CC BY
99
УДК 547.588:547.972:543.4
ФЕНОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ЛИСТЬЕВ CACALIA HASTATA L.
И ИХ КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ
© Д.Н. Оленников , Л.М. Танхаева
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул. Сахьяновой, 6, Улан-Удэ, 670047 (Россия) E-mail: oldaniil@rambler.ru
Исследован состав фенольных соединений листьев Cacalia hastata. В результате хроматографического разделения было выделено 11 соединений, идентифицированных с кемпферолом, кверцетином, гиперозидом, рутином, (+)-катехином, умбеллифероном, скополетином, эскулетином, галловой, кофейной и хлорогеновой кислотами, причем флавоноиды и катехин обнаружены в данном растительном виде впервые. Методом ВЭЖХ установлено количественное содержание указанных соединений в листьях C. hastata. Разработана спектрофотометрическая методика определения суммарного содержания фенилпропаноидов в листьях C. hastata, которая использует прямой вариант анализа в УФ-области. В качестве стандартного образца вещества сравнения выбрана хлорогеновая кислота - доминирующий компонент комплекса фенилпропаноидов данного вида растительного сырья. Установлено, что суммарное содержание фенилпропаноидов в листьях C. hastata составляет 3,34-13,64%. Проведенный валидационный анализ показал, что методика соответствует критериям приемлемости.
Ключевые слова: Cacalia hastata L., Asteraceae, фенилпропаноиды, хлорогеновая кислота, ВЭЖХ, УФ-спектро-фотометрия.
Работа выполнена при финансовой поддержке проекта СО РАН VI.44.1.7 «Структурная организация и динамика компонентов растительного покрова в условиях климатических изменений».
Введение
Cacalia hastata L. (какалия копьевидная) - многолетнее корневищное травянистое растение высотой до 190 см, широко распространенное в России. В практике тибетской медицины в Забайкалье C. hastata известна под названием ю-гу-шинг и применялась при гнойных ранах и язвах в качестве ранозаживляющего, анти-экссудативного, гемостатического средства, а также при бронхитах [1]. В рецептурных прописях тибетских лекарей ее использовали для остановки кровотечений, при раневой лихорадке как повязку на раны и в составе различных лекарственных сборов, применявшихся для лечения дерматологических заболеваний [2].
Химический состав C. hastata разнообразен и представлен различными группами биологически активных веществ. Из листьев C. hastata были выделены алкалоиды [3], сесквитерпены [4-7], тритерпены [8], ка-ротиноиды [9]. В составе свободных углеводов листьев C. hastata установлено наличие фруктозы, глюкозы и галактозы. Из комплекса водорастворимых полисахаридов выделены глюкоарабиногалактан (какалан А) и два арабиногалактана (какаланы В и С). Пектиновые вещества листьев C. hastata относятся к классу высо-коэтерифицированных пектинов, гемицеллюлозные производные группы А являются ксилоглюкофруктана-ми, группы Б - ксиланами [10]. Для листьев C. hastata характерно высокое содержание компонентов цикла ди- и трикарбоновых кислот [11]. Фенольные соединения листьев C. hastata представлены кумаринами и дубильными веществами [12]. Также в C. hastata обнаружены фотосинтетические пигменты [9], аскорбиновая кислота [13], тиамин и рибофлавин [12]. Согласно данным об элементном составе C. hastata относится к группе умеренных накопителей алюминия, бария, железа, кобальта, магния, никеля, свинца, стронция, а также является сверхконцентратором кремния, кобальта и цинка [12].
Цель настоящей работы - исследование состава фенольных соединений листьев C. hastata и разработка методики количественного определения суммарного содержания фенилпропаноидов в данном виде растительного сырья.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Экспериментальные условия
Растительное сырье. Листья С. Иси^а, были собраны в 2004-2009 гг. на территории Республики Бурятии (табл. 1). Видовая принадлежность определена докт. фарм. наук Т.А. Асеевой (ИОЭБ СО РАН). Образцы сырья хранятся в гербарии отдела биологически активных соединений ИОЭБ СО РАН.
