CC BY
90
ЛЕКАРСТВЕННЫЕ РАСТЕНИЯ
© МАРТЫНОВ А.М., ДАРГАЕВА Т.Д. — 2009
ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ И ВОДОРАСТВОРИМЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ ФИАЛКИ ПАТРЭНА
А.М. Мартынов, Т.Д. Даргаева (Иркутский государственный институт усовершенствования врачей, ректор — д.м.н., проф. В.В. Шпрах, кафедра фармации, зав. — д.ф.н., проф. Г.Н. Ковальская; Всероссийский институт лекарственных и ароматических растений г. Москва, директор — акад. РАМН В.А. Быков)
Резюме. Изучен состав фенольных соединений надземной части фиалки Патрэна Viola patrinii Ging. Идентифицированы фенолкарбоновые кислоты: галловая, хлорогеновая, кофейная, цикориевая, феруловая, нео-хлорогеновая; флавоноиды: гесперидин, лютеолин-7-гликозид, кемпферол-3-гликозид, витексин; а также кумарин: О-метоксикумарин. Методом внутренней нормализации установлено, что преобладающими среди фенолокислот являются цикориевая и кофейная, из флавоноидных соединений — витексин и кемпферол-3-гликозид. Исследован состав комплекса водорастворимых полисахаридов.
Ключевые слова: фиалка Патрэна, фенольные соединения, водорастворимые полисахариды.
PHENOL COMPOUNDS AND WATER-SOLUBLE POLYSACCHARIDES OF VIOLA PATRINII GING
А.М. Martynov, Т.D. Dargaeva (Irkutsk State Institute for Postgraduate Medical Education,
All-Russian Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Moscow)
Summary. The composition of phenol compounds of the overground part of Patren’s violet Viola patrinii Ging. was studied. The phenol carbonic acids (gallic, chlorogenic, coffee, chicory, ferulic and neochlorogenic acids); flavanoids (hesperidin, lyuteolin-7-glicozide, kempherol-3-glicozide and vitexin) as well as coumarin (O-methoxycoumarin) were identified. It was established by the method of internal normalization, that the chicory and coffee acids prevailed among the phenol acids; the vitexin and kempherol-3-glycoside prevailed among flavanoid compounds.
The composition of the complex of water-soluble polysaccharides was investigated.
Key words: phenol compounds, water-soluble polysaccharides.
Фиалка Патрэна — Viola patrinii Ging., семейства фиалковых (Violaceae) представляет собой многолетнее травянистое растение, достаточно широко распространенное во флоре России (Восточная Сибирь, Дальний Восток) [6]. Данный вид издавна применяется в Китайской и Тибетской медицине в качестве лечебного средства. Надземная часть используется как дезинток-сикационное средство при туберкулезе легких и лимфатических узлов, а также при пиодермии, фурункулезе, злокачественных новообразованиях, дизентерии и как мягчительное при лечении нарывов и незаживающих ран. Цветки в Китае применяют в онкологии [4].
Сведений по химическому составу фиалки Патрэна в литературных источниках крайне мало, а имеющиеся данные не дают сколько-нибудь полного представления об этом виде. Применение фиалки Патрэна в качестве лекарственного средства при ряде серьезных заболеваний, не изученность химического состава и послужило основанием для исследования ее состава.
Материалы и методы
Объектом исследования служила высушенная надземная часть растения, заготовленная во время цветения, собранная в 2007-2008 гг. в Иркутском сельском районе.
Цель данной работы заключалась в исследовании фенольных соединений и водорастворимых полисахаридов травы фиалки Патрэна.
Состав фенольных соединений изучался с использованием химических и физико-химических методов (ТСХ, БХ, ВЭЖХ, УФ-спектроскопия).
Выделяли фенольные соединения из воздушносухого сырья, измельченного и проходящего сквозь сито диаметром отверстий 2 мм. Экстракцию проводили 70 % спиртом этиловым, в соотношении 1:5 при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником до полного истощения сырья. Полученные извлечения объединяли и упаривали под вакуумом на роторном испарителе до полного удаления спирта эти-
лового. Водное извлечение охлаждали и для отделения лиофобных веществ (смол и хлорофилла) фильтровали. Фильтрат последовательно экстрагировали хлороформом, этилацетатом. Водный остаток спирто-водного извлечения многократно обрабатывали равным объемом хлороформа. Объединенные хлороформные извлечения подвергали отгонке под вакуумом. Таким образом, получена хлороформная фракция. Водный остаток после получения хлороформной фракции нагревали на водяной бане для удаления хлороформа. После охлаждения водный остаток также обрабатывали исчерпывающе этилацетатом и получали этилацетатную фракцию. В дальнейшем проводили исследования на наличие фенольных соединений с использованием качественных реакций и хроматографических методов [1, 3, 7].
