CC BY
82
Химия растительного сырья. 2010. №3. С. 91-94.
УДК 615.322
ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА ЛИХНИСА ХАЛЦЕДОНСКОГО, КУЛЬТИВИРУЕМОГО В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ. СООБЩЕНИЕ I. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ЭКДИСТЕРОИДОВ
© И.М. Смолякова1, С.Н. Авдеенко2, Г.И. Калинкина1, Л.Н. Зибарева2
1 Сибирский государственный медицинский университет, Московский тракт,
2/7, Томск, 634050, (Россия) e-mail: [email protected]
2Томский государственный университет, пр. Ленина, 36, Томск, 634050,
(Россия)
На основании данных литературы и экспериментальных исследований для получения лекарственных препаратов, обладающих гемореологическим действием, предложена трава лихниса халцедонского, культивируемого в Западной Сибири. С целью разработки методов стандартизации данного сырья изучен его химический состав. Основными биологически активными веществами (БАВ) лихниса халцедонского являются экдистероиды, фенольные соединения: флаво-ноиды, гидроксикоричные кислоты, кумарины; полисахариды, сапонины и витамины. В данном сообщении представлены результаты изучения качественного состава и количественного определения БАВ надземной части лихниса халцедонского методами хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента.
Ключевые слова: экдистероиды, флавоноиды, фенольные соединения, хроматографическое исследование, лихнис халцедонский, Caryophyllaceae.
Введение
Интерес к поиску оригинальных лекарственных средств, обладающих гемореологической активностью, обусловлен широким распространением сердечно-сосудистых заболеваний. Течение таких патологий осложняет синдром повышенной вязкости крови - комплекс изменений гемореологических параметров, который, в свою очередь, негативно влияет на протекание ишемической болезни сердца и инфаркта миокарда, артериальной гипертензии, нарушения мозгового кровообращения и инсульта. Для коррекции гемореологических расстройств используются, как правило, препараты синтетического происхождения.
Согласно исследованиям, проведенным в лаборатории фармакологии кровообращения НИИ фармакологии ТНЦ РАМН (Томск), установлено, что экстракт лихниса халцедонского оказывает влияние на реологические показатели крови [1].
Так как природные запасы лихниса ограничены, сотрудниками Сибирского ботанического сада Томского государственного университета разработаны приемы культивирования лихниса халцедонского в условиях Западной Сибири и доказано, что растение создает хорошую биомассу и не уступает дикорастущему по содержанию основных действующих веществ [2]. Однако для внедрения данного растения в медицинскую практику необходимо, прежде всего, на основании химического исследования предложить методики стандартизации сырья, которые могут быть использованы для разработки нормативной документации.
Экспериментальная часть
Для исследования химического состава использовали надземную часть лихниса халцедонского (Lychnis chalcedonica L., сем. Caryophyllaceae), культивируемого на экспериментальном участке Сибирского ботанического сада Томского государственного университета.
Из образцов сырья лихниса халцедонского получали водные, водно-спиртовые извлечения 40 и 70%-ным этиловым спиртом на кипящей водяной бане с обратным холодильником.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Количественное содержание биологически активных веществ в лихнисе определяли: экдистероидов -хроматоспектрофотометрическим методом [3]; сумму фенольных соединений - перманганатометрическим методом [4]; флавоноидов - спектрофотометрическим методом [4,5]; гидроксикоричных кислот - прямым спектрофотометрированием [6]; кумариное - фотоколориметрически [7]; сумму сапонинов, полисахаридов иих фракций - гравиметрическим методом [8, 9]; аскорбиновую кислоту - титриметрически [4]; кароти-ноидов и витамина К - спектрофотометрически [10].
Качественный состав фенольных соединений и экдистероидов предварительно устанавливали методами хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента в разных системах растворителей [3, 11, 12]. Для хроматографии использовали бумагу марки «М» Санкт-Петербургской фабрики №2 им. Володарского; пластины «81Мо1 иУ-254» (КауаИег) размером 7*15.
