CC BY
55
Химия растительного сырья. 2010. №3. С. 95-102.
УДК 615.322
ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА ЛИХНИСА ХАЛЦЕДОНСКОГО, КУЛЬТИВИРУЕМОГО В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ. СООБЩЕНИЕ II. ВЭЖ-ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ И ЭКДИСТЕРОИДОВ ЛИХНИСА ХАЛЦЕДОНСКОГО, КУЛЬТИВИРУЕМОГО В ЗАПАДНОЙ СИБИРИ
© И.М. Смолякова1, С.Н. Авдеенко2, Г.И. Калинкина1, М.С. Юсубов1, Л.Н. Зибарева2
1 Сибирский государственный медицинский университет, Московский тракт,
2/7, Томск, 634050, (Россия) e-mail: Iren-Sm@mail.ru
2Томский государственный университет, пр. Ленина, 36, Томск, 634050,
(Россия)
Методом ВЭЖХ-МС с последовательным УФ-детекгированием изучен качественный состав флавоноидов, гидро-ксикоричных кислот и экдистероидов надземной части лихниса халцедонского, культивируемого в Западной Сибири, Идентификация фенольных соединений и экдистероидов проведена по УФ- и масс-спектрам путем сравнения с базой данных известных компонентов, Установлено дополнительно к предыдущим исследованиям наличие кофейной кислоты (3,4-дигидроксикоричная кислота), кумаровой кислоты (и-гидроксикоричная кислота), виценина (8-C-chh-P-D-глюкопиранозил, C-C-P-D-глюкопиранозид апигенина), неовитексина (8-С-син-а-Б-глюкопиранозид апигенина), поли-подина В и неидентифицированного производного экдистероидов (гликозидированная или этерифицированная форма), Ключевые слова: экдистероиды, флавоноиды, фенольные соединения, хроматографическое исследование, лихнис халцедонский, Caryophyllaceae, высокоэффективная жидкостная хроматография,
Введение
Экстракт лихниса халцедонского (Lychnis chalcedonica L., сем. Caryophyllaceae), полученный из надземной части растения, культивируемого в Западной Сибири, его фракции, а также выделенные из них экдисте-рон и сумма флавоноидов проявляют гемореологическую активность и являются перспективным источником новых лекарственных препаратов для лечения сердечно-сосудистых заболеваний [1].
Нами проводится исследование химического состава надземной части лихниса халцедонского как источника ценных биологически активных веществ - фитоэкдистероидов и фенольных соединений [2]. Наряду с экдистероидами, наиболее значимыми в лихнисе халцедонском являются флавоноиды, которые, по данным фармакологического исследования, могут обусловливать гемореологические свойства данного растения.
С использованием качественных реакций, а также методов хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента в надземной части лихниса халцедонского установлено наличие экдистероидов полиподина В и эвдистерона; фенольных соединений: С-гликозидированных производных апигенина и лютеолина, лютеолин-7-глюкозида, а также гидроксикоричных кислот (кофейной, и-кумаровой, синаповой, феруловой и хлорогеновой).
В связи с тем, что возможности идентификации веществ данными методами ограничены, нами проведено более детальное химическое исследование фенольных соединений и экдистероидов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектроскопии.
* Автор, с которым следует вести переписку,
Экспериментальная часть
Для исследования использовали надземную часть лихниса халцедонского, культивируемого на экспериментальном участке Сибирского ботанического сада Томского государственного университета [3].
Из надземной части лихниса халцедонского получали водно-спиртовый экстракт, из которого методом избирательной экстракции извлекали хлороформную, этилацетатную и бутанольную фракции. Этилацетат-ную и бутанольную фракции исследовали с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии.
Хроматографический анализ проводили на жидкостном хроматографе с диодно-матричным и масс-селективным детекторами («Agilent 1100 Series LC/MSD»). Детектирование и запись спектров поглощения проводили в интересующем нас диапазоне длин волн (230-500 нм). Для масс-селективного детектора (модель G1946C) использовали метод химической ионизации при атмосферном давлении (APCI). Проводили сканирование положительных (positive scan) и отрицательных ионов (negative scan) с соотношением m/z от 100 до 1200 (точность измерения при этом составляла 0,1). Детектирование выходящего из колонки элюента проводили одновременно надвух полосах поглощения: 270-310 нм (в этом диапазоне видны все ароматические соединения) и 320-360 нм (область более специфична для природных соединений типа ксантонов, фла-вонов и кумаринов). Во всех случаях поглощение фиксировалось относительно контрольной полосы 800900 нм. Разделение проводили на колонке с обращенной фазой «Zorbax Rx-C18», 4,6*150 мм (наполнитель с диаметром частиц 5 мкм, размер пор 80 А). Элюент - смесь 2,3% НСООН - МеОН (линейный градиент от 20 до 90% МеОН с 5-й до 10-й минуты), 1 мл/мин.
