CC BY
156
УДК 543.854.74 + 547.917
МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ ПОЛИФРУКТАНОВ В КОРНЯХ ЛОПУХА (ARCTIUM SPP.)
© Д.Н. Оленников , Л.М. Танхаева
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул. Сахьяновой, 6, Улан-Удэ, 670047 (Россия). E-mail: [email protected]
Разработана методика количественного определения суммарного содержания полисахаридов (полифруктанов) в корнях лопуха в пересчете на фруктозу. С применением методов спектрофотометрии и количественной ВЭТСХ исследован процесс экстракции свободных углеводов и полисахаридов. Установлены оптимальные параметры извлечения определяемой группы соединений. Проведен метрологический анализ разработанной методики. Установлено, что относительная ошибка определения не превышает 3%.
Ключевые слова: корни лопуха, Arctium spp., фруктаны, спектрофотометрия, ВЭТСХ, резорциновый метод. Сокращения: БАС - биологически активное соединение, ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография, Frc - фруктоза, Glc - глюкоза, M - молекулярная масса, Sac - сахароза.
Введение
Корни лопуха - официнальное растительное сырье, применяемое в качестве лекарственного средства. К использованию под данным названием разрешено применение корней трех видов лопуха - Arctium lappa L. (лопух большой), A. tomentosum Mill. (лопух войлочный) и A. minus (Mill.) Bernh. (лопух малый) [1].
Действующими группами БАС корней лопуха являются терпеновые, полииновые соединения и глюкоф-руктановые полисахариды [1]. К настоящему времени изучены состав и структурные особенности глюкоф-руктанов корней двух видов лопуха: A. lappa и A. tomentosum.
Из корней A. lappa выделен полимер с выходом 5,2%, М 2,95 кДа, представляющий собой линейный ß-1,2-глюкофруктан со степенью полимеризации 18-19 единиц. Фармакологические исследования показали, что глюкофруктан A. lappa обладает противокашлевым действием, сравнимым с таковым некоторых ненаркотических синтетических препаратов (преноксдиазина и дропропизина), более того, установлено наличие выраженного иммуномодулирующего действия, близкого по силе к действию зимозана [2].
Содержание глюкофруктанов в корнях A. tomentosum составляет 24%; из суммарного комплекса водорастворимых полисахаридов выделено три индивидуальных полимера GF-A, GF-B и GF-C с М 15,2, 11,0 и 9,2 кДа соответственно. Структурные исследования показали, что первые два вещества относятся к группе инулина ф-1,2-глюкофруктаны), а GF-C является представителем группы граминана (смешанный тип глюкофруктанов, содержащих 1,2- и 2,6-связи) [3].
Качество и подлинность сырья «Корни лопуха» регламентируется ВФС 42-2878-97, согласно которой количественная оценка проводится по содержанию экстрактивных веществ; определение действующих групп БАС не предусмотрено.
Целью настоящей работы является определение оптимальных параметров экстракции полисахаридов (полифруктанов) из корней лопуха, разработка методики количественного определения суммарного содержания полифруктанов и ее метрологический анализ.
Экспериментальные условия
Корни лопуха приобретены через аптечную сеть (.№1 - ООО «Шалфей», серия 010108; №2 - ООО «Ау-ра-Фарм», серия 030503; №3 - ООО «Алтай-Фарм», серия 0407).
* Автор, с которым следует вести переписку.
Спектроскопические исследования проводили на спектрофотометре CE 2011 (Cecil, Великобритания) в кварцевых кюветах 10 мм. Оптическое вращение ([a]D) определяли на поляриметре СМ-3 (Загорский оптикомеханический завод, Россия), в кювете длиной 1 дм при 20 °С. ИК-спектры регистрировали на ИК-Фурье спектрометре Spectrum 100 (Perkin-Elmer, США) в пленке на пластинах КРС-5 в интервале 4000-450 см-1. Для гель-хроматографии использовали Сефадекс G-75 (Pharmacia, Швеция) в условиях, описанных ранее [4].
В работе использовали фруктозу, глюкозу, сахарозу (Fluka), инулин (Sigma); остальные реактивы имели степень чистоты ч.д.а.