Хлороформную фракцию исследовали на наличие кумаринов с помощью качественных реакций и методом тонкослойной хроматографии на пластинках «БИиЫ» в системе растворителей н-гексан-бензол-метиловый спирт (5:4:1). Хроматограммы высушивали и обрабатывали 10 % раствором калия гидроксида в спирте метиловом и высушивали в сушильном шкафу при 110°С 2 мин отмечали окраску и положение пятен при просмотре в УФ-свете, затем обрабатывали свежеприготовленным диазореактивом.
Флавоноиды определяли в этилацетатном извлечении и водном остатке с использованием качественных реакций: цианидиновой пробы, с 10 % раствором натрия гидроксида и с 2 % раствором алюминия хлорида. Кроме того, использован метод бумажной хроматографии с применением систем растворителей: н-бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:5), 15 и 30 % раствор уксусной кислоты, для проявления хроматограмм применяли специальные реактивы: 10 % раствор натрия гидроксида, пары аммиака [7]. Хроматограммы просматривались в видимом и УФ-свете до, и после обработки хромогенными реактивами.
Фенолкарбоновые кислоты определяли в этилаце-татной фракции методом бумажной хроматографии по-
сле обработки парами аммиака, раствором железа (III) хлорида, реактивом Шмидта.
Исследование состава фенольных соединений проводили методом ВЭЖХ на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «GILSTON» (Франция) с последующей компьютерной обработкой результатов с помощью программы «Multichrom for Windows». В качестве неподвижной фазы использовалась металлическая колонка размером 4,6x250 мм PLATINUM EPS C 18 100 A, с величиной частиц 5 микрон, в качестве подвижной фазы — метанол-вода-фосфорная кислота, концентрированная в соотношении 400:600:5. Анализ проводили при комнатной температуре со скоростью подачи элю-ента 0,5 мл/мин. Продолжительность анализа составляла 46 мин. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора «GILSTON» UV/VIS модель 151 при длине волны 254 нм.
Для изучения состава траву фиалки Патрэна измельчали до размера частиц проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм (ГОСТ 214-83).
5,0 г сырья помещали в колбу объемом 250 мл, прибавляли 50 мл 70 % спирта этилового, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 2 часов с момента закипания спиртоводной смеси в колбе. Смесь охлаждали, фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу объемом 100 мл и доводили спиртом этиловым 70 % до метки, перемешивали и фильтровали (исследуемый раствор). Одновременно готовили серию 0,05 % растворов сравнения в 70 % спирте этиловом флавоноидов, фенолкар-боновых кислот и кумаринов. Объем вводимой исследуемой пробы и растворов сравнения составлял 20 мкл. Идентификацию разделяемых веществ проводили путем сопоставления времени удерживания компонентов смеси со временем удерживания стандартных образцов. Количественное определение идентифицированных веществ в исследуемом образце проводили по площади пика, используя метод внутренней нормализации.
Водорастворимые полисахариды (ВРПС) извлекали из воздушно-сухого шрота, оставшегося после экстракции 70 %-ным спиртом этиловым, 1,5 л воды при нагревании на водяной бане в течение 1ч. Повторное извлечение ВРПС проводили дважды при соотношении сырье — экстрагент (1:10). Сырье отделяли центрифугированием. Полученные объединенные экстракты упаривали под вакуумом до 20 % от первоначального объема. Затем полисахариды осаждали трехкратным количеством 96 %-ного спирта этилового, выпавшие осадки отфильтровывали под вакуумом и последовательно промывали 96 %-ным спиртом этиловым, ацетоном и высушивали.
Количественную оценку полисахаридного комплекса, выделенного из надземной части фиалки Патрэна проводили гравиметрическим методом [2].
Идентификацию моносахаридного состава полисахаридного комплекса после их предварительного гидролиза серной кислотой (1 моль/л) [5] проводили с помощью бумажной (БХ) и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Для детального исследования состава полисахаридного комплекса использован метод ВЭЖХ. Анализ проводили также на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «GILSTON». В качестве неподвижной фазы использовалась металлическая колонка размером 4,6x250 мм Ультрасил-МИ2. Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (85:15). Исследование проводили при температуре колонки 85 °С со скоростью подачи элюента 3 мл/мин. Продолжительность анализа составляла 30 мин. Детектирование осуществлялось с помощью спектрофотометрического детектора при длине волны 190 нм.
