CC BY
170
УДК 543.854.74+547.917
МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ ПОЛИФРУКТАНОВ В КОРНЯХ ОДУВАНЧИКА ЛЕКАРСТВЕННОГО (TARAXACUM OFFICINALE WIGG.)
© Л.М. Танхаева, Д.Н. Оленников
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул. Сахьяновой, 6, Улан-Удэ, 670047 (Россия) E-mail: oldaniil@rambler.ru
исследован процесс экстракции полисахаридов корней одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg., сем. Asteraceae) и найдены оптимальные параметры извлечения полифруктанов. Разработана методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов в пересчете на фруктозу с относительной ошибкой не более 2%. Установлено, что содержание полифруктанов в корнях T. officinale коммерческих образцов сырья составляет 15-33%.
Ключевые слова: корни одуванчика, Taraxacum officinale Wigg., фруктаны, спектрофотометрия, ВЭТСХ, резорциновый метод.
Сокращения: ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография, СП - степень полимеризации, Frc -фруктоза, Glc - глюкоза, Kes - 1-кестоза, M - молекулярная масса, Nys - нистоза, Sac - сахароза.
Введение
Одуванчик лекарственный (Taraxacum officinale Wigg., сем. Asteraceae) - растение, включенное в большинство мировых фармакопей. Химический состав данного растительного вида разнообразен; в T. officinale обнаружены углеводы, флавоноиды, фенольные кислоты, терпеновые соединения и др., комплекс которых обусловливает его биологическую активность [1].
Фруктаны корней T. officinale являются предметом многочисленных научных исследований; к настоящему времени известно о присутствии низко- и высокомолекулярных производных 1-кєсто-п-озьі (n = 3-10) и инуло-п-озы (n = 2-5) [2-6]. Фармакологические эксперименты показали, что суммарные полисахаридные фракции корней T. officinale обладают сахароснижающим [7], диуретическим [8], бифидогенным [9] и противоопухолевым действием [10].
Качество сырья «Корни одуванчика» в России регламентируется фармакопеей, которая не предлагает методик количественной оценки содержания полисахаридов (полифруктанов) [11], поэтому целью настоящей работы является определение оптимальных параметров экстракции полифруктанов из корней T. officinale, разработка методики количественного определения суммарного содержания полифруктанов и ее метрологический анализ.
Экспериментальные условия
Корни T. officinale приобретены через аптечную сеть (№1 - ООО «Здоровье», серия 010504; №2 - ООО «Старт-фито», серия 391003; №3 - ООО «ЛекС+», серия 010804). В работе использованы стандартные образцы веществ: фруктоза, глюкоза, сахароза, инулин (Acros Organics), 1-кестоза, нистоза (Carbosynth Lim.); остальные реактивы имели степень чистоты ч.д.а.
ВЭТСХ проводили на пластинах Сорбфил ПТСХ-АФ-В (Сорбполимер); спектроскопические исследования - на спектрофотометре CE 2011 (Cecil) в кварцевых кюветах 10 мм. Оптическое вращение ([a]D) определяли на поляриметре СМ-3 (Загорский оптико-механический завод), в кювете длиной 1 дм при 20 °С. иК-спектры регистрировали на иК-Фурье спектрометре Spectrum 100 (Perkin-Elmer) в пленке на пластинах КРС-5 в интервале 4000-450 см-1. Гель-хроматографию проводили на Сефадексе G-75 (Pharmacia) [12].
* Автор, с которым следует вести переписку.
Условия гидролиза, экстракции, ВЭТСХ и выделения водорастворимых полисахаридов корней T. officinale (ToPs) описаны ранее [13]. Из 50 г сырья получено 8,52 г ToPs.
Методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов в корнях T. officinale в пересчете на фруктозу. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, приливают 100 мл 95% спирта этилового, присоединяют обратный холодильник и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин. После охлаждения извлечение фильтруют. Экстракцию сырья повторяют в тех же условиях еще 2 раза со 100 и 50 мл экстрагента.
К обработанному сырью приливают 100 мл воды очищенной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин. Извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 250 мл. Экстракцию сырья повторяют еще 2 раза со 100 и 50 мл воды очищенной в течение 60 и 45 мин соответственно. Объем объединенного фильтрата доводят водой очищенной до метки (раствор А).
