CC BY
292
УДК 615.32: 547.9+543.544
ИССЛЕДОВАНИЕ КОМПОНЕНТНОГО СОСТАВА ЦВЕТКОВ HELICHRYSUM ARENARIUM (L.) MOENCH.*
© А.В. Куркина
Самарский государственный медицинский университет, ул. Чапаевская, 89, Самара 443099 (Россия), e-mail: Annushkae@yandex.ru
Из цветков бессмертника песчаного [Helichrysum arenarium (L.) Moench.] выделены и идентифицированы изосали-пурпозид (доминирующий флавоноид), салипурпозид, 5,7-дигидроксифталид и 5-метокси-7-гидроксифталид. С использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии изучен компонентный состав цветков бессмертника песчаного и разработана методика количественного определения содержания изосалипурпозида в сырье данного растения. Содержание изосалипурпозида в цветках бессмертника песчаного варьирует от 1,56 до 1,78%.
Ключевые слова: бессмертник песчаный, Helichrysum arenarium (L.) Moench., цветки, флавоноиды, изосалипурпо-зид, спектрофотометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография.
Введение
Флавоноиды как биологически активные соединения лекарственных растений обладают широким спектром фармакологического действия и являются уникальным источником желчегонных, гепатопротек-торных, антиоксидантных, ангиопротекторых и противовоспалительных лекарственных средств [1-7]. Одним из перспективных источников желчегонного и гепатопротекторного действия являются цветки бессмертника песчаного - Helichrysum arenarium (L.) Moench. [2-4, 8-10].
Цветки и препараты бессмертника песчаного (настой, жидкий экстракт, «Фламин», желчегонные сборы) применяются в медицинской практике в качестве желчегонных лекарственных средств [2-4, 7, 10], однако в отношении химического состава литературные данные противоречивы. Согласно литературным данным, в цветках бессмертника песчаного к преобладающим флавоноидам относятся халкон изосалипур-позид, флаваноны салипурпозид, прунин и нарингенин [2-4, 7, 10], однако нет единой точки зрения, какой из этих компонентов является доминирующим. В бессмертнике песчаном содержится также ряд сопутствующих веществ, включая кумарины, коричные кислоты, фталиды, полисахариды и др. [2-4].
На наш взгляд, именно сложность химического состава цветков бессмертника песчаного является причиной того обстоятельства, что методики анализа для лекарственного растительного сырья (ЛРС) «Бессмертника песчаного цветки» не соответствуют современным требованиям фармакогнозии и фармакопейного анализа. Так, в фармакопейной статье на данное сырье (ст. 9 ГФ СССР издания XI) раздел «Качественные реакции» представлен только качественной реакцией на флавоноиды [11], которая не позволяет определять отдельные компоненты, характерные для данного растения. Кроме того, в разделе «Количественное определение» фармакопейная методика, по результатам наших исследований, дает завышение результатов по содержанию флавоноидов приблизительно в 2-3 раза [12]. Ранее нами разработана методика количественного определения суммы флавоноидов с использованием дифференциальной спектрофотоме-рии в присутствии Государственного стандартного образца (ГСО) изосалипурпозида [12]. Принимая во внимание то обстоятельство, что цветки бессмертника песчаного служат источником получения ГСО изо-салипурпозида, представляется актуальной разработка методики количественного определения изосали-пурпозида в данном сырье.
Цель исследования - разработка методики количественного определения изосалипурпозида в цветках бессмертника песчаного с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
* Данная статья имеет электронный дополнительный материал (приложение), который доступен читателям журнала по адресу: http://www.chem.asu.ru/chemwood/volume15/2011_02/1102-113app.pdf.
Экспериментальная часть
Исследовали образцы цветков бессмертника песчаного, собранные в различных регионах РФ, а также промышленные образцы сырья производства ОАО «Красногорсклексредства» (Московская обл.) и ООО ПКФ «Фитофарм» (Анапа, Краснодарский край). Выделение веществ осуществляли из цветков бессмертника песчаного, собранного в Самарской обл. (с. Переволоки, 2008 г.).
