, тонкослойные хроматограммы некоторых образцов, обсуждаемые в данной статье.
Список литературы
1. Общее руководство по методологиям научных исследований и оценке народной медицины / ВОЗ. 2000. [Электронный ресурс]. URL: http://www.who.int/topics/traditional_medicine/definitions/ru/index.html
2. Wagner H., Bladt S. Plant Drug Analysis. A Thin Layer Chromatography Atlas // 2nd ed. 1996. 384 p.
3. Государственная фармакопея СССР. 11-е изд. М., 1989. Вып. 1. 334 с.
4. Государственная фармакопея СССР. 11-е изд. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. Изменение №3. М., 1989. Вып. 2. 399 с.
5. Беляков К.В., Попов Д.М. Определение инулина в корневищах и корнях девясила высокого (Inula helenium L.) // Фармация. 1998. №1. С. 34-36.
Поступило в редакцию 12 ноября 2010 г.
После переработки 3 февраля 20II г.