Таблица 1. Характеристика сырья С. hastata
№ сырья Место сбора Дата сбора (ДД.ММ.ГГ)
Ch-1 Прибайкальский р-он, с. Горячинск 10.VIII.2003
Ch-2 Закаменский р-он, с. Бортон 12.VII.2004
Ch-3 Прибайкальский р-он, с. Хурамша 27.VII.2004
Ch-4 Мухоршибирский р-он, с. Харашибирь 27.VII.2004
Ch-5 Мухоршибирский р-он, с. Мухоршибирь 15.VnI.2004
Ch-6 Мухоршибирский р-он, с. Мухоршибирь 14.VHL2005
Ch-7 Прибайкальский р-он, с. Горячинск 20.VII.2006
Ch-8 Прибайкальский р-он, пос. Тальцы 25.VII.2007
Ch-9 г. Улан-Удэ 30.VII.2007
Ch-10 г. Улан-Удэ 2.VIII.2008
Ch-11 Прибайкальский р-он, с. Горячинск 14.VII.2009
Ch-12 Мухоршибирский р-он, с. Мухоршибирь 20.VII.2009
Ch-13 Прибайкальский р-он, с. Татаурово 25.VII.2009
Ch-14 Прибайкальский р-он, с. Горячинск 31.VII.2009
Общие экспериментальные условия. Колоночную хроматографию проводили на силикагеле L 100/400 (Chemapol) и полиамиде (Woelm), гель-хроматографию - на Сефадексе LH-20 (Pharmacia), препаративную ТСХ - на пластинах с силикагелем Сорбфил ПТСХ-П-А (Имид Ltd.), ВЭТСХ - на пластинах с силикагелем Сорбфил ПТСХ-АФ-В (Имид Ltd.). Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре UV-Vis-mini (Shimadzu). ИК-спектры регистрировали на ИК-Фурье спектрометре Spectrum 100 (Perkin-Elmer). Спектры 13С-ЯМР регистрировали на ЯМР-спектрометре VXR 500S (Varian) с рабочей частотой 125,7 МГц для 1% растворов веществ в ДМСО^6. ВЭЖХ проводили на микроколоночном жидкостном хроматографе Милихром А-02 (Эконова), колонка Nucleosil 100-5 C18 (5 дм, 75*2 мм), градиентный режим элюирования (А - 0,05 М КН2РО4/МеCN 95 : 5, В - МеОН), v = 0,15 мл/мин, Т = 35 °С, УФ-детектор при X = 202, 224, 270, 278 нм. В ходе анализа определялись хроматографическая подвижность, спектр в остановленном потоке растворителя, спектральные соотношения, а также проводились опыты с добавками стандартных соединений.
В работе использованы стандартные образцы веществ: фруктоза, глюкоза, сахароза, инулин (Acros Organics), 1-кестоза, нистоза (Carbosynth Lim.); остальные реактивы имели степень чистоты ч.д.а.
Экстракция и выделение фенольных соединений. Высушенное измельченное сырье (520 г) экстрагировали пятикратно 80% этанолом (модуль 1 : 25) при 80 °С. Объединенное спиртовое извлечение концентрировали до водного остатка, который подвергали жидкофазной экстракции гексаном, хлороформом, этилацетатом и н-бутанолом, что привело к получению следующих фракций: гексановой (22,31 г; 4,29% от массы возд.-сух. сырья), хлороформной (33,80 г; 6,50%), этилацетатной (4,58 г; 0,88%), бутанольной (40,14 г; 7,72%) и водного остатка (107,17 г; 20,61%). Общий выход экстрактивных веществ составил 40% от массы воздушно-сухого сырья.