1 мл раствора А переносят в пробирку вместимостью 25 мл, приливают 1 мл 0,01% раствора тиомочевины, 1 мл 1% раствора резорцина, 8 мл 95% спирта этилового, 9 мл кислоты хлористоводородной концентрированной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 8 мин. После охлаждения реакционную смесь переносят в мерную колбу вместимостью 200 мл и доводят объем раствора до метки водой очищенной (раствор Б).
Оптическую плотность раствора Б определяют при длине волны 480 нм.
Для приготовления раствора сравнения 1 мл раствора А переносят в пробирку вместимостью 25 мл, приливают 1 мл 0,01% раствора тиомочевины, 9 мл 95% спирта этилового, 9 мл кислоты хлористоводородной концентрированной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 8 мин. После охлаждения реакционную смесь переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки водой очищенной.
Суммарное содержание полифруктанов (Х) в пересчете на фруктозу в % и абсолютно-сухое сырье вычисляют по формуле:
х _ D • KV • KG _шЕ1£_______10^_ Ю0
m DPrc ■ KVFrc l00 - W
где D - оптическая плотность исследуемого раствора; DFrc - оптическая плотность раствора стандартного образца фруктозы; m - масса сырья, г; mFrc - масса стандартного образца фруктозы, г; KV - коэффициент разбавления исследуемого раствора (50000); KVFrc - коэффициент разбавления раствора стандартного образца фруктозы (10000); KG - коэффициент гидролиза (0,91); W - потеря в массе при высушивании сырья, %.
Приготовление раствора стандартного образца фруктозы. Около 0,080 г (точная навеска) фруктозы переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде очищенной и доводят объем раствора до метки тем же растворителем (раствор А). 1 мл раствора А переносят в пробирку вместимостью 25 мл, приливают 1 мл 0,01% раствора тиомочевины, 1 мл 1% раствора резорцина, 8 мл 95% спирта этилового, 9 мл кислоты хлористоводородной концентрированной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 8 мин. После охлаждения реакционную смесь переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки водой очищенной (раствор Б).
Регрессионный анализ проводили с применением пакета программ Advanced Grapher ver. 2.11 (Alentum Software Inc.), метрологический анализ и обработку результатов - согласно рекомендациям [14].
Результаты и их обсуждение
Суммарный комплекс полисахаридов корней T. officinale - ToPs (выход 17,04% от массы сырья), представляет собой неокрашенное аморфное вещество, хорошо растворимое в воде при нагревании, растворы которого обладают оптической активностью {[a]D -43° (с 2.0, Н2О)}. ToPs содержит 87,94±2,19% углеводов; после гидролиза обнаружены фруктоза и следы глюкозы, а спектр поглощения окрашенного комплекса ToPs с резорцином совпадает с таковым инулина (рис. 1).
В ИК-спектре выявлены полосы поглощения, характерные для фруктанов типа инулина (v: 1427, 1332, 1250, 1245, 1134, 1087, 1071, 1031, 915, 874, 852, 817 см-1). Гель-хроматография показала, что ToPs гетероге-нен и содержит ряд полимеров с М 2,0-7,0 кДа (рис. 2). Полученные данные подтверждают результаты ранних исследований и позволяют отнести полисахариды корней T. officinale к фруктанам.
Рис. 1. Спектры поглощения комплексов с резорцином ToPs (1) и инулина (2)
Рис. 2. Градуировочный график для колонки с Сефадексом G-75 (2,5^80 см). • - положения стандартных веществ с М 0,3-13,5 кДа; Vo - объем выхода синего декстрана;
ToPs - диапазон М для комплекса водорастворимых полисахаридов корней T. officinale
Фруктозосодержащие соединения также обнаружены в составе свободных углеводов корней T. officinale: хроматографически (ВЭТСХ) выявлено присутствие фруктозы, сахарозы, 1-кестозы и нистозы, а также ряда олигомеров с более высокой СП (рис. 3). Данный факт свидетельствует о невозможности прямого определения полимерных фруктанов из водного извлечения без предварительной обработки сырья, способствующей удалению низкомолекулярных углеводов; также исключается использование спиртового осаждения полисахаридов вследствие неудовлетворительных преципитационных характеристик фруктанов [15].
Поэтому в ходе разработки методики определения полисахаридов в корнях T. officinale на начальном этапе необходимо было подобрать оптимальные условия для удаления моно- и олигосахаридов из сырья. Для решения данной задачи были применены подходы, предложенные ранее для двух видов фруктан-содержащего сырья - корневищ и корней девясила [16] и корней лопуха [13]. Установлено, что для более полного удаления свободных углеводов необходимо проведение 3-кратной экстракции 95% спиртом этиловым при 100 °С в течение 60 мин каждая и соотношение сырье : экстрагент 1 : 100. Применение данных условий позволяет добиться 98% экстракции свободных углеводов из сырья (табл. 1, рис. 4).