Выделение комплекса водорастворимых полисахаридов корней лопуха (APs). 100 г измельченных корней лопуха (сырье №3) предварительно экстрагировали в аппарате Сокслета последовательно гексаном, хлороформом, этилацетатом и 95% спиртом этиловым. Остаток сырья после высушивания экстрагировали водой (гидромодуль 1 : 20) на водяной бане при 100 °С в течение 1 ч трижды. Объединенный фильтрат концентрировали в вакууме до объема 100 мл и осаждали ацетоном (1:10), выпавший осадок отделяли центрифугированием и очищали переосаждением. Получено 14,2 г APs.
Полный гидролиз. Гидролизовали 20 мг вещества в 5 мл 0,5 М H2SO4 при 100°С в течение 30 мин. Гидролизат обрабатывали анионитом АВ-17-8 (Реахим, Россия, НСО3--форма), после чего концентрировали до минимального объема в вакууме при 40 °С и анализировали методом ВЭТСХ.
Для определения качественного состава извлечений при последовательной экстракции навеску сырья (1 г) экстрагировали 100 мл 95% этилового спирта 4 раза. Спиртовые извлечения собирали отдельно, концентрировали в вакууме до минимального объема, остаток переносили 50% спиртом этиловым в мерные колбы вместимостью 10 мл (1 экстракция) и 5 мл (2-4 экстракции) и доводили объемы растворов до метки тем же растворителем. Аналогичную процедуру проводили для водных извлечений. Полученные растворы использовали для ВЭТСХ-денситометрического анализа.
ВЭТСХ проводили в двукратном варианте на пластинах Сорбфил ПТСХ-АФ-В (Сорбполимер). Для этого на линию старта наносили 1 мкл исследуемого раствора и после просушивания хроматограмму элюировали смесью растворителей изопропанол - хлороформ - вода (7 : 4 : 1) двукратным последовательным подъемом на расстояние 4 и 8 см; детектор - анилин-фталат / дифениламин с последующим прогревом при 105 °С в течение 10 мин (А: 1 г анилина и 1,64 г фталевой кислоты растворить в 100 мл водонасыщенного спирта н-бутилового, Б: 1 г дифениламина растворить в 100 мл водонасыщенного спирта н-бутилового, перед проявлением смешать растворы А, Б и 85% H3PO4 10 : 10 : 1).
Количественный анализ хроматограмм осуществляли с применением планшетного сканера Bear Paw 2400C^ Plus (Mustek System Inc., Япония) и программы для сканирующей денситометрии TLC-Manager 3.1 (PinSoft, Украина). Градуировочные графики строили по фруктозе, глюкозе и сахарозе; количественный анализ олигомерных компонентов проводили по фруктозе.
Методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов в корнях лопуха в пересчете на фруктозу. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1 мм.
Около 1 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, приливают 100 мл 95% спирта этилового, присоединяют обратный холодильник и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин. После охлаждения извлечение фильтруют. Экстракцию сырья повторяют в тех же условиях еще 2 раза со 100 и 50 мл экстрагента.
К обработанному сырью приливают 100 мл воды очищенной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин. Извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 250 мл. Экстракцию сырья повторяют в тех же условиях еще 2 раза со 100 и 50 мл воды очищенной. Объем объединенного фильтрата доводят водой очищенной до метки (раствор А).
1 мл раствора А переносят в пробирку вместимостью 25 мл, приливают 1 мл 0,01% раствора тиомочевины, 1 мл 1% раствора резорцина, 8 мл 95% спирта этилового, 9 мл кислоты хлористоводородной концентрированной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 8 мин. После охлаждения реакционную смесь переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки водой очищенной (раствор Б).
Оптическую плотность раствора Б определяют при длине волны 480 нм.
Для приготовления раствора сравнения 1 мл раствора А переносят в пробирку вместимостью 25 мл, приливают 1 мл 0,01% раствора тиомочевины, 9 мл 95% спирта этилового, 9 мл кислоты хлористоводородной кон-
центрированной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 8 мин. После охлаждения реакционную смесь переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки водой очищенной.
Суммарное содержание полифруктанов (Х) в пересчете на фруктозу в процентах и абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле
х - D •.-mc_______________10L_ .100,
m DFrc • KVc 100 - W
где D - оптическая плотность исследуемого раствора; DFrc - оптическая плотность раствора стандартного образца фруктозы; m - масса сырья, г; mFrc - масса стандартного образца фруктозы, г; K - коэффициент разбавления исследуемого раствора (25000); KVFrc - коэффициент разбавления раствора стандартного образца фруктозы (10000); KG - коэффициент гидролиза (0,91); W- потеря в массе при высушивании сырья, %.