Измельченные воздушно-сухие цветки бессмертника песчаного (100 г) подвергали исчерпывающему экстрагированию 70% этиловым спиртом, сочетая при этом способ мацерации (24 ч) с последующей термической экстракцией при температуре 85-90 °С. Водно-спиртовые экстракты упаривали под вакуумом до густого остатка. Сгущенный экстракт высушивали на силикагеле L 40/100. Полученный сухой порошок наносили на слой силикагеля, сформированный в хлороформе (высота колонки 5 см, диаметр - 8 см). Колонку элюировали хлороформом и смесью хлороформ - этанол в различных соотношениях (99 : 1; 97 : 3; 95 : 5; 93 : 7; 90 : 10; 88 : 12; 85 : 15; 80 : 20; 70 : 30; 60 : 40). Это привело к получению блока фракций, содержащих целевые вещества, которые наносили на полиамид с целью дальнейшей очистки. Сухой порошок (экстракт+полиамид) переносили в хроматографическую колонку (высота сорбента - 3,0 см, диаметр -6,0 см), элюировали водой и водным раствором спирта этилового (20; 40; 70; 96%). Контроль за разделением веществ осуществляли с помощью ТСХ-анализа. В результате проведенной очистки на данной колонке были получены вещества I и II. Вещества III и IV получили из малополярных фракций в ходе последующей рехроматографии на силикагеле L 40/100. Очистку целевых веществ осуществляли перекристаллизацией из соответствующих растворителей. В результате были выделены вещества флавоноидной природы - изоса-липурпозид (I) и салипурпозид (II), а также фталиды - 5,7-дигидроксифталид (II) и 5-метокси-7-гидроксифталид (IV). Для установления структуры выделенных веществ использовали данные УФ- и :Н-ЯМР-спектров, а также непосредственное сравнение с достоверно известными веществами. Регистрацию электронных спектров проводили с помощью спектрофотометра «Specord 40» (Analytik Jena), :Н-ЯМР-спектры измеряли на спектрометре «Gemini-200» (Varian).
Изосалипурпозид (I) Салипурпозид (II) 5,7-Дигидрокси- 5-Метокси-7-
фталид (III) гидроксифталид (IV)
Соединение I - изосалипурпозид (6-0-Р-Э-глюкопиранозид 4,21,41,61-тетрагидроксихалкона). Кристаллы оранжевого цвета состава С21Н22О10, т.пл. 169-171 °С (смесь хлороформа и метанола). УФ-спектр в этаноле: ХтЕК 372 нм. Спектр 1Н-ЯМР (200 МГц, дейтероацетон) 5, м.д.: 14,12 (с, Н-21), 8,15 (д, 16 Гц, Н-Р), 7,76 (д, 16 Гц, Н-а.), 7,75 (д, 9 Гц, Н-2,6), 6,92 (д, 9 Гц, Н-3,5), 6,32 (д, 2 Гц, Н-51), 6,05 (д, 2 Гц, Н-31), 5,22 (д, 7 Гц, Н-11), 3,2-4,8 (м, 6Н глюкозы).
Соединение II - салипурпозид (5-О-Р-Э-глюкопиранозид нарингенина). Бесцветные кристаллы состава С21Н22О10, т.пл. 158-160 °С (водный спирт), УФ-спектр в этаноле: Хтах 227, 284 нм. Спектр 1Н-ЯМР (200 МГц, дейтероацетон) 5, м.д.: 7,55 (д, 9 Гц, Н-21,61), 6,62 (д, 9 Гц, Н-31,51), 6,10 (д, 2 Гц, Н-8), 6,08 (д, 2 Гц, Н-6), 5,41 (дд, 4 и 12 Гц, Н-2а), 5,92 (д, 7 Гц, Н-111), 2,80-4,00 (м, 6Н глюкозы), 2,86 (кв, 12 и 16 Гц, Н-3а), 2,68 (кв, 3,5 и 16 Гц, Н-3е).
Соединение III - 5,7-дигидроксифталид. Бесцветные кристаллы состава СдИ804, т.пл. 245-247 °С (этанол), УФ-спектр в этаноле: Хтах 217, 256, 291 нм. Спектр 1Н-ЯМР (200 МГц, дейтероацетон) 5, м.д.: 6,50 (д, 2Гц, Н-4), 6,34 (д, 2Гц, Н-6), 5,19 (с, 2Н-2), 3,20 (уш. с, 2-ОН).
Соединение IV - 5-метокси-7-гидроксифталид. Бесцветные кристаллы состава С8И604, т.пл. 184185 °С (хлороформ). УФ-спектр в этаноле: Хтах 218, 256, 292 нм. Спектр 1Н-ЯМР (200 МГц, СБС13) 5, м.д.: 7,67 (с, ОН), 6,50 (д, 2Гц, Н-4), 6,44 (д, 2Гц, Н-6), 5,27 (с, 2Н-2), 3.87 (с, СН3О).
В ходе разработки методики количественного определения изосалипурпозида в цветках бессмертника песчаного изучены УФ-спектры водно-спиртовых извлечений из данного сырья, а также растворов изосалипурпозида (I), салипурпозида (II), 5,7-дигидроксифталида (II) и 5-метокси-7-гидроксифталида (IV), выделенных из цветков бессмертника песчаного.