В качестве основных критериев при выборе предполагаемой структуры использовали время удерживания в сравнении с известными образцами, УФ-спектры и масс-спектры соответствующих пиков на ВЭЖХ, а также базы данных и обзорные статьи по основным спектральным и физико-химическим характеристикам природных соединений [4-7].
Обсуждениерезультатов
По данным ВЭЖХ этилацетатной фракции сделано заключение о присутствии в растении флавонои-дов, экдистероидов и фенолкарбоновых кислот (рис. 1, 2).
На хроматограмме этилацетатной фракции экстракта лихниса халцедонского пик со временем удержива-ния 9,3 мин (УФ-спектр имеет два основных максимума поглощения: 270 и 330 нм), имеющий в масс-спектре интенсивный пик с m/z=565,2 [М+Н]+ в режиме ХИ APCI, Pos. Scan. (рис. 3) и с m/z=563,2 [М-Н]+ в режиме ХИ APCI, Neg. Scan. (рис. 4), идентифицировали как С-дигликозид апигенина - виценин. В качестве сахарных компонентов в данном случае выступают глюкоза и арабиноза.
Рис. 1. Хроматограмма этилацетатной фракции экстракта лихниса халцедонского с масс-селективным детектором в режиме APCI Neg. Scan.
Рис. 2. Хроматограмма этилацетатной фракции экстракта лихниса халцедонского с масс-селективным детектором в режиме APCI Pos. Scan.
*MSD1 SPC, time=9.353 of D:\RESULTS\TOMSK2\ETAC4L-2.D APCI, Pos, Scan, Frag: 7Q
Рис. 3. Масс-спектр пика на хроматограмме со временем удерживания 9,3 мин в режиме ХИ APCI, Pos. Scan.
*MSD1 SPC, time=9.333 of D:\RESULTS\TOMSK2\ETAC4L-1.D APCI, Neg, Scan, Frag: 7Q
Рис. 4. Масс-спектр пика на хроматограмме со временем удерживания 9,3 мин в режиме ХИ APCI, Neg. Scan.
*MSD1 SPC, time=9.62Q of D:\RESULTS\TOMSK2\ETAC4L-2.D APCI, Pos, Scan, Frag: 7Q
100-
80-
60-
40-
20-
m/z 433.2 [M+i] OH O
+
HO
C2iH2GOiG
Exact Mass: 432,ii неовитексин
HO H
OH
Max: 96655
440
460
480
500
520
540
560
m/
Рис. 5. Масс-спектр пика на хроматограмме со временем удерживания 9,6 мин в режиме ХИ APCI, Pos. can.
Одинаковая интенсивность пиков в различных режимах сканирования указывала на наличие С-гликозидов и отсутствие О-гликозидов. Обычно при анализе О-гликозидов в режиме Neg. Scan. максимальную интенсивность имеет пик молекулярного иона [M-H]+, а минимальную - пик [Marn-H]+. В режиме Pos. Scan. максимальную интенсивность имеет пик молекулярного иона агликона [Marn+H]+, а минимальную - пик [M+H]+.
Пик со временем удерживания 9,6 мин (УФ-спектр имеет два максимума поглощения: 27 i и 335 нм), имеющий интенсивный пик с m/z=433,2 [М+Н]+ в режиме ХИ APCI, Pos. Scan. (рис. 5) и с m/z=43i,2 [М-Н]+ в режиме ХИ APCI, Neg. Scan. (рис. 6), идентифицировали как С-моногликозид апигенина - неовитексин. Кроме того, в этом спектре присутствовали другие пики с различной интенсивностью, один из которых мы отнесли к виценину (С-дигликозид апигенина): m/z=565,2 [М+Н]+ и m/z=563,2 [М-Н]+.
Пик на ВЭЖХ этилацетатной фракции экстракта лихниса со временем удерживания iG,2 мин (УФ-спектр с максимумом 25 i нм) идентифицировали с фитоэкдистероидом полиподином В.