Приготовление раствора стандартного образца фруктозы. Около 0,080 г (точная навеска) фруктозы переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде очищенной и доводят объем раствора до метки тем же растворителем (раствор А). 1 мл раствора А переносят в пробирку вместимостью 25 мл, приливают 1 мл 0,01% раствора тиомочевины, 1 мл 1% раствора резорцина, 8 мл 95% спирта этилового, 9 мл кислоты хлористоводородной концентрированной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 8 мин. После охлаждения реакционную смесь переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора до метки водой очищенной (раствор Б).
Регрессионный анализ проводили с применением пакета программ Advanced Grapher ver. 2.11 (Alentum Software Inc., США), метрологический анализ (метод «введено-найдено», метод увеличивающейся пробы) и обработку результатов - согласно рекомендациям [6, 7].
Результаты и их обсуждение
Полисахаридный комплекс корней лопуха (APs) представляет собой белый аморфный порошок, растворимый в воде [a]D -47° (с 4,0; Н2О), выход 14,2%; в гидролизате APs в качестве основного моносахарида обнаружена фруктоза, глюкоза присутствует в следовых количествах. Гель-хроматография показала, что APs представляет собой гетерогенный комплекс, доминирующий компонент которого обладает молекулярной массой в диапазоне 5,0-5,7 кДа. В ИК-спектре APs выявлены полосы поглощения, типичные для глю-кофруктановых полимеров (v): 821, 867, 915 см-1. Полученные данные свидетельствуют о том, что APs является комплексом полисахаридов типа инулина.
В спиртовом извлечении корней лопуха также обнаружены резорцин-положительные компоненты -фруктоза, сахароза и ряд олигосахаридов, которые могут мешать определению полисахаридов (рис. 1).
Для устранения этого недостатка предложено проведение предварительной экстракции сырья 95% спиртом этиловым, в котором высокомолекулярные фруктаны нерастворимы, что было применено ранее в ходе исследования процесса извлечения фруктанов из корней девясила высокого [5]. Аналогичные эксперименты были проведены для корней лопуха (табл. 1, 2). Установлены следующие оптимальные параметры обработки сырья: предварительная экстракция 95% спиртом этиловым трижды при 100 °С, целевая экстракция водой, степень измельчения сырья 0,5-1,0 мм, температура экстракции 100 °С, трехкратная экстракция длительностью 60 мин каждая при соотношение сырье : экстрагент 1 : 100 дважды и 1 : 50 один раз.
Для подтверждения необходимости проведения предварительной экстракции и выявления полноты извлечения моно- и олигосахаридов, мешающих определению полимерных соединений, проведено исследование состава спиртовых извлечений с применением ВЭТСХ-денситометрического метода. В ходе предварительных экспериментов были подобраны условия хроматографирования, позволяющие добиться удовлетворительного разделения моно- и олигомерных компонентов. Проведенный анализ показал, что в состав спирторастворимой фракции входит не менее 9 углеводов: фруктоза, глюкоза, сахароза и ряд олигомерных ре-зорцин-положительных производных (OF-1 - OF-6, OF-S), причем доминирующими являются фруктоза и сахароза (рис. 1А).
Результаты количественного анализа хроматограмм представлены в таблице 3. Установлено, что в течение
1, 2 и 3-й экстракций извлекается соответственно 84,53, 12,28 и 2,79% от общего содержания свободных углеводов; на долю фруктозы и сахарозы приходится около 40%. Суммарное содержание компонентов стартовой зоны хроматограммы, представляющих собой более высокомолекулярные соединения, не превышает 11%.
Рис. 1. Денситограммы спиртовых (А) и водных (Б) извлечений 1-4 экстракции. Frc - фруктоза, Glc - глюкоза, Sac - сахароза, OF-1 - OF-2, OF-S, OF - олигомерные компоненты извлечений.
