CC BY
63
УДК 615.322:582.681.26]:581.192
А. М. Мартынов (к.фарм.н., доц.) 1, Т. Д. Даргаева (гл.науч.сотр., д.фарм.н., проф.) 2,
А. М. Собенин (н.с.) 3
Изучение химического состава
U 1 U
надземной части фиалки сахалинской
1 Иркутский государственный институт усовершенствования врачей, кафедра фармации 664041, г. Иркутск, м-он Юбилейный, 100, тел. (395)2465386, е-mail: [email protected] 2Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений,
отдел стандартизации и сертификации г. Москва, 117216, г. Москва, ул. ул. Грина, д. 7, тел. (495) 3827377, факс 8 (495) 3385509 3Иркутский институт физиологии и биохимии растений СО РАН, лаборатория физико-химических методов исследования 664041, г. Иркутск, ул. Лермонтова, 132, (395) 2424551
A. M. Martynov 1, T. D. Dargaeva 2, A. M. Sobenin 3
Chemical composition of overground part of Sakhalin violet
1 Irkutsk State Institute of Physicians Advance, Faculty of pharmacy
100, Yubileinyi district, 664041, Irkutsk, Russia; ph. (395) 2465386, е-mail: [email protected]
2 All-Russian Research Institute of Medicinal and Aromatic Plants,
7, Grin Str, 117216, Moscow, Russia; ph. (495) 3827377, fax: (495) 3385509
3 Irkutsk Institute of Physiology and Biochemistry of Plants SB RAS,
Laboratory of physical and chemical methods of research 132, Lermontova Str., 664041, Irkutsk, Russia; ph. (395) 2424551
Исследован состав фенольных соединений травы фиалки сахалинской (Viola sacchalinensis Boiss.) с использованием ТСХ, ВЭЖХ, бумажной хроматографии и других методов физико-химического анализа. Установлено наличие 30 соединений фенольного характера, относящихся в основном по структуре к флавоноидам, фе-нолкарбоновым кислотам и кумаринам. Из них 11 соединений идентифицированы: лютеолин-7-гликозид, кемпферол, витексин, кверцетин, галловая, хлорогеновая, кофейная, цикориевая, неохлорогеновая кислоты, умбеллиферон и кумарин. В надземной части растения обнаружены и идентифицированы 15 свободных аминокислот, установлено их количественное соотношение.
Ключевые слова: фенокарбоновые кислоты; фиалка сахалинская; флавоноиды; кумарины.
The structure of phenol compounds of the violet Sakhalin grass (Viola sacchalinensis Boiss.) was investigated using TLC, HPLC, paper chromatography and other physical and chemical methods. As a result, thirty phenol compounds, which have basically the structures of flavonoids, phenol carbonic acids and coumarins were defined. Eleven of them were identified; they are ljuteolin-7-glikozid, kaempferol, vitexin, quercetin, gallic, chlorogenic, coffee, chicoric, newchlorogenic acids, umbellipheron and coumarin. Fifteen free amino acids were found in the overground part of the plant. Their quantity proportions were measured.
Key words: coumarins; phenol carbonic acids; flavonoids; violet Sakhalin
Фиалка сахалинская Viola sacchalinensis Boiss. семейства фиалковых (Violaceae) — представляет собой многолетнее травянистое
Дата поступления 18.02.10
растение, достаточно широко распространенное в Сибири, по всему российскому Дальнему Востоку. Общий ареал — Монголия, Китай, Корея и Япония 1.
Этот вид издавна применяется в качестве противовоспалительного средства, в китайской
традиционной медицине используется при воспалениях лимфатических узлов 2 3.
Использование этого растительного объекта в народной медицине и неизученность химического состава послужили основаниями для его исследования.
Цель нашего исследования заключалась в изучении фенольных соединений и аминокислотного состава надземной части фиалки сахалинской.
Экспериментальная часть
Объектом исследования служила воздушно-сухая надземная часть растения, заготовленная во время цветения в 2006—2008 гг. в Иркутском сельском районе. Состав полифе-нольных соединений надземной части фиалки сахалинской изучался с использованием химических и физико-химических методов (ТСХ, БХ, ВЭЖХ, УФ-спектроскопия).
