Методика количественного определения группового состава углеводного комплекса растительных объектов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 543.42 + 547.917

МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУППОВОГО СОСТАВА УГЛЕВОДНОГО КОМПЛЕКСА РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТОВ

© Д.Н. Оленников , Л.М. Танхаева

Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул. Сахьяновой, 6, Улан-Удэ, 670047 (Россия) E-mail: [email protected]

Разработана методика количественного определения группового состава углеводного комплекса растительных объектов (свободные углеводы, водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества и гемицеллюлозы) из одной навески, основанная на объединении известной схемы разделения углеводов по Бейли и модифицированного спектрофотометрического метода Дрейвуда. Проведенный метрологический анализ показал, что относительная ошибка определения не превышает 5%. Разработанная методика была апробирована на 6 видах растительного сырья, относящихся к разным морфологическим группам.

Сокращения: Ara - арабиноза, GalUA - галактуроновая кислота, Glc - глюкоза, Frc - фруктоза, Man - манноза, Plt -плантеоза, Rha - рамноза, Raf - раффиноза, Sac - сахароза, Ste - стахиоза, Xyl - ксилоза.

Введение

Анализ углеводов (моно-, олиго- и полимеров) является одной из наиболее изучаемых проблем современного биохимического анализа. За последние 80 лет предложено около 1000 различных методов и вариантов методик количественного определения углеводных компонентов с применением целого спектра физико-химических методов.

Известные методы анализа содержания групп углеводных компонентов в растительном сырье обычно сводятся к определению одного или двух классов (СУ, ВРПС) либо представляют собой долгий и трудоемкий процесс последовательного выделения разных классов с применением серии экстрагентов и последующим гравиметрическим установлением выхода получившихся фракций. Известно, что углеводные полимеры представляют собой сложную смесь компонентов углеводной, белковой, минеральной и фенольной природы. Гравиметрический вариант анализа не позволяет оценить содержание углеводной компоненты в выделенных образцах, так как определяется суммарный выход всего комплекса.

Ранее нами рассмотрена возможность модификации известного метода количественного анализа углеводов с применением антронового метода Дрейвуда [1]. В результате предложены подходы, позволяющие увеличить точность и воспроизводимость анализа. На основе модифицированного метода опубликован ряд методик анализа растительного сырья [2, 3]. В настоящей работе приводятся результаты разработки комбинированного метода определения группового состава углеводного комплекса растительных объектов. Он основывается на объединении известной схемы разделения углеводов по Бэйли с соавт. [4], заключающейся в последовательной экстракции растительного сырья растворителями разной природы, позволяющей более или менее избирательно выделять необходимые классы углеводного комплекса, и спектрофотометрического метода Дрейвуда. Объединение спектрофотометрии и гравиметрии в данном случае выгодно отличает данную методику от остальных, так как позволяет определять только содержание углеводов в исследуемых образцах.

* Автор, с которым следует вести переписку.

Экспериментальные условия

Образцы растений приобретены через аптечную сеть («Красногорсклексредства», «СТ-Медифарм», «Вифитех», «Травы Башкирии», Россия).

Подготовка материала. Аналитическую пробу сырья измельчают до размера частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 1,0 мм.

Определение свободных углеводов (СУ). Около 2,0 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом, приливают 70 мл 80%-ного спирта этилового, закрывают обратным холодильником и нагревают на кипящей водяной бане в течение 1 ч. После охлаждения извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 250 мл. Экстракцию повторяют в тех же условиях еще два раза. Объем объединенного фильтрата доводят 80%-ным спиртом этиловым до метки (раствор А1).

0,5 мл раствора А1 переносят в центрифужную пробирку, приливают 0,5 мл 10%-ного раствора свинца ацетата, перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин. После охлаждения к содержимому пробирки приливают 0,5 мл 10%-ного раствора натрия сульфата и через 20 мин центрифугируют в течение 10 мин со скоростью вращения 3000 об/мин. Надосадочную жидкость переносят в другую пробирку, приливают 4 мл 0,2%-ного раствора антрона в кислоте серной концентрированной, нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин. Содержимое пробирки после охлаждения переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл 95%-ным спиртом этиловым и доводят до метки тем же растворителем (раствор Б1).

