Исследование химического состава надземной части манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L. S. L Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Химия растительного сырья. 2000. №2. С. 79-85.

УДК 615.322:547.913(571)

ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА НАДЗЕМНОЙ ЧАСТИ МАНЖЕТКИ ОБЫКНОВЕННОЙ ALCHEMILLA VULGARIS L.S.L

© В.Ю. Андреева, Г.И. Калинкина

Сибирский государственный медицинский университет, Томск (Россия), e-mail [email protected]

Проведен химический анализ надземной части манжетки обыкновенной. Установлено, что манжетка содержит богатый комплекс биологически активных веществ (БАВ), среди которых преобладают фенольные соединения и полисахариды. Методом бумажной хроматографии обнаружено не менее 18 веществ, из них 14 - флавоноиды, 4 -кумарины и фенолкарбоновые кислоты. Данные вещества выделены методом последовательной экстракции эфиром, хлороформом, этилацетатом, н-бутанолом и водой. Идентификацию проводили методом хроматографии на бумаге, спектрофотометрически с использованием достоверно известных веществ. Кумарины идентифицированы как эскулетин, эскулин, умбеллиферон, скополетин; флавоноиды - кверцетин, апигенин, лютеолин, рутин, апигенин-7-глюкозид, лютеолин-7-глюкозид, фенолкарбоновые кислоты - кофейная, хлорогеновая, феруловая, синаповая, эллаговая, п-кумаровая. Кроме того, установлено количественное содержание и качественный состав полисахаридов, аминокислот, микроэлементов, содержание витаминов С, К, каротиноидов.

ВВЕДЕНИЕ

Манжетка обыкновенная - Alchemilla vulgaris L.s.l., сем. Rosaceae - многолетнее травянистое растение. В настоящее время растение находит широкое применение в народной медицине под названием камчужная трава, золотой корешок, росничка в качестве противовоспалительного, вяжущего, мочегонного и противодиабетического средства. Часто встречаются сведения об использовании манжетки в качестве кровоостанавливающего средства, а именно при носовых и маточных кровотечениях, предлагается в составе противодиабетического сбора [1-3].

В эксперименте установлено, что водно-спиртовой экстракт из надземной части манжетки, собранной в окрестностях Томска оказывает отчетливое влияние на реологические параметры крови у животных, что выражалось в нормализации показателей вязкости плазмы и спонтанной агрегации эритроцитов, а также в снижении вязкости крови, гематокрита и уровня фибриногена в плазме. Все это дает возможность использовать это растение в кардиологической практике для профилактики инфаркта миокарда и других заболеваниях сердечно-сосудистой системы, сопровождаемых развитием синдрома повышенной вязкости [4]. Последние данные явились основанием для детального исследования химического состава манжетки обыкновенной, произрастающей в Сибири, поскольку литературные сведения по этому вопросу касаются в основном либо подземных органов, либо европейских видов манжетки и недостаточны для рекомендации этого растения в медицинскую практику.

Экспериментальная часть

В надземной части манжетки обыкновенной Alchemilla vulgaris L.s.l., собранной в окрестностях Томска в фазу цветения, общепринятыми и разработанными нами методиками определяли присутствие и

Автор, с которым следует вести переписку.

количественное содержание фенольных соединений, в том числе флавоноидов, кумаринов,

фенолкарбоновых кислот, дубильных веществ; полисахаридов, аминокислот, витаминов С, К, каротиноидов, микроэлементов. Доказано отсутствие сапонинов, антрагликозидов и алкалоидов.

Содержание суммы фенольных соединений определяли перманганатометрическим методом [5], флавоноидов и кумаринов - спектрофотометрическим методом [6-11], фенолокислот -

хроматоспектрофотометрическим методом [12], дубильных веществ - перманганатометрическим методом после осаждения последних 5%-ным раствором желатина [13] (табл. 1).

Качественное обнаружение из сырья аминокислот проводили в водно-спиртовом извлечении в присутствии 0,02% спиртового раствора при нагревании на водяной бане или в сушильном шкафу при 60 °С в течение 30 мин (14). Мономерный состав аминокислот устанавливали методом распределительной нисходящей хроматографии на бумаге БИ^ак БМ-6 в системе растворителей: ацетон-

бутанол-вода (4 : 1 : 5). Для их идентификации использовали заведомо известные стандартные образцы аминокислот. Были выявлены аргинин, гистидин, лизин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аланин, триптофан, фенилаланин.