Выделяли фенольные соединения из воздушно-сухого сырья, измельченного и проходящего сквозь сито диаметром отверстий 2 мм. Экстракцию проводили 70%-м этиловым спиртом, в соотношении 1 : 5 при нагревании на кипящей водяной бане с обратным холодильником до полного истощения сырья. Полученные извлечения объединяли и упаривали под вакуумом на роторном испарителе до полного удаления спирта этилового. Водное извлечение охлаждали и для отделения лиофобных веществ (смол и хлорофилла) фильтровали. Фильтрат последовательно экстрагировали органическими растворителями — эфиром, этилацетатом. Водный остаток спирто-водного извлечения многократно (5—6 раз) обрабатывали равным объемом эфира, отделяя эфирный слой в делительной воронке. Полученные эфирные извлечения объединяли, затем упаривали, получили, таким образом, эфирную фракцию. Водный остаток, оставшийся после экстрагирования эфиром, нагревали на водяной бане для удаления эфира. После охлаждения водный остаток экстрагировали этилацета-том. Этилацетатные извлечения объединяли, упаривали и получили этилацетатную фракцию.
В дальнейшем проводили исследования эфирной, этилацетатной фракций и водного остатка на наличие фенольных соединений с использованием качественных реакций и хроматографических методов 4' 5.
Присутствие кумаринов в эфирной фракции устанавливали с помощью качественных реакций и методом тонкослойной хроматогра-
фии на пластинках «Silufol» в системе растворителей н-гексан — бензол — метиловый спирт (5 : 4 : 1). Детектирование зон адсорбции проводили обработкой хроматограмм 10%-м раствором калия гидроксида в спирте метиловом и высушиванием в сушильном шкафу при 110 оС 2 мин и последующим просматриванием в УФ-свете, затем обработкой свежеприготовленным диазореактивом 6.
Флавоноиды определяли в этилацетатном извлечении и водном остатке с использованием качественных реакций: цианидиновой пробы, с 10%-м раствором натрия гидроксида и с 2%-м раствором алюминия хлорида. Кроме того, использован метод бумажной хроматографии с применением систем растворителей: н-бута-нол-уксусная кислота-вода (4 : 1 : 5), 15 и 30%-й раствор уксусной кислоты. Для проявления хроматограмм применяли специальные реактивы — 10%-й раствор натрия гидроксида, пары аммиака 4. Хроматограммы просматривались в видимом и УФ-свете до и после обработки хромогенными реактивами.
Фенолкарбоновые кислоты определяли в этилацетатной фракции методом бумажной хроматографии после обработки парами аммиака, раствором железа (III) хлорида, реактивом Шмидта.
Исследование состава фенольных соединений проводили методом ВЭЖХ на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «GILSTON» (Франция) с последующей компьютерной обработкой результатов с помощью программы «Multichrom for Windows». В качестве неподвижной фазы использовалась металлическая колонка размером 4.6 х 250 мм PLATINUM С 18 100, с величиной частиц 5 микрон, подвижной фазой служила система: метанол—вода—фосфорная кислота, концентрированная в соотношении 400 : 600 : 5. Анализ проводили при комнатной температуре со скоростью подачи элюента 0.5 мл/мин. Продолжительность анализа составляла 70 мин. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора «GILSTON» UV/VIS модель 151 при длине волны 254 нм.
Для изучения состава траву фиалки сахалинской измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм (ГОСТ 214-83). 5.0 г сырья помещали в колбу объемом 250 мл, прибавляли 50 мл 70%-го спирта этилового, присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 2 ч с момента закипания спирто-водной смеси в колбе. Смесь охлажда-
ли, фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу объемом 100 мл и доводили спиртом этиловым 70%-м до метки, перемешивали и фильтровали (исследуемый раствор). Одновременно готовили серию 0.05%-х растворов сравнения в 70%-м спирте этиловом флаво-ноидов, фенолкарбоновых кислот и кумари-нов. Объем вводимой исследуемой пробы и растворов сравнения составлял 20 мкл. Идентификацию разделяемых веществ проводили путем сопоставления времени удерживания компонентов смеси со временем удерживания стандартных образцов. Количественное определение идентифицированных веществ в исследуемом образце проводили по площади пика, используя метод внутренней нормализации.
Качественное обнаружение аминокислот проводили в водных извлечениях с помощью нингидриновой пробы. Для исследования брали 3 г воздушно-сухого измельченного сырья, заливали 30 мл дистиллированной воды и нагревали с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение часа. Извлечение фильтровали, сырье повторно исчерпывающе экстрагировали. Все водные извлечения объединяли и упаривали на роторном испарителе под вакуумом до 25 мл и использовали для проведения качественных реакций и хроматог-рафического анализа.