Для изучения фенольных соединений использовали системы растворителей: 1-е направление - н-бутанол - уксусная кислота - вода (4 : 1 : 2); 2-е направление - 15%-ный раствор уксусной кислоты. На хроматограмме фенольные соединения обнаруживали по характерному свечению в УФ-свете при длине волны 365 нм до и после обработки хроматограммы парами аммиака и спиртовым раствором алюминия хлорида.
Кислотный гидролиз флавоновых гликозидов проводили путем добавления в водно-спиртовое извлечение 8% кислоты хлористоводородной с последующим нагреванием на кипящей водяной бане; для гидролиза С-гликозидов использовали смесь Килиани (смесь концентрированных хлористоводородной и уксусной кислот). Ход гидролиза контролировали с помощью хроматографии на бумаге в системе растворителей (н-бутанол - уксусная кислота - вода, 4 : 1 : 2 соответственно) и системе Форесталя (уксусная кислота - хлористоводородная кислота - вода, 30 : 3 : 10 соответственно).
Гидроксикоричные кислоты исследовали методом хроматографии на бумаге в 2% уксусной кислоте восходящим способом [6]. На хроматограмме гидроксикоричные кислоты обнаруживали по характерному свечению в УФ-свете при длине волны 360 нм до и после обработки хроматограммы гидроксидом натрия и реактивом Паули (диазотированная сульфаниловая кислота).
Присутствие экдистероидов в надземной части лихниса халцедонского обнаруживали с помощью хроматографии на пластинке «БйиЮ иУ-254» в системе растворителей хлороформ - метанол - ацетон (5 : 3 : 1). Пятна экдистероидов обнаруживали в УФ-свете при длине волны 245 нм, а также в видимом свете после опрыскивания пластинки 3% раствором ванилина в этиловом спирте с добавлением серной кислоты и нагревания в течение 2-3 мин в сушильном шкафу при температуре 100-105 °С до появления характерных пятен.
Обсуждениерезультатов
С использованием общепринятых методов анализа проведено исследование надземной части лихниса на присутствие БАВ. Данные таблицы 1 показывают, что биологически активный комплекс лихниса халцедонского представлен экдистероидами, фенольными соединениями, полисахаридами, сапонинами и витаминами. Наиболее значимыми в лихнисе халцедонском являются эвдистероиды и флавоноиды, которые, по данным фармакологи-
Таблица 1. Содержание биологически актив ных веществ в надземной части лихниса халцедонского, культивируемого в Западной Сибири
Биологически активные вещества Содержание, % от массы а.с.с.
Фенольные соединения, в том 0,72+0,04
числе:
- флавоноиды 0,54+0,03
- гидроксикоричные кислоты 0,10+0,00
- кумарины 0,08+0,01
Экдистероиды 0,65+0,03
Сапонины 8,92±0,45
Полисахариды, в том числе: 11,80±0,52
- водорастворимые 2,80±0,15
- пектиновые вещества 1,90±0,06
- гемицеллюлозы А и В 7,10±0,35
Каротиноиды, мг% 5,19+0,25
Витамин К, мг% 1,50+0,08
Витамин С, мг% 105,2+5,26
ческого исследования, могут обусловливать гемореоло-гические свойства данного растения [1].
В связи с этим представляет интерес химическое исследование фенольных соединений и экдистероидов.
Исследование фенольных соединений проводили методом хроматографии на бумаге. Детектируя обнаруженные вещества в УФ- и видимом свете после проявления различными реактивами установили, что в надземной части лихниса халцедонского достоверно присутствуют эвдистероиды, флавоноиды в гликозидированной форме и гидроксикоричные кислоты. На хроматограмме (рис. 1) обнаружили вещества с голубой, сине-фиолетовой и темно-коричневой флюоресценцией. После обработки хроматограммы парами аммиака и 2% спиртовым раствором алюминия хлорида темно-коричневые пятна приобрели желто-зеленую окраску, что характерно для флавоновых гликозидов. Пятна с голубой и сине-фиолетовой флюоресценцией ориентировочно относили к гидроксикорич-ным кислотам и кумаринам.