Для количественного определения аминокислот использовали разработанную нами методику, основанную на их способности к образованию окрашенного комплекса с раствором нингидрина.

Методика определения. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 150 мл, прибавляют 30 мл 70%-ного спирта, колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане в течение 45 мин. Затем колбу охлаждают до комнатной температуры под струей холодной воды и извлечение фильтруют через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию повторяют еще раз указанным выше способом 35 мин. Извлечение фильтруют через тот же фильтр в ту же мерную колбу, фильтр промывают 70%-ным спиртом и доводят объем фильтрата спиртом до метки (раствор А).

К 2 мл раствора А прибавляют 2 мл 0,02%-ного раствора нингидрина, доводят объем до 25 мл (раствор Б). Смесь нагревают на водяной бане при 60 °С в течение 30 мин. Оптическую плотность окрашенного комплекса определяют при длине волны 570 нм. Максимум поглощения определяют экспериментально по

Таблица 1. Результаты фитохимического анализа

надземной части манжетки обыкновенной

Группа биологически активных веществ Содержание, %

Фенольные соединения, 9,60 ± 0,30

в том числе:

флавоноиды 5,20 ± 0,52

кумарины 0,11 ± 0,01

фенолкарбоновые кислоты 0,03 ± 0,01

дубильные вещества 4,15 ± 0,20

Полисахаридный комплекс: 22,67 ± 1,00

водорастворимые полисахариды 2,02 ± 0,30

пектиновые вещества 0,43 ± 0,02

гемицеллюлоза А 14,41± 0,05

гемицеллюлоза В 5,61 ± 0,50

Аминокислоты 3,50± 0,29

Витамин С, мг/% 0,33 ± 0,03

Витамин К, мг/% 0,17 ± 0,01

Каротиноиды, мг/% 8,37 ± 0,40

Микроэлементы А1, N1, Мо, РЬ,

Єг, V, Ті, Со,

гп, Си, са, Мп

Сапонины -

Антрогликозиды -

Алкалоиды -

Примечание: «—» - отсутствует

спектру продукта реакции в видимой области света. Параллельно определяют оптическую плотность комплекса стандартного образца аланина, преобладающего в сумме аминокислот, с нингидрином.

Содержание аминокислот в пересчете на аланин и абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляют по формуле:

Бх • 0,00002928 • V. • У3•100•100

х = х ^_______________1 3_________

Бсп • т • V2 • (100 — ’№) ’

где Бх - оптическая плотность испытуемого раствора; Бст - оптическая плотность комплекса стандартного образца аланина с нингидрином; 0,00002928 - содержание стандартного образца аланина в 1 мл раствора; У1 - объем раствора А в мл; У2 - объем аликвоты взятой из раствора А в мл; У3 - объем раствора Б в мл; т - масса сырья в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в %.

Присутствие витамина К подтвердили качественной реакцией с 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия в щелочной среде [15]. Данная реакция положена нами в основу спектрофотометрического метода количественного определения витамина К в растительном сырье.

Методика определения. 20.0 г сырья помещали в колбу и заливали 100 мл ацетона, экстракцию проводили на холоде постоянно помешивая в течение 10-12 ч, экстракт отфильтровывали, растворитель удаляли под вакуумом и сухой остаток растворяли в 100 мл этанола (раствор А). 5 мл раствора А доводили этанолом до 25 мл (раствор Б). К 2 мл раствора Б добавляли 1 мл 1 %-ного спиртового раствора гидроксида натрия и 0,3 мл 2,6 - дихлорфенолиндофенолята натрия, доводили спиртом до метки 10 мл. Оптическую плотность полученного раствора измеряли через 10 мин при длине волны 670 нм. Максимум поглощения определяли экспериментально по спектру продукта реакции в видимой области света. Параллельно определяли оптическую плотность стандартного образца метинона, приготовленного аналогичным образом. Содержание витамина в процентах (Х) вычисляют по формуле:

б х • Сст • V • Уз • 100 • 100

Б ст • т • У2 • (100 — ^№) , где Бх - оптическая плотность испытуемого раствора; Бст - оптическая плотность раствора стандартного образца метинона; Сст - содержание стандартного образца метинона в 1 мл раствора; У1 - объем раствора А в мл; У2 - объем аликвоты, взятой из раствора А в мл; У3 - объем раствора В в мл; т - масса сырья в граммах; W - потеря в массе при высушивании сырья в %.

