CC BY
82
УДК 615.322
ИССЛЕДОВАНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА НОВОГО УРОЛОГИЧЕСКОГО СБОРА
© Е.А. Лукша, Г.И. Калинкина , Н.Э. Коломиец
Сибирский государственный медицинский университет, Московский тракт,
2/7, Томск, 634050 (Россия) E-mail: galina_kalinkina@mail.ru
На основании данных литературы и собственных экспериментальных исследований предложен состав нового урологического сбора. С целью разработки методов стандартизации сбора изучен его химический состав. Основными БАВ сбора являются фенольные соединения: флавоноиды, фенолокислоты, арбутин; содержатся полисахариды и витамины. В данном сообщении представлены результаты количественного определения БАВ и изучения качественного состава фенольных соединений лекарственного сбора методами хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента.
Ключевые слова: лекарственные растения, химический состав, фенольные соединения, флавоноиды, гидрооксико-ричные кислоты.
Введение
Многокомпонентные лекарственные растительные сборы давно и прочно вошли в медицину, что объясняется эффективностью и мягкостью их действия, отсутствием, как правило, нежелательных побочных явлений при длительном применении, относительной простотой производства, низкой стоимостью при достаточно высоком уровне спроса. Наряду с этим в перечне диуретических препаратов, разрешенных к медицинскому применению в Российской Федерации, доля сборов незначительна - менее 2%. Нами теоретически (по литературным данным) и экспериментально обоснован новый многокомпонентный урологический сбор, обладающий антимикробным, противовоспалительным и умеренным диуретическим действием [1-4]. Для разработки методик стандартизации сбора необходимо было изучить его химический состав и выявить наиболее значимые биологически активные вещества (БАВ).
Экспериментальная часть
Объектом исследования являлся сбор, содержащий лекарственные растения, разрешенные для применения в медицинской практике или используемые в народной медицине для лечения урологических заболеваний (листья березы, трава горца птичьего, побеги курильского чая, корни лопуха и другие). Лекарственное растительное сырье собирали в различные фазы вегетации в соответствии с требованиями нормативной документации [5].
Сбор готовили в соответствии с требованиями статьи «Сборы» ГФ XI. Степень измельченности сырья - 5 мм. Образцы сборов упаковывали и хранили в соответствии с требованиями нормативной документации [5, 6].
Количественное содержание биологически активных веществ (БАВ) в сборе определяли: сумму фенольных соединений - перманганатометрическим методом; дубильные вещества - перманганатометрическим методом в сочетании с осаждением дубильных веществ желатином; флавоноиды - спектрофотометрическим методом; фенолкарбоновые кислоты - хроматоспектрофотометрически; кумарины и арбутин - фотоколориметрически; сумму сапонинов, полисахаридов и их фракций - гравиметрическим методом; аскорбиновую кислоту - титриметрически; каротиноиды и витамин К - спектрофотометрически [6-10].
Качественный состав фенольных соединений сбора устанавливали методами одномерной и двумерной хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента в разных системах растворителей. Для хроматографии использовали бумагу марки «М» Санкт-Петербургской фабрики №2 им. Володарского, FN-2 (Filtrak); пла-
* Автор, с которым следует вести переписку.
стины «Сорбфил» (ПТСХ-АФ-А - производитель ЗАО «Сорбполимер») размером 10*10 и пластины фирмы Мегск К1езе^е1 60 Б254 размером 10*15 см.
Для хроматографического анализа из сбора экстракцией на кипящей водяной бане получали извлечение на 70% этаноле (соотношение сырья и экстрагента 1 : 10). Экстракт сгущали под вакуумом, остаток растворяли в 95% этаноле и хроматографировали восходящим способом [11-15]. Детектирование фенольных соединений проводили в УФ-свете до и после проявления хроматограмм соответствующими реагентами (спиртовые растворы алюминия хлорида и натрия гидроксида, раствор аммиака, диазореактив).
Идентификацию веществ при наложении пятен проводили методом препаративной хроматографии на бумаге. Индивидуальность всех идентифицированных веществ подтверждали методом двумерной хроматографии на бумаге.
Обсуждение результатов
Результаты химического исследования урологического сбора (табл. 1) показывают, что комплекс биологически активных веществ, присутствующих в сборе, состоит из фенольных соединений (флавоноидов, фе-нолокислот, арбутина и др.), полисахаридов, сапонинов и витаминов. Полисахаридный комплекс в сборе составляет более 18% и представлен водорастворимыми полисахаридами, пектиновыми веществами, гемицеллюлозами А и В.
Доминирующей группой БАВ с точки зрения количественного содержания и проявления основных фармакологических свойств (диуретического, противовоспалительного, антимикробного) являются фенольные соединения [16].
Наиболее значимые из фенольных соединений - флавоноиды и фенолокислоты, содержание которых в сборе достигает 0,80 и 0,27% соответственно. Более детальное изучение веществ этой группы было необходимо для разработки методов стандартизации исследуемого сбора.