Для разделения хлороформной фракции (20 г) применяли колоночную хроматографию на силикагеле (3*50 см) в системах «гексан - хлороформ» (100 : 0 ^ 70 : 30) и «хлороформ - метанол» (100 : 0 ^ 50 : 50) с последующей рехроматографией в условиях гель-хроматографии на LH-20 (2*40 см) в градиентной системе «хлороформ - метанол» (100 : 0 0 : 100), препаративной ТСХ (система «толуол -
этилацетат - муравьиная кислота» 3 : 3 : 1) и ВЭТСХ (система «петролейный эфир - диэтиловый эфир -муравьиная кислота» 9 : 4 : 1). В результате выделены соединения 1 (11 мг), 2 (9 мг), 3 (25 мг), 4 (14 мг) и 5 (5 мг). Этилацетатное (4,2 г) извлечение (7 г) хроматографировали на SiO2-колонке (2*30 см) в системах «хлороформ - ацетон» (100 : 0 ^ 70 : 30), «ацетон - этанол» (100 : 0 ^ 50 : 50), «этанол - вода» (95 : 5 ^ 40 : 60). Субфракции разделяли на колонках с полиамидом (2*20 см; элюент «этанол - вода» 0 : 100 ^ 95 : 5, ацетон) с последующей препаративной ТСХ (системы «толуол - этилацетат - муравьиная кислота» 5 : 4 : 1, «этилацетат - метанол - вода» 9,6 : 1,9 : 1). Хроматографическое разделение этилацетатной фракции привело к выделению соединений 6 (22 мг), 7 (28 мг), 8 (7 мг), 9 (16 мг), 10 (18 мг) и 11 (84 мг). Выделенные вещества были идентифицированы по данным физико-химического анализа (температура плавления, оптическое вращение), а также УФ-, ИК-, 13С-ЯМР-спектроскопии.
Методика количественного определения суммарного содержания фенилпропаноидов в листьях С. каММа. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито, с отверстиями диаметром 1 мм. Около 0,5 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, приливают 100 мл 70% этанола, присоединяют обратный холодильник и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин. После охлаждения извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 200 мл. Экстракцию сырья повторяют в тех же условиях еще раз. Объем объединенного фильтрата доводят до метки 70% спиртом этиловым (раствор А). 1 мл раствора А переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводят объем раствора до метки 70% спиртом этиловым (раствор Б). Оптическую плотность раствора Б определяют при длине волны 330 нм.
Суммарное содержание фенилпропаноидов (Х) в пересчете на хлорогеновую кислоту (в %) и абсолютно-сухое сырье вычисляют по формуле:
X =
D ■ KV
100
m ■ 530 100 - W
где D - оптическая плотность исследуемого раствора; K- коэффициент разбавления исследуемого раствора (2500); 530 - удельный коэффициент погашения хлорогеновой кислоты в 70% спирте этиловом при длине волны 330 нм; m - масса сырья, г; W- потеря в массе при высушивании сырья, %.
Определение параметров специфичности, повторяемости, правильности, межоперационной точности и точности разработанной методики осуществляли согласно [14-16]. Регрессионный анализ проводили с применением пакета программ Advanced Grapher ver. 2.11 (Alentum Software Inc.).
Результаты и их обсуждение
В результате фракционирования экстрактивных веществ листьев C. hastata получен ряд узких фракций. Хроматографическое разделение хлороформной и этилацетатной фракций с применением колоночной хроматографии на силикагеле, полиамиде, Сефадексе LH-20, а также препаративной ТСХ и ВЭТСХ, позволило выделить 11 соединений, идентифицированных с кемпферолом (1), кверцетином (2), гиперозидом (9), рутином (11), (+)-катехином (8), умбеллифероном (3), скополетином (4), эскулетином (5), галловой (6), кофейной (7) и хлорогеновой кислотами (10) (рис. 1). Соединения 3-7, 10 были ранее выделены из C. has-tata [8, 17], а 1, 2, 8, 9, 11 - обнаружены в данном растительном виде впервые. Доминирующим соединением фенольного комплекса листьев C. hastata является хлорогеновая кислота (10); в составе флавоноидов преобладает рутин (11).
HO.