Полисахаридный комплекс (ПСК) выделяли тремя фракциями [16]. Водорастворимые полисахариды (ВРПС) извлекали водой и осаждали двукратным объемом 96%-ного этанола, остаток сырья обрабатывали водой, подкисленной хлороводородной кислотой и осаждали пектиновые вещества (ПВ) двукратным объемом этанола. Шрот экстрагировали 10%-ным раствором гидроксида натрия и осаждали гемицеллюлозу А (Гц А) 50%-ной уксусной кислотой. В фильтрате осаждали гемицеллюлозу В (Гц В) 2-кратным объемом этанола.

Мономерный состав отдельных фракций ПСК устанавливали методами хроматографии на бумаге (БХ) после гидролиза 10%-ным раствором серной кислоты при 1 = 100-105 °С в течение 18 ч.

Распределительную восходящую хроматографию на бумаге выполняли в системах растворителей: ацетон-н-бутанол-вода (7 : 2 : 1) и этилацетат - уксусная кислота - муравьиная кислота - вода (18 : 3 : 1 : 4) на бумаге РИ1так БМ-5. Для обнаружения моносахаридов на хроматограмме использовали раствор кислого анилинфталата при последующем нагревании хроматограмм при 105 °С в течение 10 мин. Идентификацию углеводов проводили с помощью заведомо известных стандартных образцов.

Содержание фракций ПСК определяли гравиметрическим методом. Содержание нейтральных сахаров, в том числе свободных, определяли спектрофотометрическим методом по стандартному образцу глюкозы. Характеристика всех фракций ПСК манжетки обыкновенной, выделенных из сырья поэтапным извлечением, приведена в таблице 2.

Таблица 2. Полисахариды манжетки обыкновенной

Полисахариды Содержание восстанавливающих сахаров, % Компонентный состав

тип содержание, % нейтральные в том числе свободные

ВРПС 2,02 1,72 1,46 Глюкоза, арабиноза

ПВ 0,43 17,78 5,66 Глюкоза, галактоза, арабиноза

ГЦ а 14,41 6,36 3,69 Глюкоза, галактоза, ксилоза

ГЦ Б 5,61 13,35 10,68 Глюкоза, галактоза, арабиноза, ксилоза, рамноза

Обсуждение результатов

Содержание ПСК в надземной части манжетки обыкновенной составило 22,67%. Полученные данные свидетельствуют о преобладании фракции гемицеллюлозы (14%). Наибольшее содержание нейтральных сахаров отмечено во фракции пектиновых веществ (17,78%), а во фракции гемицеллюлозы Б большую часть нейтральных сахаров составляют свободные сахара. По компонентному составу фракции отличаются. Во фракции ВРПС обнаружены глюкоза, арабиноза; фракции ПВ - глюкоза, галактоза, арабиноза; фракции ГЦ А - глюкоза, галактоза, ксилоза; фракции ГЦ Б - глюкоза, галактоза, арабиноза, ксилоза, рамноза.

Качественное и количественное определение микроэлементов проводили атомно-эмиссионным методом с предварительным озолением биологической пробы. Оценку осуществляли с помощью градуировочных графиков, построенных на основе искусственных смесей с заданной концентрацией микроэлементов. Искусственные смеси готовили из спектрально чистых солей натрия хлорида, кальция карбоната в соотношениях, характерных для исследуемых биологических объектов с учетом коэффициентов концентрирования из оксидов определяемых элементов [17]. В анализируемых образцах нами обнаружено не менее 12 микроэлементов (табл. 1). Отмечалась склонность к накоплению цинка, меди, кобальта, алюминия.