Таблица 1. Влияние степени измельчения на степень экстракции спирто- и водорастворимых углеводов из корней лопуха
Степень измельчения, мм Содержание углеводов в пересчете на Frc, %
спирторастворимых водорастворимых общее
<0,5 15,26±0,31 11,16±0,22 26,42
0,5-1,0 15,42±0,30 12,20±0,24 27,62
1,0-2,0 9,32±0,18 13,44±0,26 22,76
2,0-3,0 4,80±0,09 17,94±0,31 22,74
3,0-5,0 2,50±0,05 20,18±0,34 22,68
5,0-7,0 1,56±0,03 19,74±0,29 21,30
>7,0 1,04±0,02 17,18±0,20 18,22
Таблица 2.Влияние технологических параметров на степень экстракции фруктанов из корней лопуха
Исследуемый параметр Суммарное содержание фруктанов в пересчете на Frc, % Исследуемый параметр Суммарное содержание фрукта-нов в пересчете на Frc, %
Температура Соотношение сырье : экстрагент
20 2,54±0,09 1 : 20 1,11±0,04
40 8,64±0,18 1 30 4,57±0,11
60 14,29±0,19 1 50 16,48±0,27
80 20,67±0,44 1 : 70 22,37±0,38
100 25,38±0,60 1 : 100 24,89±0,54
Время экстракции, мин Кратность экстракции
1 (±0,15-0,21) 2 (±0,03-0,12) 3 (±0,01-0,02) 4 (±0,01-0,02)
15 10,15 2,96 0,48 -
30 14,02 3,28 0,63 -
45 14,32 3,30 0,66 -
60 14,58 3,36 0,70 -
75 14,60 3,26 0,70 0,03
90 14,60 3,26 0,70 0,05
105 14,46 3,20 0,65 0,05
120 14,06 3,18 0,65 0,05
При исследовании компонентного состава свободных углеводов трех партий сырья корней лопуха обнаружены все указанные ранее вещества - фруктоза, сахароза, глюкоза и олигосахариды (ОБ-1 - ОБ-б). Содержание фруктозы и сахарозы составляет 7,50-10,35 и 2,42-5,89% соответственно; общее содержание -13,27-18,45% от м.а.с.с. (табл. 4).
Метрологический анализ разработанной методики проводился с использованием общепринятых подходов. Методом «введено - найдено» установлено, что относительная ошибка определения не превышает 3% и может быть положительной и отрицательной (табл. 5).
Для выявления наличия систематической погрешности методики применен метод увеличивающейся пробы для навесок сырья, составляющих 25-150% от оптимальной; для всех экспериментальных групп определяли общее содержание фруктанов (х) и относительную ошибку определения (Е). По полученным результатам строили кривые зависимостей х и Е от массы навески (т) (рис. 2, табл. 4).
Установлено, что величина относительной ошибки определения при варьировании величины пробы от 25 до 150% от оптимальной изменяется в пределах 1,59-3,49% и не превышает допустимого значения в 5%. Методика содержит в себе систематическую погрешность, которая при величине пробы < 50% является постоянной и уменьшается с увеличением массы пробы, а при величине пробы > 50% переходит в линейно изменяющуюся погрешность с величиной в пределах 1,59-1,70%.
Наибольшие значения оптической плотности и величин содержания фруктанов (х) наблюдаются для навесок сырья с массами 50-100% от оптимальной. Снижение содержания ПФ при увеличении навески объясняется ухудшением условий экстракции вследствие уменьшения объема экстрагента в системе, что подтверждает правильность выбора массы навески.
Таблица 3. Концентрация моно- и олигосахаридов в извлечениях при последовательной экстракции 95%
спиртом этиловым, мкг/мл (% от общего содержания спирторастворимых углеводов в сырье)
Вещество Кратность экстракции z*
1 2 3 4
Frc 575 (23,89) 32 (1,33) 4,3 (0,18) - 611,3 (25,40)
Sac 297 (12,34) 25 (1,04) 4,3 (0,18) - 326,3 (13,56)
OF-1 61 (2,53) 85 (3,53) 3,7 (0,15) - 149,7 (6,21)
OF-2 100 (4,15) 16 (0,67) 11 (0,46) - 127,0 (5,28)
OF-3 180 (7,47) 29 (1,21) 8,9 (0,37) - 217,9 (9,05)
OF-4 144 (5,99) 23 (0,96) 12 (0,50) 2,7 (0,11) 181,7 (7,56)
OF-5 164 (6,81) 39 (1,62) 2,4 (0,10) 3,2 (0,13) 208,6 (8,66)
OF-6 160 (6,65) - - - 160,0 (6,65)
OF-S 209 (8,68) 29 (1,21) 17 (0,71) 4,1 (0,16) 259,1 (10,76)
Glc 145 (6,02) 17 (0,71) 3,4 (0,14) - 165,4 (6,87)
z* 2035 (84,53) 295 (12,28) 57,1 (2,79) 10 (0,40) 2397,1 (100)
* - суммарные показатели.