•OH
OH
R2
R1
O
O
OH O
Ri R2 Ri R2
(1) H H (3) OH OH
(2) H OH (4) OH OCH
(9) Gal OH (5) ОН Н
(11) Rut OH
COOH
A HOX r COOH
HO'" H O HO'' J
OH
(6) (7)
(8)
з
Рис. 1. Структурные формулы соединений, выделенных из листьев C. hastata. Gal - галактоза, Rut -рутиноза
С применением метода ВЭЖХ проведен количественный анализ состава спиртового экстракта (70% этанол) из листьев С. кси^а (табл. 2). Установлено, что содержание хлорогеновой кислоты (10) и рутина (11) - 18,72 и 9,94 мг/г соответственно; в пересчете на сырье эти показатели составляют 7,84 и 4,32 мг/г от массы воздушно-сухого сырья.
Ранее для анализа листьев С. ка^'(а(а были предложены методики количественного определения суммарного содержания органических кислот, каротиноидов и аскорбиновой кислоты [12]. Стандартизация с использованием данных методик является приемлемой, но, учитывая современные потребности фармацевтической практики, нами пересмотрены подходы к анализу данного вида растительного сырья.
При исследовании УФ-спектра спиртового извлечения С. ка^'(а(а установлено присутствие максимума поглощения при 330±2 нм (рис. 2). Спектр поглощения доминирующих фенилпропаноидов - хлорогеновой и кофейной кислот, совпадает с таковым спиртового извлечения из сырья, поэтому оба соединения могут быть использованы в качестве стандартных веществ для количественного определения суммарного содержания фенилпропаноидов, имеющих максимум поглощения в области 330 нм. В качестве стандартного соединения была выбрана хлорогеновая кислота; для расчета использовали величину удельного коэффициента погашения (Е1%1см), равного 530.
В экспериментах по определению оптимальных параметров процесса экстракции флавоноидов, обеспечивающих их максимальное извлечение, исследовалось влияние типа экстрагента, температуры экстракции, степени измельчения сырья, соотношения «сырье - экстрагент», кратности и времени экстракции. Эффективность экстракции оценивалась по содержанию в извлечениях фенилпропаноидов (табл. 3). Определено, что оптимальными параметрами экстракции флавоноидов являются: степень измельчения сырья
1,0 мм, температура экстракции 100 °С, двукратная экстракция длительностью 60 мин каждая при соотношении «сырье - экстрагент» 1 : 200.
В ходе проведения валидации разработанной методики исследованы параметры специфичности, повторяемости, правильности, межоперационной точности и точности (табл. 4).
Установлено, что методика определения суммарного содержания фенилпропаноидов в листьях С. ка^'(а(а спектрофотометрическим методом соответствует критериям приемлемости. Заданные критерии удовлетворяют требованиям соответствующей нормативной документации.
С применением разработанной методики проведено исследование 14 образцов сырья С. ка^а, собранное в 2004-2009 гг. на территории Республики Бурятии (табл. 5). Результаты количественного анализа показали, что суммарное содержание фенилпропаноидов в исследованном сырье в пересчете на хлорогеновую кислоту составляет 3,34-13,64%.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что разработанная методика может быть использована в практике фармацевтического анализа для количественного анализа листьев С. ка^'(а(а.