Определение водорастворимых полисахаридов (ВРПС). Остаток сырья после спиртовой экстракции извлекают водой очищенной (2x100 мл, 100 °С, 1 ч). Извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 200 мл и доводят до метки тем же экстрагентом (раствор А2). 2 мл раствора А2 переносят в центрифужную пробирку, приливают 8 мл 95%-ного спирта этилового, перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин. После охлаждения содержимое пробирки центрифугируют в течение 10 мин со скоростью вращения 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок продувают в пробирке горячим воздухом до удаления следов этанола. К осадку приливают 4 мл 0,2%-ного раствора антрона в кислоте серной концентрированной, нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Содержимое пробирки после охлаждения переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл 95%-ным спиртом этиловым и доводят до метки тем же растворителем (раствор Б2).

Определение пектиновых веществ (ПВ). Остаток сырья после водной экстракции обрабатывают смесью 0,5%-ных растворов кислоты щавелевой и аммония оксалата (1 : 1; 3x80 мл, 100 °С, 1,5 ч) и далее по схеме для ВРПС (растворы А3 и Б3).

Определение гемицеллюлоз (ГЦ). Остаток сырья после экстракции ПВ обрабатывают 5%-ным раствором калия гидроксида (3x80 мл, 18-21 °С, 4 ч) и далее по схеме для ВРПС (растворы А4 и Б4) - суммарное содержание ГЦ.

ГЦ группы А определяют по следующей схеме: 1 мл раствора А4 переносят в центрифужную пробирку, приливают 2 мл 5%-ной кислоты серной, перемешивают и нагревают на кипящей водяной бане в течение 5 мин и далее по общей схеме (Б5). ГЦ находят по разности значений общего содержания и ГЦА.

Оптическую плотность растворов Б измеряют на спектрофотометре при длинах волн 430 (Бь Б3-Б5) и 424 (Б2) нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 4 мл 0,2%-ного раствора антрона в кислоте серной концентрированной, выдержанные в тех же условиях, что и опытная смесь.

Содержание групп углеводов (Х, %) в пересчете на доминирующий моносахарид и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле

^ D • kv 100

X —-------•-------,

m • E 100 - W

где D - оптическая плотность исследуемого раствора; ^ - коэффициент разбавления (12500 - СУ, 2500 -ВРПС, 5000 - ПВ, ГЦ); 0,91 - коэффициент гидролиза; E - коэффициент пересчета на моносахарид (Ara -67, Frc - 423, Gal - 224, GalUA - 214, Glu - 358, Xyl - 455); m - масса навески сырья, г; W - потеря в массе при высушивании сырья, %.

Метрологическую обработку результатов проводили согласно рекомендациям [5, 6].

Результаты и их обсуждение

Свободные углеводы. При выборе оптимального экстрагента для СУ необходимо было соблюдение следующих условий: растворитель должен был извлекать наибольшее количество СУ при минимальном содержании ВРПС; он должен быть доступным и нетоксичным, что имеет значение при проведении массового анализа. При сравнительном исследовании выхода СУ и ВРПС в зависимости от типа экстрагента на ряде видов растительного сырья, относящегося к разным морфологическим группам, установлено, что наиболее оптимальным является 80%-ный спирт этиловый (рис. 1). Трехкратная экстракция позволяет на 95-98% извлечь СУ из сырья.

Водорастворимые полисахариды. Представители этого класса углеводов вместе с ПВ относятся к так называемым биодоступным полисахаридам, так как именно они играют наиболее важную роль при развитии растения, а также отвечают за биологическую активность экстракционных препаратов из лекарственного сырья. После удаления СУ из сырья водная экстракция позволяет практически нацело извлечь этот класс углеводов. Выход ВРПС при двукратной экстракции составляет 94-97% (рис. 2).