Рис. 3. Денситограмма раствора стандартных образцов углеводов (1) и спиртового извлечения T. officinale (2). Детектор - мочевина - H3PO4
Рис. 4. Денситограммы спиртовых извлечений T. officinale 1-4 экстракций. Детектор -дифениламин - фталаниловая кислота - H3PO4
Таблица 1. Концентрация моно- и олигосахаридов в извлечениях при последовательной экстракции 95%
спиртом этиловым, мкг/мл (% от общего содержания спирторастворимых углеводов в сырье)
Вещество Кратность экстракции s*
1 2 3 4
Frc 194 (22,46) 26 (3,01) 4,5 (0,52) - 224,5 (25,99)
Glc 4 (0,46) 1 (0,12) 2,3 (0,27) - 7,3 (0,85)
Sac 118 (13,66) 19 (2,20) 9 (1,04) - 146 (16,90)
Kes 82 (9,49) 14 (1,62) 2,2 (0,26) - 98,2 (11,37)
Nys 60 (6,95) 14 (1,62) 8 (0,93) 0,7 (0,08) 82,7 (9,58)
СП > 5 179 (20,72) 57 (6,60) 55 (6,37) 14 (1,62) 305 (35,31)
z* 637 (73,75) 131 (15,17) 81 (9,38) 14,7 (1,70) 863,7 (100)
* Суммарные показатели.
Анализируя хроматографические данные, следует отметить, что скорость экстракции фруктозы и 1-кестозы наибольшая, а нистоза и более высокомолекулярные олигомеры могут присутствовать в извлечениях 4-й кратности. Общее содержание свободных углеводов в пересчете на фруктозу в корнях T. officinale составляет 13,16-17,95% от массы сырья.
В таблицах 2 и 3 приведены результаты выбора оптимальных условий экстракции фруктанов из корней T. officinale.
Определено, что оптимальными параметрами экстракции полифруктанов являются степень измельчения сырья 0,5-1,0 мм, температура экстракции 100 °С, трехкратная экстракция длительностью 60 мин каждая при соотношении сырье : экстрагент 1 : 100 (1 и 2 контакты фаз) и 1 : 50 (3 контакт фаз).
С применением метода «введено-найдено» выявлено, что относительная ошибка определения не превышает 2% и может быть положительной и отрицательной (табл. 4).
В ходе определения метрологических характеристик разработанной методики установлено, что относительная ошибка не превышает 2% (табл. 5).
Таблица 2. Влияние степени измельчения на степень экстракции спирто- и водорастворимых углеводов из
корней T. officinale
Степень измельчения, мм Содержание углеводов в пересчете на Frc, %
спирторастворимых водорастворимых общее
<0,5 9,87±0,24 32,11±0,80 41,98
0,5-1,0 9,44±0,20 32,81±0,83 42,25
1,0-2,0 9,42±0,25 32,39±0,84 41,81
2,0-3,0 7,67±0,18 33,62±0,81 41,29
3,0-5,0 6,11±0,13 35,69±0,96 41,80
5,0-7,0 4,26±0,10 34,76±0,83 39,02
>7,0 4,04±0,10 30,12±0,75 34,16
Таблица 3. Влияние технологических параметров на степень экстракции полифруктанов из корней T. officinale
Исследуемый параметр Суммарное содержание полифруктанов в пересчете на Frc, % Исследуемый параметр Суммарное содержание полифруктанов в пересчете на Frc, %
Температура Соотношение сырье : экстрагент
20 5,15±0,12 1 : 20 3,07±0,07
40 10,37±0,25 1 : 30 11,10±0,26
60 22,20±0,42 1 : 50 25,47±0,63
80 30,29±0,72 1 : 70 27,15±0,67
100 32,17±0,82 1 : 100 31,89±0,80
Время экстракции, мин Кратность экстракции
1 (±0,49-0,86) 2 (±0,17-0,21) 3 (±0,03-0,05) 4 (±0,01-0,02)
15 19,73 6,96 1,34 -
30 31,24 7,13 1,38 -
45 33,28 7,17 1,42 0,03
60 34,47 7,64 1,38 0,03
75 33,78 7,23 1,38 0,04
90 33,02 7,17 1,36 0,03
105 33,01 7,12 1,36 0,03
120 32,84 7,10 1,35 0,03
Таблица 4. Метод «введено-найдено»
Содержание полифрукта-нов в аликвоте, мкг Frc Введено инулина, мкг Frc Должно быть полифруктанов, мкг Frc Найдено полифруктанов, мкг Frc Ошибка
аб^, мкг отн., %
3215 800 4015 3997 -18 0,45
3215 1600 4815 4751 -64 1,33
3215 2400 5615 5692 +77 1,37
3215 3200 6415 6341 +74 1,15
Таблица 5. Метрологические характеристики разработанной методики (n = 10, P = 0,95, tPf = 2,26)
Сырье* x, % S2 Sx +Ax, % E, %
1 15,27 9,96-10'2 9,9910-2 0,23 1,51
2 33,05 5,67-Ю'1 2,38-10'1 0,54 1,63
3 33,42 6,32-Ю'1 2,52-Ю'1 0,57 1,71
* Производители указаны в экспериментальной части.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что разработанная методика является правильной и воспроизводимой и может быть рекомендована в практике фармацевтического анализа для количественной характеристики корней T. officinale.