В режиме ХИ APCI, Pos. Scan. в масс-спектре присутствует пик m/z=497,3, а в режиме ХИ APCI, Neg. Scan. m/z=495,3, соответствующие пику молекулярного иона+протон [М+Н]+ и пику молекулярного иона минус протон [М-Н]+ соответственно (рис. 7). Этот спектр дает нам в первую очередь точную информацию о величине молекулярной массы данного вещества.
Рис. 6. Масс-спектр пика на хроматограмме со временем удерживания 9,6 мин в режиме ХИ APCI, Neg. Scan.
Рис. 7. Масс-спектр пика на хроматограмме со временем удерживания iG,2 мин в режиме ХИ APCI, Pos. Scan.
Пики с m/z=479,3 и 46i,3 в режиме ХИ APCI, Pos. Scan. соответствовали фрагментам молекулярного иона после отрыва молекул воды [М-Н20]+ и [М-2Н20]+ соответственно. А пики с m/z=445,3 и 427,3 в этом же режиме - фрагментам молекулярного иона [M-CHS02]+ и [M-CHiG03]+. Такой тип фрагментации легко можно предположить по большому количеству гидроксильных групп в структуре полиподина В, связанных с вторичными и третичными атомами углерода.
Пик на ВЭЖХ этилацетатной фракции экстракта лихниса халцедонского со временем удерживания ii,4 имел два масс-спектра в разных режимах (рис. S, 9). В режиме ХИ APCI, Pos. Scan. в масс-спектре присутствовал пик m/z=Si5,3, а в режиме ХИ APCI, Neg. Scan. m/z=Si3,4, соответствующие пику молекулярного иона плюс протон [М+Н]+ и пику молекулярного иона минус протон [М-Н]+ соответственно. Эти два спектра дали нам точную информацию о величине молекулярной массы данного вещества, равную Si4. Основываясь на характере фрагментации пика молекулярного иона, отнесли это соединение к производным экдистероидов. Пики с m/z=797,3, 7S3,3 и 77i,3 в режиме ХИ APCI, Pos. Scan. соответствовали фрагментам молекулярного иона после отрыва молекулы воды [М-Н20]+ и углеродсодержащих фрагментов [М-СН4ОҐ и [М-С2Н40]+. Эти же пики фрагментов молекулярного иона присутствовали и в режиме ХИ APCI, Neg. Scan. (рис. 9).
Характер представленных на рисунках S и 9 масс-спектров позволил предположить, что эти молекулярные пики принадлежат гликозидированным или этерифицированным формам экдистероидов, расшифровка которых для нас не представлялась возможной.
Хроматограммы бутанольной фракции имели сходство с аналогичными хроматограммами этилацетатной фракции, однако на них появились пики со временами удерживания 2,6 и 3,6 мин (рис. iG, ІІ).
В масс-спектрах в режиме ХИ APCI, Pos. Scan. (рис. І2, І3) присутствовали пики с m/z=235,2 для вещества со временем удерживания 3,6 мин и с m/z=25i,2 для вещества со временем удерживания 2,5 мин соответственно.
*MSD1 SPC, time=11.480 of D:\RESULTS\TOMSK2\ETAC4L-2.D APCI, Pos, Scan, Frag: 70
! [M+H]+
[M-H2O]+
([M-OH]+)
[M-CH4O]+
Max: 2 64 42
100
80-
60
40-
20
770
780
790
800
810
820
830
840
Рис. 8. Масс-спектр пика на хроматограмме со временем удерживания 11,4 мин в режиме ХИ APCI, Pos. Scan.
Рис. 9. Масс-спектр пика на хроматограмме со временем удерживания ii,4 мин в режиме ХИ APCI, Neg. Scan.
Рис. iG. Хроматограмма бутанольной фракции экстракта лихниса халцедонского с масс-селективным детектором в режиме ХИ APCI, Neg. Scan.
Рис. ІІ. Хроматограмма бутанольной фракции экстракта лихниса халцедонского с масс-селективным детектором в режиме ХИ APCI, Pos. Scan.
*MSD1 SPC, time=3.669 of D:\RESULTS\T0MSK2\UZ0B-002.D APCI, Pos, Scan, Frag: 70
100 с і с 2. 5 2 Max: 13837
80
60
40
20 236.2 252.2 2. .4 4
240 260 280 300 320 340 360 380 400 m/z
Рис. 12. Масс-спектр пика на хроматограмме со временем удерживания 3,6 мин в режиме ХИ APCI, Pos. Scan.