Таблица 2. Содержание фенольных соединений
в спиртовом извлечении и сырье С. ка^'(а(а (сырье №Ск-12)
Соединение Содержание, мг/г
в спиртовом экстракте в сырье
(1) 2,04±0,06 0,86±0,03
(2) 1,14±0,03 0,67±0,02
(3) 0,42±0,01 0,183±0,005
(4) 0,64±0,02 0,282±0,008
(5) 0,052±0,002 0,027±0,001
(6) 8,63±0,26 3,77±0,11
(7) 12,84±0,36 5,21±0,16
(8) 2,33±0,07 0,97±0,03
(9) 2,88±0,09 1,15±0,04
(10) 18,72±0,56 7,84±0,24
(11) 9,94±0,30 4,32±0,12
А
'I
0.0
250 300 350 400 Л,пт
Рис. 2. УФ-спектры поглощения спиртового извлечения листьев С. ка^'(а(а (1), хлорогеновой (2) и кофейной кислот (3)
Таблица 3. Влияние технологических параметров на степень экстракции фенилпропаноидов (ФПр) из листьев С. ка^'(а(а а
Исследуемый параметр Суммарное содержание ФПр, % 6 Исследуемый параметр Суммарное содержание ФПр, % 6
Экстрагент (концентрация этанола, %) Степень измельчения, мм
20 5,07±0,10 5 2,21 ±0,04
40 5,03±0,10 3 4,15±0,08
60 5,24±0,11 2 6,33±0,12
70 7,14±0,14 1 7,11±0,14
80 7,04±0,14 0,5 7,04±0,14
95 6,67±0,12 0,25 7,01±0,13
Температура, °С Соотношение сырье : экстрагент
20 2,07±0,04 1:30 1,10±0,02
40 3,73±0,07 1:50 2,73±0,05
60 4,81±0,10 1:70 5,11±0,10
80 6,15±0,12 1:100 6,88±0,13
90 7,03±0,14 1:200 7,16±0,14
100 7,22±0,15 1:400 7,15±0,14
Время и кратность экстракции
Время, мин Экстракция
1-я 2-я 3-я
15 1,19±0,02 0,33±0,01 н,о, в
30 3,15±0,06 0,43±0,01 н,о, в
45 4,39±0,09 0,87±0,02 н,о, в
60 6,83±0,14 1,11±0,02 <0,1
75 6,83±0,14 1,11±0,02 <0,1
90 6,84±0,14 1,11±0,02 0,2
105 6,83±0,14 1,11±0,02 0,2
120 6,82±0,14 1,10±0,02 0,2
а образец сырья Ch-9; n = 5; в не определяются.
Таблица 4. Валидационная характеристика разработанной методики
Параметр Критерий приемлемости
Определенная величина критерия Требуемая величина критерия Вывод
Специфичность Правильность Повторяемость Межоперационная точность Точность Recovery = 98,7-103,2% 8 = 0,91% Recovery = 99,4-102,1% 8 = 0,98% RSD = 1,28% RSD = 1,42% согласно п.п. 3 и 4 - Recovery = 95-105% 8 <3% Recovery = 97-103% 8 <3% RSD <3% RSD <3% удовлетворяет критерию приемл удовлетворяет критерию приемлемости II II II емости
Таблица 5. Метрологические характеристики разработанной методики (п = 10, P = 0,95, tPf = 2,26)
№ сырья x, % S2 Sx ±Ax, % E, %
Ch-1 3,63 9,59-10-3 3,10-10-2 0,07 1,93
Ch-2 13,17 8,63-10-2 9,29-10-2 0,21 1,60
Ch-3 3,34 9,58-10-2 3,09-10-2 0,07 2,10
Ch-4 11,14 9,48-10-2 9,73-10-2 0,22 1,98
Ch-5 11,24 1,22-10-1 1,1110-1 0,25 2,22
Ch-6 4,25 1,25-10-2 3,53-10-2 0,08 1,88
Ch-7 10,11 1,04-10-1 1,02-10-2 0,23 2,28
Ch-8 10,73 8,61-10-2 9,27-10-2 0,21 1,96
Ch-9 8,10 5,66-10-2 7,52-10-2 0,17 2,10
Ch-10 7,61 4,41-10-2 6,64-10-2 0,15 1,97
Ch-11 13,64 1,88-10-1 1,37-10-1 0,31 2,27
Ch-12 6,42 3,84-10-2 6,20-10-2 0,14 2,18
Ch-13 11,88 1,04-10-1 1,03-10-2 0,23 1,94
Ch-14 12,31 1,22-10-1 1,1010-1 0,25 2,03
Выводы
В результате хроматографического разделения комплекса фенольных соединений листьев Cacalia hastata L. выделено 11 веществ, представителей классов флавоноидов, кумаринов, катехинов и фенольных кислот. С применением метода ВЭЖХ установлено, что доминирующими компонентами являются хлорогеновая кислота и рутин. Разработана спектрофотометрическая методика количественного определения суммарного содержания фенилпропаноидов в листьях C. hastata.