При исследовании природы флавоновых гликозидов столкнулись с фактом, что обычный кислотный гидролиз приводит к образованию только одного агликона, который по хроматографическому поведению соответствует известному веществу лютеолину (табл. 2). Хроматографическое исследование исходного гли-козида с известным веществом показало, что он соответствует лютеолин-7-глюкозиду. После применения жесткого гидролиза остальные гликозиды лихниса халцедонского образовали флавоновые агликоны апиге-нин и лютеолин (табл. 2). Это позволило сделать вывод, что флавоноиды растения представлены в основном С-гликозидами. Сделанное нами заключение совпадает с данными литературы, по которым флавоноиды лихниса халцедонского, произрастающего в европейской части России, представлены С-моногликозидами апигенина и лютеолина, а также С-дигликозидом апигенина - витексином [13].
При исследовании гидроксикоричных кислот на хроматограмме в УФ-свете отмечали несколько пятен голубой, голубовато-зеленой и голубовато-фиолетовой флюоресценции, которые после проявления хроматограммы гидроксидом натрия и реактивом Паули (диазотированная сульфаниловая кислота) приобретали различную окраску в видимом свете (рис. 2). По хроматографическому поведению в сравнении с известными веществами и данными литературы нами идентифицированы кофейная, и-кумаровая, синаповая, феруловая и хлорогеновая кислоты. Характеристика кислот представлена в таблице 3.
Таблица 2. Хроматографическая характеристика флавоноидов лихниса халцедонского
До гидролиза После гидролиза
Окраска пятен Окраска пятен
Вещество УФ-свет Видимый свет, хлорид алюминия Вещество Яґсистема Форесталя УФ-свет Видимый свет, хлорид алюминия
Апигенин-7- глюкозид коричневая желто-зеленая апигенин 0,83 темно- коричневая желтая
Лютеолин-7- глюкозид коричневая желто-зеленая лютеолин 0,80 темно- коричневая желтая
С-дигликозид 1 (витексин) коричневая желто-зеленая апигенин 0,83 темно- коричневая желтая
С-дигликозид 2 коричневая желто-зеленая лютеолин 0,80 темно- коричневая желтая
Рис. 1. Схемадвумернойхроматограммы водноспиртового извлечения лихниса халцедонского. Система растворителей: 1-е направление - БУВ (4 : 1 : 2); 2-е направление - 15%-ная уксусная кислота. О - экдистероид; С) - флавоноиды; О - гидроксикоричные кислоты, кумарины
Рис. 2. Схема хроматограммы водно-спиртового извлечения лихниса халцедонского. Система растворителей: 2%-ная уксусная кислота.
1 - и-кумаровая кислота; 2 - хлорогеновая кислота; 3 - синаповая кислота; 4 - феруловая кислота; 5 - кофейная кислота; 6 - спиртовый экстракт лихниса халцедонского
Таблица 3. Хроматографическая характеристика гидроксикоричных кислот лихниса халцедонского
Вещество Значение Rf Окраска пятен
УФ-свет Видимый свет, реактив Паули
Кофейная кислота 0,2б светло-голубая коричневая
Феруловая кислота 0,32 голубовато-фиолетовая фиолетовая
Синаповая кислота 0,51 голубовато-зеленая голубовато-фиолетовая
Хлорогеновая кислота 0,70 голубая желто-коричневая
и-кумаровая кислота 0,74 голубовато-фиолетовая красно-коричневая
Таблица 4. Хроматографическая характеристика некоторых экдистероидов
Вещество Значение Rf Окраска пятен
УФ-свет Видимый свет, реактив
Экдистерон 0,3б-0,37 голубая желто-зеленая
Полиподин 0,3б-0,37 голубая желто-зеленая
При исследовании экдистероидов методом тонкослойной хроматографии на хроматограмме в УФ-свете отмечали голубое пятно (Rf 0,36-0,37) на уровне пятен экдистерона и полиподина В, которое после опрыскивания реактивом и нагревания приобретало в видимом свете желто-зеленую окраску.