Исследованию подвергались гидролизаты ВРПС. Параллельно готовили серию 0,6 %-ных водных растворов сравнения сахаров: рамнозы, ксилозы, мальтозы, глюкозы, лактозы, арабинозы, сахарозы, фруктозы, галактозы, маннозы и сорбита. По 20 мкл испытуемого раствора и растворов сравнения сахаров вводили в хроматограф и хроматографировали по выше описанной методике.
Результаты и обсуждение
В результате проведенного хроматографического исследования установлено в траве фиалки Патрэна 6 веществ, относящиеся к фенолкарбоновым кислотам, 4 вещества флавоноидной структуры и 1 соединение ку-мариновой природы.
Всего методом ВЭЖХ обнаружено 14 веществ фенольной природы, в основном представленные флавон оидами и фенолкарбоновыми кислотами. По времени удерживания растворов стандартных образцов 11 веществ идентифицированы — кислоты: галловая, хлорогеновая, кофейная, цикориевая, феруловая, неохлорогеновая; флавоноиды: гесперидин, лютеолин-7-гликозид, кемпферол-3-гликозид, витексин; а также кумарин и О-метоксикумарин (табл. 1). Методом внутренней нормализации установлено, что преобладающими среди фенолокислот являются цикориевая и кофейная, из флавоноидных соединений — витексин и кемпферол-3-гликозид.
Фенольные соединения, обнаруженные в траве фиалки Патрэна: галловая, хлорогеновая, кофейная, цикориевая, феруловая, неохлорогеновая кислоты; флавоноиды: гесперидин, лютеолин-7-гликозид, кемпферол-3-гликозид, витексин; а также кумарин: О-метоксикумарин идентифицированы впервые.
Таблица 1
Фенольные соединения надземной части фиалки Патрэна
Вещество Время удерживания, мин. Количественное соотношение, %
Галловая кислота 5,7 2,54
Хлорогеновая 6,05 8,09
Кофейная кислота 6,38 8,75
Цикориевая 9,95 8,83
Феруловая 11,24 3,72
Гесперидин 13,95 4,82
Неохлорогеновая 14,11 2,41
Лютеолин-7-гликозид 15,85 7,84
Кемпферол-3-гликозид 23,9 9,25
Витексин 29,48 22,02
О-метоксикумарин 34,92 6,72
Методом последовательной экстракции и осаждением спиртом этиловым из травянистой части фиалки Патрэна получена полисахаридная фракция: ВРПС. Количественное содержание ВРПС определяли после высушивания гравиметрическим методом, и составляло 11,9 %.
Выделенный комплекс ВРПС представлял собой аморфный порошок желтовато-серого цвета, растворимый в воде, в водных растворах кислот и щелочей, но не растворимый в органических растворителях, осаждается спиртом и ацетоном. После кислотного гидролиза данный комплекс дает положительную реакцию с реактивом Фелинга.
Для изучения моносахаридного состава провели гидролиз 0,1 М раствором серной кислоты. Идентифицировали моносахариды методом бумажной хроматографии путем сравнения с достоверными образцами [7]. Хроматографирование осуществляли в системах растворителей: н-бутанол — уксусная кислота — вода (4:1:5) и н-бутанол — пиридин — вода (6:4:3). Проявляли хроматограммы анилинфталат-ным реактивом, активировали при температуре 100110 °С в сушильном шкафу в течение 10-15 минут. На хроматограммах моносахариды проявлялись в виде красновато-коричневых пятен, совпадавших по значению Бі с известными образцами сахаров. Таким образом, в гидролизате идентифицированы: глюкоза, галактоза, рамноза, ксилоза, манноза, фруктоза, сорбит и уроновые кислоты: глюкуроновая и галактуроновая.
Таблица 2
Углеводный состав надземной части фиалки Патрэна
Вещество Время удерживания, мин. Количественное соотношение, %
Сорбит 1,2 3,9
Рамноза 2,58 12,02
Ксилоза 3,27 1,74
Фруктоза 4,39 14,2
Глюкоза 4,82 10,8
Манноза 6,01 17,2
Галактоза 10,84 6,91
Методом ВЭЖХ в исследуемом комплексе ВРПС установлен качественный состав моносахаридов. По времени удерживания стандартных растворов в комплексе ВРПС идентифицировано 7 монсахаридов: рамноза, ксилоза, сорбит, глюкоза, фруктоза, галактоза,
манноза. Методом внутренней нормализации установлено, что преобладающими в комплексе ВРПС являются манноза, фруктоза, рамноза. Результаты исследований представлены в табл. 2.