Хроматографическое исследование фенольных соединений методом двумерной хроматографии на бумаге позволило обнаружить не менее 20 веществ.
Схема расположения окрашенных зон на хроматограмме при детектировании в УФ-свете до использования реактивов приведена на рисунке 1. Шесть веществ при просматривании в УФ-свете имели желтую или желтозеленую флюоресценцию, характерную для агликонов флавоноидов; шесть веществ давали темно-коричневую окраску, что характерно для гликозидов - производных флавона и флавонола; одна зона адсорбции на хроматограмме имела светло-серую окраску в УФ-свете, в парах аммиака эта зона изменила окраску на светлосинюю, что свидетельствует о присутствии анто-цианов; четыре вещества проявлялись в виде зон адсорбции с голубой, синей и сине-фиолетовой флюоресценцией - подобную окраску могут давать кумарины, фенолкарбоновые кислоты (ФКК), простые фенолы и некоторые флавоноиды (изофлаво-ны, флавон-5-гликозиды). После проявления хроматограммы спиртовым раствором хлорида алюминия окраска пятен в УФ-свете изменялась до желтоватобурой, желтовато-зеленой или темно-желтой. Наличие некоторых флавоноидов, а также арбутина было подтверждено методом тонкослойной хроматографии (табл. 2).
Дополнительное хроматографическое исследование фенолокислот на бумаге показало наличие окрашенных зон с И* около 0,26, 0,33, 0,71 и 0,76. Зоны совпадали с величиной известных образцов кофейной, феруловой, хлорогеновой и п-кума-ровой кислот соответственно.
Результаты анализа комплекса фенольных соединений методами хроматографии на бумаге и в тонком слое сорбента представлены в таблице 2.
Таблица 1. Содержание БАВ в урологическом сборе
Наименование БАВ Содержание, % а.с.с.
Фенольные соединения
Сумма фенольных соединений, 6,60+0,22
в том числе:
дубильные вещества 1,10+0,06
арбутин 0,27+0,05
флавоноиды 0,80+0,03
антоцианы 0,07+0,00
фенолокислоты 0,34+0,04
кумарины 0,27+0,01
Сапонины 0,22+0,01
Полисахариды, в т.ч. 18,80+0,85
водорастворимые полисахариды 6,70+0,17
пектиновые вещества 1,10+0,07
гемицеллюлоза А 4,42+0,40
гемицеллюлоза В 6,58+0,32
Витамины
аскорбиновая кислота 0,56+0,02
каротиноиды 2,34+0,01 мг%
витамин К 0,10+0,01
Примечание: (М + т), п=5, где М - среднее значение,
т - доверительный интервал, п - количество определений
Рис. 1. Хроматограмма этанольного извлечения из сбора: 1 - первое направление БУВ (4 : 2 : 1); 2 - второе направление - 15% уксусная кислота.
- агликоны флавоноидов, С -кумарины, ФКК, изофлавоны, флавон-5-гликозиды; (ГГ) - гликозиды флавоноидов;
.■■- антоцианы
Таблица 2. Результаты идентификации веществ фенольной природы урологического сбора
Название вещества Окраска в УФ-свете Величина
До проявления После проявления*
Арбутин (гидрохинон-О-Р-Б- бледно- Коричневая 0,85 I
глюкопиранозид) фиолетовая (диазотированная сульфаниловая кислота) 0,90 VI 0,89 V
Гидрохинон (и-оксифенол) - Коричневая (диазотированная сульфаниловая кислота) 0,72 II
Хлорогеновая кислота голубая Зеленая 0,62 I
(5-О-кофеил-Б-хинная) (пары аммиака) 0,44 III 0,66 VII
Кофейная кислота голубая Усиление окраски (пары аммиака) 0,82 I
(3,4-диоксикоричная) 0,26 III 0,78 VII
п-кумаровая кислота фиолетовая Синяя (пары аммиака) 0,90 I 0,76 III 0,30 VII
Феруловая фиолетово- Фиолетовая (пары аммиака) 0,84 I
(4-окси-3-метоксикоричная) голубая 0,71 III 0,30 VII
Кумарин (бензо-а-пирон) - Зеленоватая (спиртовый раствор ЫаОН) 0,89 I
Кверцетин желтая Желто-бурая (спиртовый раствор А1С13) 0,68 I
(3,5,7,3' ,4 '-пентаоксифлавон) 0,12 IV
Рутин (кверцетин-3-О-Р-Б- бурая Темный желто-зеленый 0,48 I
глюкопиранозидо-(1 ^6)-О-а-Б- (спиртовый раствор А1С13) 0,54 IV
рамнопиранозид)
Апигенин (5,7,4-триоксифлавон) бурая Зелено-желтый (спиртовый раствор А1С13) 0,92 I 0,05 IV
Гиперозид желто-бурая Темно-желтая (спиртовый раствор А1С13) 0,57 I
(кверцетин-З-О-Р-Б-галактопиранозид) 0,38 IV
Авикулярин бурая Темно-желтая 0,70 I
(кверцетин-З-О-Р-Б-арабинозид) (спиртовый раствор А1С13) 0,32 IV
Лютеолин темно- Желто-зеленый 0,85 I
(5,7,3',4'-тетрагидроксифлавон) коричневая (спиртовый раствор А1С13) 0,10 IV
* В скобках указаны реактивы для проявления хроматограмм; **Цифрами обозначены системы растворителей для хроматографирования: I - н-бутанол - уксусная кислота - вода (4 : 2 : 1) - БХ; II - вода, насыщенная С02, - БХ; III - 2% раствор уксусной кислоты - БХ; IV - 15% раствор уксусной кислоты- БХ; V - 60% раствор уксусной кислоты -ТСХ; VI - этилацетат -муравьиная кислота - вода (3 : 1 : 1) - БХ; VII - н-бутанол - 25% уксусная кислота (1 : 1) - БХ.