Список литературы
1. Тибетская медицина у бурят. Новосибирск, 2008. 324 с.
2. Сумати Праджня «Кунпан Дудзи Ньингпо» - Бурятский большой рецептурный справочник тибетской медицины. Улан-Удэ, 1995.
3. Коновалов В.С., Меньшиков Г.П. Исследование алкалоидов Cacalia hastata // Журнал общей химии. 1945. Т. XV, вып. 4-5. С. 328-331.
4. Hayashi K., Nakamura H., Mitsuhashi H. Sesquiterpenes from Cacalia hastata // Phytochemistry. 1973. V. 12. Pp. 2931-2933.
5. Krasovskaya N.P., Kulesh N.I., Denisenko V.A. Natural antioxidants. Furanoeremophyllanes from roots of Cacalia // Chemistry of Natural Compounds. 1989. V. 25, N5. Pp. 576-579.
6. Naya K., Miyoshi Y., Mori H., Takai K., Nakanishi M. Sesquiterpenes of Cacalia species // Chemistry Letters. 1976. Pp. 73-76.
7. Romo J., Joseph-Nathan P. The constituents of Cacalia decomposita A. Grey. Structures of cacalol and cacalone // Tetrahedron. 1964. V. 20. Pp. 2331-2337.
8. Olennikov D.N., Tankhaeva L.M. Biologically active substances from Cacalia hastata leaves. V. Coumarins and triterpenes // Chemistry of Natural Compounds. 2005. V. 41, N5. Pp. 600-601.
9. Olennikov D.N., Tankhaeva L.M., Nikolaeva G.G., Nikolaev S.M. Biologically active substances from Cacalia hastata leaves. II. Carotenoids and chlorophylls // Chemistry of Natural Compounds. 2004. V. 40, N1. Pp. 96-97.
10. Olennikov D.N., Tankhaeva L.M., Nikolaeva G.G., Tsyrenzhapov A.V., Nikolaev S.M., Chekhirova G.V. Biologically active substances from Cacalia hastata leaves. I. Carbohydrates from leaves and their hypoglycemic activity // Chemistry of Natural Compounds. 2004. V. 40, N1. Pp. 1-5.
11. Olennikov D.N., Tankhaeva L.M., Nikolaeva G.G., Nikolaev S.M., Rokhin A.V., Kushnarev D.F. Biologically active substances from Cacalia hastata leaves. III. Organic acids // Chemistry of Natural Compounds. 2004. V. 40, N3. Pp. 289-290.
12. Оленников Д.Н., Потанина О.Г., Танхаева Л.М., Николаева Г.Г., Фармакогностическая характеристика листьев какалии копьевидной (Cacalia hastata L.) // Химия растительного сырья. 2004. №3. С. 43-52.
13. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Биологически активные вещества листьев Cacalia hastata L. VI. Динамика накопления фотосинтетических пигментов и форм аскорбиновой кислоты // Сибирский медицинский журнал. 2006. №6. С. 82-84.
14. ГОСТ Р. ИСО 5725-1-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения. Введ. 23.04.02. М., 2002. 32 с.
15. ГОСТ Р. ИСО 5725-4-42002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений. Введ. 23.04.02. М., 2002. 32 с.
16. Проект ОФС «Валидация фармакопейных методов» // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. 2001. №1. С. 28.
17. Olennikov D.N., Mikhailova T.M., Tankhaeva L.M., Nikolaeva G.G., Nikolaev S.M. Biologically active substances from Cacalia hastata leaves. IV. Phenolic acids // Chemistry of Natural Compounds. 2005. V. 41, N2. Pp. 222-223.
Поступило в редакцию 21 апреля 2010 г.