Таблица 4. Состав моно- и олигосахаридов корней лопуха, % от м.а.с.с.
Вещество Сырье*
1 2 3
Frc 7,50 10,35 7,55
Sac 5,89 2,56 2,42
OF-1 0,01 0,04 0,12
OF-2 0,98 0,56 0,39
OF-3 1,93 0,89 1,20
OF-4 1,43 0,88 1,03
OF-5 0,60 0,36 0,45
OF-6 0,11 0,06 0,11
Общее содержание 18,45 15,70 13,27
* - производители указаны в экспериментальной части.
Таблица 5. Метод «введено - найдено»
Фруктанов в аликвоте, мкг Бгс Введено инулина, мкг Frc Должно быть фруктанов, мкг Бгс Найдено фруктанов, мкг Frc Ошибка
аб^, мкг отн., %
1028 240 1268 1272 +4 0,32
1028 480 1508 1468 -40 2,65
1028 720 1748 1720 -22 1,26
1028 960 1988 1950 -38 1,91
Метрологические характеристики разработанной методики определялись на трех партиях сырья; относительная ошибка определения не превышает 3% (табл. 7).
По результатам проведенной экспериментальной работы можно рекомендовать разработанную методику для использования в фармацевтической практике для анализа растительного сырья «Корни лопуха».
Е,
х,
28
27
26
Рис. 2. Метод увеличивающейся пробы: изменение значений относительной ошибки определения (Е, ■, 1) и содержания ПФ (х, ▲, 2) в зависимости от величины навески (т)
Таблица 6. Метод увеличивающейся пробы. Метрологические показатели
Группа исследования* n x,% 52 5x tp, f + Дх,% E,%
1 10 27,76 1,8458 0,4299 2,26 0,97 3,49
2 10 27,98 0,3865 0,1967 2,26 0,45 1,61
3 10 28,25 0,4240 0,2061 2,26 0,47 1,66
4 10 27,96 0,4280 0,2070 2,26 0,47 1,68
5 10 27,07 0,3614 0,1902 2,26 0,43 1,59
6 10 27,08 0,4112 0,2029 2,26 0,46 1,70
* 1 - 25%, 2 - 50%, 3 - 75%, 4 - 100%, 5 - 125%, 6 - 150%.
Таблица 7. Метрологические характеристики разработанной методики (n = 10, P = 0,95, tP,f = 2,26)
Сырье* x,% 52 5x + Дх,% E,%
1 34,12 0,4714 0,2173 0,49 1,44
2 24,35 0,9323 0,3056 0,69 2,83
3 25,67 0,5916 0,2434 0,55 2,14
* производители указаны в экспериментальной части.
Выводы
Для количественного анализа официнального растительного сырья - корней лопуха, предложена спектрофотометрическая методика определения содержания полифруктанов (полифруктанов), использующая модифицированный резорционовый метод определения кетоз. Проведенный метрологический анализ методики показал, что она воспроизводимая и в области рабочих концентраций содержит в себе линейно изменяющуюся погрешность с величиной не более 2%.
Список литературы
1. Лекарственное растительное сырье. Фармакогнозия. СПб., 2004. 765 с.
2. Kardosova A., Ebringerová A., Alfoldi J., Nosál’ova G., Fraüova S., Hríbalová V. A biologically active fructan the roots of Arctium lappa L. // Biological Macromolecules. 2003. V. 33. Pp. 135-140.
3. Турдумамбетов К., Бакиров Б.А., Рахимов Д.А. Глюкофруктаны корней Arctium tomentosum // Химия природных соединений. 2004. №3. С. 181-183.
4. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Углеводы Lamiaceae. I. Пектиновые вещества и гемицеллюлозы Mentha x piperita // Химия природных соединений. 2007. №5. С. 411-416.
5. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М., Чехирова Г.В., Петров Е.В. Методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов в корневищах и корнях девясила высокого (Inula helenium L.) // Химия растительного сырья. 2008. №1. С. 95-99.
6. Александров Ю.И., Беляков В.И. Погрешность и неопределенность результата химического анализа // Журнал аналитической химии. 2002. Т. 57. №2. С. 118-129.
7. Дёрффель К. Статистика в аналитической химии. М., 1994. 252 с.
Поступило в редакцию 7 июля 2008 г.
После переработки 8 ноября 2008 г.