Пектиновые вещества. Основными типами экстрагентов для ПВ являются разбавленные растворы кислот и кислых солей, а также некоторые комплексные и хелатные соединения. Использование для этих целей растворов неорганических кислот (HCl, H2SO4, H3PO4) не позволяет добиться полного извлечения.

Следует отметить, что также возрастает риск деструкции ПВ в условиях кипящей водяной бани (до 12%, рис. 3); уменьшение температуры экстракции снижает степень разрушения ПВ с одновременным понижением выхода данной группы полисахаридов. Смесь оксалат аммония - щавелевая кислота нацело экстрагирует ПВ в щадящих условиях даже при температуре кипения (степень разрушения ПВ в течение 1,5 ч не превышает 2%).

Гемицеллюлозы как группа щелочерастворимых полисахаридов хорошо извлекаются растворами неорганических оснований и основных солей. В качестве экстрагента выбран 5% раствор КОН, так как экстрагирующая сила NaOH несколько ниже (рис. 4). Повышение концентрации щелочи не дает особых преимуществ для извлечения ГЦ, повышение температуры снижает выход, вероятно по причине деструкции. Полнота экстракции в условиях постоянного перемешивания достигается после 4 ч; увеличение времени контакта фаз не приводит к заметному возрастанию выхода ГЦ.

Разработанные подходы были применены для анализа группового состава углеводов шести официналь-ных растений: Plantago major L. (листья), Tussilago farfara L. (листья), Bidens tripartita L. (трава), Tilia cordata Mill. (цветки), Inula helenium L. (корни), Althaea officinalis L. (корни). Результаты представлены в таблице. Следует отметить, что при использовании данной методики при анализе объектов, содержащих гомополимеры типа инулина или крахмала, по показателю «водорастворимые полисахариды» наблюдается получение заниженных результатов, что объясняется частичной растворимостью этого типа полисахаридов в спирте этиловом высоких концентраций и недостаточной его преципитационной способностью. Этот факт был обнаружен еще в 30-50 гг. XX в. и описан в работах [5-7]. При исключении этапа осаждения этанолом получаются более правильные результаты: Inula helenium - 18-21%, Althaea officinalis - 9-12%.

К°нцентрация этанола, % Кратность экстракции

Рис. 1. Динамика экстракции СУ (вверху) и ВРПС (внизу) спиртом этиловым. Сырье: листья Plantago major L. (■), цветки Tilia cordata Mill. (□), трава Mentha x piperita L. (•), корни Inula helenium L. (A)

Рис. 2. Выход ВРПС в зависимости от кратности экстракции. Сырье: листья Tussilago farfara L. (■), цветки Chamomilla recutita Raushert. (□), трава Melissa officinalis L. (•), корни Althaea officinalis L (▲), Sorbus aucuparia L. (o)

Время нагрева, мин

Время контакта фаз, мин

Рис. 3. Влияние 0,5%-ных растворов кислот на растворы цитрусового пектина (0,1%) в условиях кипящей водяной бани. Кислоты: (СООН)2 (■), H3PO4 (▲), H2SO4 (•), HCl (□)

Рис. 4. Влияние концентрации КОН на выход ГЦ (надземная часть Origanum vulgare L., 18-20 °С, качалка 120 кач/мин). Концентрации, %: 10 (ж),

5 (▲), 2,5 (•), 1 (□), 0,5 (■)

Групповой состав углеводов некоторых растительных объектов (n 11; P 0,95; tPf 2,23)

Объект

Содержание групп углеводов, %

x ± Ax E

Свободные углеводы Водорастворимые полисахариды Пектиновые вещества Гемицеллюлозы

А Б Суммарное содержание

5,23 - 6,11 1,58 -1,80 7,19 - 7,67 3,40 - 3,61 0,53 - 0,94 3,69 - 4,85

Plantago major L. 5,67 ± 0.27 1,72 ± 0,06 7,34 ± 0,14 3,50 ± 0,09 0,78 ± 0,03 4,27 ± 0,11