Как показано в таблице 4, эвдистерон и полиподин В по хроматографическому поведению в тонком слое практически не различаются. Поэтому можно предположить, что отмеченное на хроматограмме пятно экди-стероида лихниса халцедонского представляет собой смесь не менее двух веществ, идентификация которых возможна только при их выделении или исследовании фракции экдистероидов методом ВЭЖХ-МС.
Выводы
В результате проведенных исследований с определенной степенью достоверности можно утверждать, что лихнис халцедонский, культивируемый в Западной Сибири, содержит экдистероиды, флавоноиды - С-гликозидированные производные апигенина и лютеолина, лютеолин-7-глюкозид, а также гидроксикоричные кислоты кофейную, и-кумаровую, синаповую, феруловую и хлорогеновую. Для подтверждения и уточнения полученных результатов далее проведено исследование состава БАВ лихниса методом ВЭЖХ-МС.
Список литературы
1. Плотников М.Б., Алиев О.И., Васильев А.С., Маслов М.Ю., Зибарева Л.Н., Дмитрук С.Е. , Калинкина Г.И. Ге-мореологические эффекты экстрактов Lychnis chalcedonica L. // Экспериментальная и клиническая фармакология. 2000. Т. 63. №2. С. 54-56.
2. Свиридова Т.П., Зибарева Л.Н. Биоморфологические особенности и химический состав Lychnis chalcedonica L. в природе и культуре на юге Томской области // Бюл. Гл. бот. сада. 1989. Вып. 153. С. 24-28.
3. Якубова М.Р., Генкина Г.Л., Шакиров Т.Т., Абубакиров Н.К. Хроматоспектрофотометрический метод определения экдистерона в растительном сырье // Химия природных соединений. 1978. №6. С. 737-740.
4. Государственная фармакопея СССР. Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / М3 СССР. 11-е изд., доп. М., 1989. 400 с.
5. Андреева В.Ю., Калинкина Г.И. Разработка методики количественного определения флавоноидов в манжетке обыкновенной Alchemilla vulgaris L.S.L. // Химия растительного сырья. 2000. №1. С. 85-88.
6. Бандюкова В.А. Фенолокислоты растений, их эфиры и гликозиды // Химия природных соединений. 1983. Вып. 3. С. 263-272.
7. Прокопенко О.П., Тарасенко О.О. Колориметрический метод количественного определения кумаринов // Фармацевт. журнал. 1962. №6. С. 18-22.
8. Гринкевич Н.И., Сафронич Л.А. Химический анализ лекарственных растений. М., 1983. 176 с.
9. Методы исследования углеводов / под ред. А.А. Харлина; пер. В.А. Несмеянова. М., 1975. 445 с.
10. Девятнин В.А. Методы химического анализа в производстве витаминов. М., 1964. 360 с.
11. Бандюкова В.А. Исследование химии флавоноидных соединений и закономерности их распределения в растениях: автореф. дис. ... д-ра биол. наук. Ереван, 1975. 41 с.
12. Бандюкова В.А. Применение цветных реакций для обнаружения флавоноидов путем хроматографии на бумаге // Растительные ресурсы. 1965. Т. 1. Вып. 4. С. 591-596.
13. Дармограй В.Н. Фармакогностическое изучение некоторых видов семейства гвоздичных и перспективы использования их в медицинской практике: автореф. дис. ... д-ра фарм. наук. Рязань, 1996. 91 с.
Поступило в редакцию 2 июля 2009 г.