В основу разработанной нами методики количественного определения положены следующие оптимальные параметры: экстракция сырья 70% этиловым спиртом в течение 1 ч в условиях кипения в соотношении 1 : 50 [12].
ВЭЖХ-анализ осуществляли с использованием хроматографа «Милихром-5» в следующих условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме: колонка КАХ (2 мм х 80 мм), стационарная фаза «Диасорб С-16», элюентная система: ацетонитрил - вода в соотношении 25 : 75 с добавлением 1% ледяной уксусной кислоты, скорость элюирования - 100 мкл/мин, объем вводимой пробы - 5 мкл. Детекцию веществ осуществляли при пяти длинах волн - 254, 270, 290, 330 и 360 нм. Выбор длин волн обусловлен тем обстоятельством, что исследуемые вещества имеют максимумы поглощения при 372 нм (изосалипурпозид), 284 нм (салипурпозид), 256 и 292 нм (5,7-дигидроксифталид, 5-метокси-7-гидроксифталид), 330 нм (гидро-ксикоричные кисоты). Опорная и аналитическая длина волны при разметке пиков - 360 нм, так как целевым анализируемым веществом является изосалипурпозид, имеющий максимум поглощения 372 нм.
Сравнение значений времени удерживания пиков веществ (пики 1-5) на ВЭЖХ-хроматограмме извлечения из цветков бессмертника песчаного и времени удерживания пиков индивидуальных веществ (табл. 1) позволило идентифицировать четыре соединения (1-1У), среди которых доминирующим является изосалипурпозид (I) (ВЭЖХ-хроматограммы приведены в электронном приложении к статье).
Таблица 1. Время удерживания пиков веществ цветков бессмертника песчаного на хроматограммах
Вещество № пика на хроматограмме Время удерживания на хроматограмме извлечения, мин Время удерживания на хроматограмме вещества, мин
Изосалипурпозид (I) 5 7,198 7,399
Салипурпозид (II) 3 3,795 3,976
5,7-Дигидроксифталид (III) 2 2,919 3,221
5-Метокси-7-гидроксифталид (IV) 4 4,832 5,285
Вещество неидентифицированное 1 2,215 -
Методика количественного определения изосалипурпозида в цветках бессмертника песчаного.
Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм. Около 1 г измельченного сырья (точная навеска) помещают в колбу со шлифом вместимостью 100 мл, прибавляют 50 мл 70% этилового спирта. Колбу закрывают пробкой и взвешивают на тарир-ных весах с точностью до +0,01 г. Колбу присоединяют к обратному холодильнику и нагревают на кипящей водяной бане (умеренное кипение) в течение 60 мин. Затем колбу охлаждают в течение 30 мин, закрывают той же пробкой, снова взвешивают и восполняют недостающий экстрагент до первоначальной массы. Извлечение фильтруют через бумажный фильтр (испытуемый раствор).
5 мкл полученного раствора вводят в жидкостной хроматограф «Милихром-5» с УФ-детектором. Хроматографируют в условиях обращенно-фазовой хроматографии в изократическом режиме: колонка КАХ (2 мм х80 мм), стационарная фаза «Диасорб С-16», элюентная система - ацетонитрил : вода в соотношении 25 : 75 с добавлением 1% ледяной уксусной кислоты, скорость элюирования - 100 мкл/мин. Проводят УФ-детектирование при длине волны 360 нм, диапазон чувствительности 0,5. Проводят не менее 3-х параллельных определений.
Параллельно 5 мкл раствора ГСО изосалипурпозида вводят в хроматограф и хроматографируют, как описано выше. Проводят определение высоты пика ГСО изосалипурпозида и рассчитывают среднюю высоту пика по результатам 3-х определений.
Определяют время выхода и идентифицируют пик изосалипурпозида на хроматограмме испытуемого раствора. Измеряют высоту пика изосалипурпозида на хроматограмме и рассчитывают среднюю высоту пика по трем параллельным определениям.
Содержание изосалипурпозида в цветках бессмертника песчаного в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (X) вычисляют по формуле
Н - т0-V V-100-100
X —-----------------------,
Н0 • тV -V • (100- W)
где И - среднее значение высоты пика изосалипурпозида испытуемого раствора, вычисленное из хроматограмм раствора испытуемого образца, мм; Ио - среднее значение высоты пика раствора ГСО изосалипурпозида, вычисленное из хроматограмм раствора ГСО изосалипурпозида, мм; V - объем извлечения, мл; Уі - объем вводимой пробы раствора испытуемого образца, мкл; V, - объем раствора ГСО изосалипурпозида, мл; У2 - объем вводимой пробы раствора ГСО изосалипурпозида, мкл; т - масса сырья, г; то - масса ГСО изосалипурпозида, г; W - потеря в массе при высушивании сырья, в процентах.