Для определения аминокислот смешивали равные объемы испытуемого извлечения и 0.2%-ного свежеприготовленного раствора нингидрина и нагревали. При охлаждении полученная смесь изменяла окраску до красно-фиолетового цвета, что предполагает наличие аминокислот. Хроматографические исследования проводились на пластинках «811и£о1» в системе растворителей: изопропанол—вода (7 :
3), этилацетат—пиридин—уксусная кислота-вода (30 : 20 : 6 : 11) в качестве «свидетелей» использовали достоверные образцы аминокислот фирмы «Sigma» 6. Хроматограммы высушивали и обрабатывали 0.2%-ным спиртовым раствором нингидрина, несколько минут нагревали в сушильном шкафу при температуре 100-105 оС, аминокислоты проявлялись в виде красно-бурых и красно-фиолетовых пятен.
Разделение аминокислот осуществляли на аминокислотном анализаторе (Amino Acid Analyzer ААА 339, производство Чехия). Для этого 3 г сырья (точная навеска) исчерпывающе экстрагировали горячей водой, извлечение фильтровали, объем доводили до 30 мл. Для определения свободных аминокислот брали 10 мл полученного извлечения, упаривали в вакууме досуха. Упаренный остаток растворяли в 5 мл натриево-цитратного буфера (pH 2.2), объем доводили до 10 мл. Нераство-рившуюся часть отделяли на центрифуге в течение 30 мин со скоростью 20 тыс. об/мин. Анализ аминокислот проводили в Li+ _ цикле. В качестве стандарта использовали аминокислоты фирмы «Sigma». Для количественной оценки определяли площади пиков идентифицированных аминокислот. Расчет проводили в наномолях и нанограммах в аликвотной части, непосредственно использованной для анализа. Затем было рассчитано количественное содержание обнаруженных свободных аминокислот в мг/г.
Результаты и их обсуждение
В результате проведенного хроматографи-ческого исследования установлено в траве фиалки сахалинской 5 веществ, относящиеся к фенолкарбоновым кислотам, 4 вещества
Таблица 1
Характеристика фенольных соединений, выделенных из надземной части фиалки сахалинской
№ Вещество Время удерживания, сек Количественное содержания в смеси, %
1. Умбеллиферон 337.3 6.2
2. Галловая кислота 368.8 10.99
3. Хлорогеновая кислота 394.5 13.11
4. Кофейная кислота 404.7 14.66
5. Цикориевая кислота 588.9 19.57
6. Неохлорогеновая кислота 866.5 6.03
7. Лютеолин-7-гликозид 1070 19.14
8. Кемпферол 1435 0.12
9. Витексин 1596 2.59
10. Кумарин 2324 4.59
11. Кверцетин 3839 1.86
флавоноидной структуры и 2 соединения ку-мариновой природы.
Всего методом ВЭЖХ обнаружено 30 веществ фенольной природы, в основном представленных фенолкарбоновыми кислотами и флавоноидами. Идентификацию фенольных соединений проводили по времени удерживания растворов стандартных образцов. Таким образом, идентифицировали 11 соединений: галловую, хлорогеновую, кофейную, цикорие-вую, неохлорогеновую кислоты, лютеолин-7-гликозид, кемпферол, витексин, кверцетин, умбеллиферон и кумарин. Все эти соединения в растении обнаружены впервые. Установлено, что преобладающей среди фенолокислот является цикориевая и кофейная кислоты, из флавоноидных соединений — лютеолин-7-гли-козид, из группы кумаринов — умбеллиферон. Результаты приведены в таблице.
Исследование аминокислотного состава осуществлялось методом тонкослойной хроматографии, а также с использованием аминокислотного анализатора. В результате иденти-
фицированы 15 свободных аминокислот (4 из них незаменимые), определено их количественное содержание. Общее содержание аминокислот составляет 7.01 мг/г, преобладают среди них глицин и орнитин.
Литература
1. Флора Сибири: Определитель / Под ред. Г. А. Пешковой.— Новосибирск, 1996.— Т. 10.— 254 с.
2. Растительные ресурсы СССР. Цветковые растения, их химический состав и использование. Семейства Равотасвав-ТкутвЫвасвав.- Л., 1986.- 336 с.
3. Растительные ресурсы России и сопредельных государств: Цветковые растения, их химический состав и использование. Ч. 1. Семейства Ьусоро^асеае-ЕрЬе^асеае. Ч. 2. Дополнения к 1-7 т.- СПб., 1996.- 571 с.
4. Выделение и анализ природных биологически активных веществ / Под ред. Е. Е. Сиротки-ной.,- Томск: Изд. ТГУ.- 1987.- 185 с.
5. Хроматография на бумаге / Под ред. И. М. Хайса, К. Мацека.- М., 1962.- 851 с.
6. Кирхнер Ю. Г. Тонкослойная хроматография.-М.: Мир, 1981.- Т 1.- 616 с.