Результаты, представленные в таблице 1, свидетельствуют о преобладании в надземной части манжетки фенольных соединений (9,6%), представленных в основном флавоноидами (5,20%) и дубильными веществами (4,5%). Для исследования качественного состава фенольных соединений из надземной части получали водно-спиртовое извлечение путем исчерпывающей экстракции 70%-ным этанолом на кипящей бане с обратным холодильником. Экстракт сгущали под вакуумом до водного остатка и последовательно обрабатывали эфиром, хлороформом, этилацетатом и н-бутанолом по схеме (рис.). Из полученных фракций удаляли под вакуумом растворители и использовали их для анализа фенольных соединений.

Флавоноиды исследовали методом двумерной хроматографии на бумаге марки ЕЫ-5, БМ-6 (РШгак) в системе растворителей: первое направление - изопропанол - муравьиная кислота - вода (5 : 2 : 5); второе направление - н-бутанол - уксусная кислота - вода (10 : 3 : 7).

Хроматографирование проводили в нескольких повторностях. Одну хроматограмму проявляли парами аммиака и раствором алюминия хлорида, просматривали в УФ-свете до и после проявления. С дубликатных хроматограмм каждое обнаруженное пятно агликона и гликозида вырезали, измельчали и элюировали 60%

этанолом. Элюаты флавоноидных гликозидов гидролизовали 10%-ным раствором кислоты серной (1 : 2 по объему) в течение трех часов на водяной бане.

Свободные агликоны (элюированные с хроматограмм) и связанные агликоны (образующиеся после кислотного гидролиза флавоноидных гликозидов) хроматографировали на бумаге марки ЛМ в системе растворителей: кислота уксусная - кислота хлористоводородная - вода (30 : 3 : 10). Для идентификации агликонов использовали характерное свечение их в УФ-свете, величины И" и окраску пятен на хроматограммах после проявления парами аммиака и раствором алюминия хлорида сравнивали с заведомо известными веществами. Углеводы в гидролизате также ананлизировали хроматографически.

^ Удаление этанола ^ Обработка горячей водой

Фильтрация

~ ~ Т - -

Водный остаток

Эфирное извлечение

т

Водный остаток

Хлороформное извлечение

т

Водный остаток

Этилацетатное извлечение

Водный остаток

Бутанольное извлечение

___________і__________

Удаление растворителя

т

Оксикоричные кислоты

___________і__________

Удаление растворителя

т

Кумарины

Удаление растворителя

т

Флавоноиды

___________1__________

Удаление растворителя

Рис. Схема разделения фенольных соединений манжетки обыкновенной

В надземной части манжетки обыкновенной обнаружили 14 веществ флавоноидной природы, из которых идентифицировали кверцетин, апигенин, лютеолин, рутин, апигенин-7-глюкозид, лютеолин-7-глюкозид. Полученные данные по качественному составу фенольных соединений манжетки обыкновенной согласуются с литературными данными и дополняют их новыми для этого растения биологически активными веществами.

Кумарины. Хлороформную фракцию анализировали методом нисходящей хроматографии на бумаге марки ленинградская средняя, импрегнированной смесью формамид-ацетон (1 : 3). В качестве подвижной фазы использовали хлороформ. Обнаружение веществ проводили в УФ-свете до и после обработки хроматограмм натрия гидроксидом, затем по характерной окраске после обработки хроматограмм диазотированной сулфаниловой кислотой.

Нами обнаружено не менее четырех веществ кумариновой природы, которые по флюоресценции в УФ-свете, характерной окраске с реагентами, по величине И при сравнении с известными веществами соответствуют эскулетину, эскулину, умбеллиферону и скополетину.

Фенолкарбоновые кислоты исследовали методом двумерной хроматографии на бумаге марки БМ-б в системе растворителей: первое направление - 2%-ная уксусная кислота; второе направление - н-бутанол -кислота уксусная - вода (4 : 1 : 5). Детектирование фенолкарбоновых кислот проводили в УФ-свете до и после проявления хроматограмм натрия гидроксидом. В надземной части манжетки обнаружили не менее 14 фенолкарбоновых кислот. Идентификацию данных веществ проводили путем сравнения величины Ш" и окраски пятен с известными веществами. В результате с определенной достоверностью можно утверждать, что в надземной части манжетки обыкновенной присутствуют синаповая, кофейная, п-кумаровая, феруловая, хлорогеновая и эллаговая кислоты.