Для подтверждения полученных результатов и более детального изучения химического состава фенольных соединений сбора в дальнейшем мы применили метод высокоэффективной жидкостной хромато-масс-спектрометрии.
Выводы
1. На основании химического исследования в составе нового урологического сбора определено содержание: фенольных соединений - 6,60±0,22%, из них флавоноидов - 0,80±0,03% (кверцетин, рутин, гиперозид, авикулярин, лютеолин, апигенин), антоцианов - 0,07±0,00%, фенолокислот - 0,34±0,04% (хлорогеновая, феруловая, кофейная кислоты), арбутина - 0,27%, дубильных веществ - 1,10±0,06%, кумаринов -0,27±0,01%; сапонинов - 0,22±0,01%; полисахаридов (18,80±0,85): водорастворимых полисахаридов -6,70±0,17%, пектиновых веществ - 1,10±0,07%, гемицеллюлозы А - 4,42±0,40%, гемицеллюлозы В -6,58±0,32%; аскорбиновой кислоты - 0,56±0,02%; каротиноидов - 2,34±0,11 мг %, витамина К - 0,10±0,01%.
2. Наиболее значимы для дальнейшего детального химического исследования с точки зрения количественного содержания и проявления основных фармакологических свойств флавоноиды урологического сбора.
Список литературы
1. Патент №2314116 РФ. Лекарственное средство, обладающее комплексным диуретическим, противомикробным и противовоспалительным действием / Е.А. Лукша, Г.И. Калинкина, Н.Э. Коломиец / 26.06.2006.
2. Лукша Е.А. Химико-фармакологическое исследование урологического сбора: Автореф. дис. ... канд. фарм. наук. Томск, 2006. 23 с.
3. Калинкина Г.И., Дмитрук С.Е., Коломиец Н.Э., Охрименко Л.П. Антимикробные свойства экстрактов арбутинсодержащих растений: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения профессора Л.Н. Березнеговской. Томск, 2006. С. 272-277.
4. Лукша Е.А., Калинкина Г.И. Фармакологические свойства нового урологического растительного сбора // Бюл-
летень Сибирской медицины. 2006. Т. 5. Приложение 2. С. 109-110.
5. Государственная фармакопея СССР. Вып. 1. Общие методы анализа. XI изд., доп. М., 1987. 336 с.
6. Государственная фармакопея СССР. Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье. XI изд., доп. М., 1989. 400 с.
7. Федосеева Г.М. Способ определения фенольных соединений // Тезисы докладов конференции изобретателей и рационализаторов. Иркутск, 1980. С. 84-85.
8. Гринкевич Н.И., Сафронич Л.А. Химический анализ лекарственных растений. М., 1983. 176 с.
9. Методы исследования углеводов / пер. с англ. В.А. Несмеянова; Под ред. проф. А.Я. Хорлина. М., 1975. 445 с.
10. Девятнин В.А. Методы химического анализа в производстве витаминов. М., 1964. 360 с.
11. Бандюкова В.А. Применение цветных реакций для обнаружения флавоноидов путем хроматографирования на бумаге // Растительные ресурсы. 1965. Т. 1. Вып. 4. С. 591-597.
12. Бандюкова В.А., Шинкаренко А.А. Тонкослойная хроматография флавоноидов // Химия природных соединений. 1983. №1. С. 20-24.
13. Бандюкова В.А. Фенолокислоты растений, их эфиры и гликозиды // Химия природных соединений. 1983. Вып. 3. С. 263-272.
14. Harbome J.B. Comparative biochemistry of the flavonoids. L.; N.-Y., 1967. 383 p.
15. Mabry T.J., Markham K.R., Thomas M.B. The systematic identification of Flavonoids. N.-Y. etc., 1970. 354 p.
16. Брюханов В.М., Зверев Я.Ф., Санаров Е.М., Пензина Т.Н. Химико-фармакологические закономерности в действии растений семейства грушанковых // Экспериментальная и клиническая фармакология. 1999. T. 61. №6. C. 58-61.
Поступило в редакцию 10 декабря 2008 г.