*MSD1 SPC, time=2.600 of D:\RESULTS\T0MSK2\UZ0B-002.D APCI, Pos, Scan, Frag: 70
Max: 3 603 4 [=3
100 -
80
60
40
20
170
180
190
250 m/
Рис. 13. Масс-спектр пика на хроматограмме со временем удерживания 2,6 мин в режиме ХИ APCI, Pos. Scan.
Полученная информация позволила нам отнести данные вещества к производным коричной кислоты -кофейной (время удерживания 2,5 мин) и кумаровой (время удерживания 3,6).
Результаты идентификации фенольных соединений и экдистероидов лихниса халцедонского представлены в таблице.
Результаты идентификации биологически активных веществ лихниса халцедонского ВЭЖХ-МС
Время удерживания, Величина m/z Вещество
мин (молекулярная масса)
2,6 252 кофейная кислота (3,4-дигидроксикоричная кислота)
3,6 234 кумаровая кислота (и-гидроксикоричная кислота)
9,3 564 виценин (8-С-син-Р-Б-глюкопиранозил, С-С-Р-Б-глюкопиранозид апигенина)
9,6 432 неовитексин (8-С-син-а-Б-глюкопиранозид апигенина)
10,2 496 полиподин В
11,4 814 неидентифицированное производное экдистероидов (гликозиди-рованная или этерифицированная форма)
Выводы
Методами ВЭЖХ и хромато-масс-спектрометрии установлено, что флавоноиды надземной части лихниса халцедонского представлены С-гликозидированными производными апигенина - виценином (8-С-син-р-Б-глюкопиранозил, C-C-p-D-глюкопиранозид апигенина) и неовитексином (8-С-син-а-Б-глюкопиранозид апигенина), а также лютеолин-7-глюкозидом; гидроксикоричные кислоты представлены кофейной, и-кумаровой, синаповой, феруловой и хлорогеновой кислотами; из фитоэкдистероидов идентифицирован полиподин В.
Таким образом, опираясь на УФ- и масс-спектры, снятые в двух режимах химической ионизации, получена информация, позволяющая с высокой степенью достоверности предполагать структуру БАВ лихниса. Для окончательного подтверждения структуры необходим весь набор спектральных и физико-химических характеристик, которые можно получить только при выделении индивидуальных соединений.
Список литературы
1. Плотников М.Б., Зибарева Л.Н., Васильев А.С., Алиев О.И., Маслов М.Ю., ДмигрукС.Е. Гемореологическая активность экдистерона и различных фракций экстракта Lychnis chalcedonica L. in vitro // Растительные ресурсы. 2000. Т. 36. Вып. 3. С. 91-94.
2. Свиридова Т.П., Зибарева Л.Н. Lychnis chalcedonica L. - перспективное экдистероидсодержащее растение в условиях Томской области // Новые лекарственные препараты из растений Сибири и Дальнего Востока: тез. докл. навсесоюз. конф. Томск, 1986. С. 130.
3. Свиридова Т.П., Зибарева Л.Н. Биоморфологические особенности и химический состав Lychnis chalcedonica L. в природе и культуре на юге Томской области // Бюл. Гл. бот. сада. 1989. Вып. 153. С. 24-28.
4. Горохова В.Г., Тюкавкина Н.А., Бабкин В.А. Высокоэффективная жидкостная хроматография растительных фенольных соединений // Четвертый всесоюзный симпозиум по фенольным соединениям.: тез. докл. Ташкент, 1982. 21 с.
5. Стыскин Е.Л., Ициксон Л.Б., Браудэ Е.В. Практическая высокоэффективная жидкостная хроматография. М., 1986. 288 с.
6. Pietta P., Mauri P., Bruno A., Rava A., Manera E., Ceva P. Identification of flavonoids from Ginkgo biloba L., An-themis nobilis L. and Equisetum arvense L. by high-performance liquid chromatography with diode-array UV detection // Journal of Chromatography A. 1991. Vol. 553. Pp. 223-231.
7. Mabry T.J., Markham K.R., Thomas M.B. The systematic identification of flavonoids. New York-Heidelberg-Berlin. 1970. 354 p.
Поступило в редакцию 2 июля 2009 г.