Примечание. Приготовление раствора изосалипурпозида-стандартного образца. Около 0,02 г (точная навеска) изосалипурпозида помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 20-30 мл 95% этилового спирта, доводят объем раствора 95% этиловым спиртом до метки и перемешивают.
С использованием разработанной методики проанализирован ряд образцов цветков бессмертника песчаного. Содержание изосалипурпозида в цветках бессмертника песчаного варьируется от 1,56 до 1,78% (табл. 2).
Метрологические характери-
стики разработанной методики ВЭЖХ-анализа свидетельствуют о том, что ошибка единичного определения содержания изосалипурпозида в цветках бессмертника песчаного с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,75% (табл. 3).
Таким образом, с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии изучен компонентный состав цветков бессмертника песчаного - Helichrysum arenarium (L.) Moench. Разработана методика количественного определения содержания изосали-пурпозида в цветках данного растения.
Выводы
1. Из цветков бессмертника песчаного [Helichrysum arenarium (L.) Moench.] выделены и идентифицированы изосалипурпозид (доминирующий флавоноид), салипурпозид, 5,7-дигидроксифталид и 5-метокси-7-гидроксифталид.
2. Разработана методика количественного определения содержания изосалипурпозида в цветках бессмертника песчаного с использованием ВЭЖХ при аналитической длине волны 360 нм.
3. Содержание изосалипурпозида в цветках бессмертника песчаного варьирует в пределах от 1,56 до 1,78%. Ошибка единичного определения содержания изосалипурпозида в сырье бессмертника песчаного составляет ±4,75%.
Электронный дополнительный материал
В электронном дополнительном материале к статье (http://www.chem.asu.ru/chemwood/volume15/ 2011_01/1102-113app.pdf) приведены ВЭЖ-хроматограммы извлечения из цветков бессмертника песчаного и индивидуальных веществ.
Список литературы
1. Корулькин Д.Ю., Абилов Ж.А., Музычкина P.A., Толстиков Г.А. Природные флавоноиды. Новосибирск, 2007. 232 с.
2. Куркин В.А. Фармакогнозия. Самара, 2007. 1239 с.
3. Куркин В.А. Основы фитотерапии. Самара, 2009. 963 с.
4. Муравьева Д.А., Самылина И.А., Яковлев Г.П. Фармакогнозия. М., 2007. 656 с.
5. Тюкавкина H.A. Биофлавоноиды. Химия, пища, лекарство, здоровье: Актовая речь. М., 2002. 56 с.
6. The Flavonoids / Ed. by J.B. Harborne, T.J. Mabry, H. Mabry. London, New York: Chapman and Hall., 1975. 1204 p.
7. Wagner H. Pharmazeutische Biologie. Drogen und ihre Inhaltsstoffe. Stuttgart, New York, 1993. 522 s.
8. Государственный реестр лекарственных средств. Официальное издание. М., 2008. Т. 1, 2.
9. Дикорастущие полезные растения России / Отв. ред. А. Л. Буданцев, Е.Е. Лесиовская. СПб., 2001. С. 74-81.
10. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; Семейство As-teraceae (Compositae). СПб., 1993. С. 120-123.
11. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье / МЗ СССР. 11-е изд., доп. М., 1989. 400 с.
12. Куркина А.В. Новые подходы к стандартизации сырья бессмертника песчаного - Helichrysum arenarium (L.) Moench. // Традиционная медицина. 2010. №1. С. 45-49.
Поступило в редакцию 1 июня 2010 г.
Таблица 2. Содержание изосалипурпозида в различных образцах цветков бессмертника песчаного
Характеристика образца сырья Содержание изосали-пурпозида в а. с. с., %
ОАО «Красногорсклексредства» 1,67±0,02
ООО ПКФ «Фитофарм» (г. Анапа) 1,56±0,03
Самарская обл. (с. Переволоки, 2008 г.) 1,70±0,03
Ульяновская обл. (г. Барыш, 2008 г.) 1,62±0,02
Пензенская обл. (с. Новая Елюзань, 2005 г.) 1,78±0,03
Саратовская обл. (с. Усовка, 2008 г.) 1,59±0,02
Таблица 3. Метрологические характеристики количественного определения содержания изосалипурпозида в цветках бессмертника песчаного
f X § Р, % 1 (Р,0 АХ Е, %
10 1,67 0,0356 95 2,23 ±0,079 ±4,75