Таким образом, исследован состав фенольных соединений травы фиалки Патрэна, установлено наличие 22 соединений фенольного характера, относящихся в основном по структуре к флавоноидам, фенолкарбоновым кислотам и кумаринам. Из них 11 веществ идентифицированы — кислоты: галловая, хлорогеновая, кофейная, цикориевая, феруловая, не-охлорогеновая; флавоноиды: гесперидин, лютеолин-7-гликозид, кемпферол-3-гликозид, витексин; а также кумарин: О-метоксикумарин. Выделен комплекс водорастворимых полисахаридов из надземной части фиалки Патрэна, в его составе идентифицированы: рамноза, ксилоза, сорбит, глюкоза, фруктоза, галактоза, манноза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Выделение и анализ природных биологически активных веществ / Под ред. Е.Е. Сироткиной. — Томск. Изд. ТГУ 1987. — 184 с.
2. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа / МЗ СССР. — 11-е изд., — М.: Медицина, 1990. — 398 с.
3. Кирхнер Ю.Г. Тонкослойная хроматография. — М.: Мир, 1981. — Т.1. — С. 478-527.
4. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их хи-
мический состав и использование / Под ред. А.А. Федорова. — Л.: Наука, 1986. — С. 20-29.
5. Степаненко Б.Н. Химия и биохимия углеводов: Полисахариды. М., 1978.
6. Флора Сибири: Определитель / Под ред. ГА. Пешковой. — Новосибирск: Наука, 1996. — Т. 10. — С. 82-101.
7. Хроматография на бумаге / Под ред. И.М. Хайса, К. Мацека. М., 1962. — 851 с.
Адрес для переписки: 664079, Иркутск, м/р Юбилейный, 100; тел. (3952)46-53-26. Альберт Михайлович Мартынов — к.м.н., доцент, Тамара Дарижаповна Даргаева.
© УБЕЕВА И.П., ГОНЧИКОВА С.Ч., ВЕРЛАН Н.В., НИКОЛАЕВ С.М. — 2009
ИММУНООПОСРЕДОВАННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ АПОПТОЗА ГЕПАТОЦИТОВ ПРИ РАЗЛИЧНЫХ ПОРАЖЕНИЯХ ПЕЧЕНИ И ВОЗМОЖНОСТИ ЕЕ ФИТОКОРРЕКЦИИ
И.П. Убеева1, С.Ч. Гончикова1, Н.В. Верлан1, С.М. Николаев2 ^Иркутский государственный институт усовершенствования врачей, ректор — д.м.н., проф. В.В. Шпрах; кафедра клинической фармакологии и фитотерапии, зав. — д.м.н., проф. Н.В. Верлан) 2Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, директор — д.б.н., проф., Д.Л. Убугунов)
Резюме. В статье систематизированы результаты изучения иммунно-опосредованных механизмов регуляции апоптоза гепатоцитов при различных поражениях печени. Обобщены многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие о роли иммунных механизмов запуска апоптоза с участием Т-цитотоксических лимфоцитов, цитокинов. А также рассмотрены вопросы перспектив использования фитотерапии с целью коррекции дизре-гуляции процессов апоптоза.
Ключевые слова: фитотерапия, полифенолы, флавоноиды, полисахариды, апоптоз, цитокины, лимфоциты, ге-патоциты, вирусные гепатиты, интефероны, интерлейкины.
IMMUNE MEDIATED APOPTOSIS REGULATION OF HEPATOCYTES IN DIFFERENT DAMAGES OF THE LIVER AND POSSIBILITIS OF ITS PHYTOCORRECTION
I.P. Ubeeva1, S.Ch. Gonchicova1, N.V. Verlan1, S.M. Nikolaev2 (Irkutsk State Institute for Postgraduate Medical Education)
Summary. Results of the study of immune-mediated mechanism of apoptosis regulation of hepatocytes in various defeats of liver is systematized in this article. Are generalised multiple expierence data, which indicate the role of the immune mechanisms of the beginning of apoptosis with participation of Т-cytotoxic lymphocytes, cytokines. Also, some questions of perspectives of phytotherapy usage were under review with the aim of correction of disregulation of apoptosis processes.
Key words: phytotherapy, polyphenol, flavonoides, polysaccharides, apoptosis, cytokines, lymphocytes, hepatocytes, viral hepatitis, interferones.
В настоящее время отмечается неуклонный рост заболеваемости вирусными гепатитами, повышение часто-
ты их осложнений [24]. Патология печени является не только медицинской, но и актуальной социальноэкономической проблемой, которой уделено значительное внимание в Национальном проекте «Здоровье».
В результате многочисленных исследований выявлены основные патогенетические механизмы повреж-
дения печени при вирусных гепатитах. Наибольший интерес исследователей в последние годы проявляется в отношении апоптоза, выявляемого при вирусных гепатитах В и С, поражениях печени другой природы, механизм развития которого остается до конца невыясненным. Предполагается решающая роль иммуноо-