Выводы
В ходе исследования официнального растительного сырья - корней одуванчика лекарственного (Taraxacum officinale Wigg.) определены оптимальные параметры экстракции полисахаридов (полифруктанов). Разработана методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов, основанная на резорциновом методе определения кетоз, с величиной относительной ошибки не более 2%.
Список литературы
1. Schultz K., Carle R., Schieber A. Taraxacum - A review on its phytochemical and pharmacological profile // J. Ethno-pharmacol. 2006. V. 107. Pp. 313-323.
2. Yanovsky E., Kingsbury R.M. New sources of inulin // J. Am. Chem. Soc. 1931. V. 53. Pp. 1597-1601.
3. Bacon J.S.D., Edelman J. The carbohydrates of the Jerusalem artichoke and other Compositae // Biochem. J. 1951. V. 48. Pp. 114-126.
4. Rutherford P.P., Deacon A.C. The mode of action of dandelion root P-fructofuranosidases on inulin // Biochem. J. 1972. V. 129. Pp. 511-512.
5. Rutherford P.P., Deacon A.C. Seasonal variation of dandelion roots of fructosan composition // Ann. Bot. 1974. V. 38. Pp. 251-260.
6. Ernst M., Chatterton N.J., Harrison P.A. Purification and characterization of a new fructan series from species of As-teraceae // New Phytol. 1996. V. 132. Pp. 63-66.
7. Akhtar M.S., Khan Q.M., Khalid T. Effect of Portulaca olearaceae (Kulfa) and Taraxacum officinale (Dhudhai) in nornoglycaemic and alloxan-treated hyperglycaemic rabbits // J. Pak. Med. Assoc. 1985. V. 35. Pp. 207-210.
8. Taraxacum officinale. Monograph // Altern. Med. Rev. 1999. V. 4. Pp. 112-114.
9. Trojanova I., Rada V., Kokoska L., Vlkova E. The bifidogenic effect of Taraxacum officinale root // Fitoterapia. 2004. V. 75. Pp. 760-763.
10. Baba K., Abe S., Mizuno D. Antitumor activity of hot water extract of dandelion, Taraxacum officinale - Correlation between antitumor activity and timing of administration // Yakkugaku Zasshi. 1981. V. 101. Pp. 538-543.
11. Государственная фармакопея СССР. XI изд. М., 1990. Вып. 2. С. 356-357.
12. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Углеводы Lamiaceae. I. Пектиновые вещества и гемицеллюлозы Mentha x piperita // Химия природных соединений. 2007. №5. С. 411-416.
13. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов в корнях лопуха (Arctium spp.) // Химия растительного сырья. 2010. №1. С. 115-120.
14. Дёрффель К. Статистика в аналитической химии. М., 1994. 252 с.
15. Ku Y., Jansen O., Oles C.J., Lazar E.Z., Rader J.I. Precipitation of inulins and oligoglucosides by ethanol and other solvents // Food Chem. 2003. V. 81. Pp. 125-132.
16. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М., Чехирова Г.В., Петров Е.В. Методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов в корневищах и корнях девясила высокого (Inula helenium L.) // Химия растительного сырья. 2008. №1. С. 95-99.
Поступило в редакцию 13 ноября 2008 г.