4,76 3,49 1,91 2,57 3,90 2,57

4,18 - 4,79 1,26 -1,32 5,43 - 5,96 2,52 - 3,00 0,08 - 0,10 2,87 - 3,15

Tussilago farfara L. 4,53 ± 0,19 1,29 ± 0,02 5,69 ± 0,20 2,88 ± 0,04 0,09 ± 0,004 2,97 ± 0,12

4,19 1,55 3,52 1,39 4,44 4,04

6,85 - 7,29 1,48 -1,59 4,46 - 4,71 4,71 - 5,05 0,97 -1,26 5,84 - 6,29

Bidens tripartita L. 7,10 ± 0,13 1,53 ± 0,03 4,63 ± 0,07 4,92 ± 0,08 1,10 ± 0,03 6,03 ± 0,14

1,83 1,96 1,51 1,63 2,70 2,32

7,24 - 7,87 1,65 -1,73 4,53 - 4,74 3,30 - 3,43 1,34 -1,62 4,68 - 5,01

Tilia cordata Mill. 7,64 ± 0,19 1,68 ± 0,02 4,66 ± 0,10 3,41 ± 0,07 1,49 ± 0,05 4,88 ± 0,08

2,49 1,19 2,15 2,05 3,36 1,64

15,67 -16,07 8,02 -10,13 4,77 - 5,27 3,32 - 3,50 0,34 - 0,51 3,66 - 3,95

Inula helenium L. 15,83 ± 0,12 9,14 ± 0,29 4,99 ± 0,12 3,38 ± 0,06 0,44 ± 0,02 3,82 ± 0,07

0,76 3,17 2,41 1,78 4,55 1,83

17,51 -18,89 4,84 - 5,22 10,78 -12,40 7,49 - 7,66 3,74 - 4,80 11,21 -12,38

Althaea officinalis L. 18,53 ± 0,41 4,96 ± 0,12 11,65 ± 0,40 7,55 ± 0,05 4,30 ± 0,11 11,83 ± 0,30

2,21 2,42 3,43 0,66 2,56 2,54

- X

max

Выводы

Разработана методика количественного определения группового состава углеводного комплекса растительных объектов (свободные углеводы, водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества и гемицеллюлозы) из одной навески, основанная на объединении известной схемы разделения углеводов по Бейли и модифицированного спектрофотометрического метода Дрейвуда. Проведенный метрологический анализ показал, что относительная ошибка определения не превышает 5%. Разработанная методика была апробирована на 6 видах растительного сырья, относящихся к разным морфологическим группам.

Список литературы

1. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Спектры поглощения углеводов и родственных соединений в серной кислоте // Химия природных соединений. 2006. №3. С. 218-220.

2. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Применение модифицированного метода Дрейвуда для количественного анализа листьев Plantago major // Химия природных соединений. 2006. №3. С. 221-223.

3. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Разработка технологии получения экстракта подорожника большого сухого // Химия растительного сырья. 2006. №1. С. 47-52.

4. Bailey R.W., Haq S., Hassid W.Z. Carbohydrate composition of particulate preparations from mung bean (Phaseolus aureus) shoots // Phytochemistry. 1967. V. 6. №2. P. 293-301.

5. Александров Ю.И., Беляков В.И. Погрешность и неопределенность результата химического анализа // Журнал аналитической химии. 2002. Т. 57. №2. С. 118-129.

6. Смагунова А.Н. Способы оценки правильности результатов анализа // Журнал аналитической химии. 1997. Т. 52. №10. С. 1022-1029.

7. Thaysen A.C., Backer W.E., Green B.M. LII. On the Nature of the Carbohydrates Found in the Jerusalem Artichoke // The Biochemical Journal. 1929. V. 23. №3. P. 444-455.

8. Bacon J.S.D., Edelman J. The Carbohydrates of the Jerusalem Artichoke and Other Compositae // The Biochemical Journal. 1951. V. 48. №1. P. 114-126.

9. Bell D.J., Palmer A. Structural Studies on Inulin from Inula helenium and on Levans from Dactylis glomerata and Lo-lium italicum // Journal of Biochemical Society. 1952. P. 3763-3770.

Поступило в редакцию 29 октября 2006 г.