Выводы

Проведен общий фитохимический анализ надземной части манжетки обыкновенной. Установлено содержание богатого комплекса БАВ, среди которых преобладают вещества фенольной природы (9,6%) и полисахариды (22,б7%).

Фенольные соединения представлены флавоноидами (5,20%), кумаринами (0,11%), фенолкарбоновыми кислотами (0,03%) и дубильными веществами (4,15%). Флавоноиды представлены не менее 14 веществами, из которых идентифицированы кверцетин, апигенин, лютеолин, рутин, апигенин-7-глюкозид, лютеолин-7-глюкозид; кумарины - эскулетин, эскулин, умбеллиферон и скополетин; фенолкарбоновые кислоты -синаповая, кофейная, п-кумаровая, феруловая, хлорогеновая и эллаговая.

В ПСК определены водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества и гемицеллюлозы, мономерными единицами которых являются глюкоза, галактоза, арабиноза, рамноза и ксилоза. В составе аминокислот идентифицированы аргинин, гистидин, лизин, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, аланин, триптофан, фенилаланин. Микроэлементный состав представлен А1, N1, Мо, РЬ, Сг, V, Ті, Со, 2п, Си, Са, Мп.

Список литературы

1. Виноградов В.М., Виноградова Т.А., Гатьев Б.Н. Справочник по траволечению детей и взрослых. СПб., 1996.

С. 127-128.

2. Гатьев Б.Н., Мартынов В.К. Лечение детей лекарственными растениями. СПб., 1995. С. 14-15.

3. Миниджан Г.С. Сборник по народной медицине и нетрадиционным способам лечения. М., 1994. Кн. 2. С. 28.

4. Плотников М.Б., Колтунов А.А., Алиев О.И., Калинкина Г.И., Березовская Т.П., Андреева В.Ю. Гемореологические свойства экстрактов из некоторых растений, содержащих флавоноиды // Раст. ресурсы. 1998. Вып. 1. С. 87-90.

5. Государственная Фармакопея СССР. 11-е изд. Вып.1 и 2. М., 1987.

6. Гринкевич Л.И., Сафронич Л.М. Химический анализ лекарственных растений. М., 1983.

7. Дзюба Н.П., Хаит Г.Я., Цушенко В.Н. Установление качественного и количественного состава полисахаридов в растительном сырье и препаратах физико-химическими методами // Фармацевтический журнал. 1975. №6. С. 54-58.

8. Девятин В.А. Методы химического анализа в производстве витаминов. М., 1964.

9. Кашкан Г.В., Кулешов В.И., Баранова В.О. Атомно-эмиссионное определение микроэлементов в биологических

образцах // Аналитическая химия. 1 988. Вып. 7. С. 1 8-19.

10. Прокопенко О.П., Тарасенко О.О. Колориметрический метод количественного определения кумаринов // Фармацевтический журнал. 1962. №6. С. 18-22.

11. Хайс И.М., Мацек К.Л. Хроматография на бумаге. М., 1962. С. 260-268.

12. Завадская П.М., Горбачева Г.И., Малушина И.С. Количественное определение углеводов резорциновым и

анилинфталатным методом с помощью бумажной хроматографии сахаров, органических кислот и аминокислот у растений. М.;Л., 1962. 78 с.

13. Федосеева Г.М. Способы определения полифенольных соединений: Автореф. дис. ... д-ра. фарм. наук. Якутск, 1981.

14. Высочина Г.И., Березовская Т.П.. Содержание флавоноидов в некоторых видах Poligonum L. Секции Persicaria (Mill.) флоры Сибири // Растительные ресурсы. 1987. Вып. 2. С. 229-234.

15. Бандюкова В.А. Применение цветных реакций для обнаружения флавоноидов путем хроматографии на бумаге // Растительные ресурсы. 1965. Вып. 4. С. 591-596.

16. Шинкаренко А. Л., Бандюкова В.А., Казаков А. Л. Методы исследования природных флавоноидов. Пятигорск, 1977.

17. Айвазов Б.В. Введение в хроматографию. М., 1 983.

Поступило в редакцию 12 апреля 2000 года