CC BY
255
УДК 543.854.74 + 547.917
ИССЛЕДОВАНИЕ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОЙ РЕАКЦИИ ИНУЛИНА С РЕЗОРЦИНОМ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УСЛОВИЙ ЕЕ ПРОВЕДЕНИЯ
*
© Д.Н. Оленников , Л.М. Танхаева
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул. Сахьяновой, 6, Улан-Удэ, 670047 (Россия). E-mail: oldaniil@rambler.ru
Определены оптимальные условия проведения колориметрической реакции инулина с резорцином. Показано влияние состава реакционной смеси, времени нагрева и температуры на интенсивность оптической плотности. Для стабилизации аналитического сигнала предложено введение тиомочевины. Установлено, что предварительная экстракция корневищ и корней девясила высокого 95% спиртом этиловым способствует максимальному удалению свободных углеводов.
Сокращения: ПФр - полифруктаны, Glc - глюкоза, Frc - фруктоза, IH - водное извлечение корневищ и корней девясила высокого, Inu - инулин, Sac - сахароза.
Введение
Полифруктаны (ПФр) представляют собой углеводные полимеры, образованные молекулой сахарозы, удлиненной цепью фруктозных остатков. В природе ПФр обнаружены в бактериях, грибах и растениях, в которых они выполняют различные функции. Данный класс природных полисахаридов (ПС) продуцируется более 15% растительных видов, относящихся к разным семействам. Наиболее часто ПФр встречаются в представителях Liliaceae, Asteraceae, Campanulaceae и Polemoniaceae.
Структурно ПФр делятся на три класса, отличающиеся типом связи между остатками фруктозы: группа инулина - Р-(2—1)-связь; группа левана - Р-(2—6)-связь; группа граминана - р-(2—>1) и р-(2—6)-связь.
ПФр группы инулина используются для производства ряда БАД, способных положительно влиять на обмен веществ, стабилизировать уровень глюкозы в крови и в связи с этим частично заменять антидиабетические препараты [1]. Инулин способствует выведению из организма солей тяжелых металлов и усвоению кальция и железа, а также активизировать работу поджелудочной железы и влиять на углеводный обмен в печени [2]. Имеются сведения о наличии у инулина пробиотических [3] и иммуномодулирующих свойств [4].
В России официнальными являются несколько видов растительного сырья, содержащего ПФр типа инулина: корневища и корни девясила высокого (ГФ XI, ст.73; ТУ 64-4-19-77), корни одуванчика лекарственного (ГФ XI, ст.69), корни лопуха (ВФС 42-2878-97). Стандартизация указанного сырья по разделу «Числовые показатели» проводится, как правило, по содержанию экстрактивных веществ [5].
Цель настоящей работы - исследование условий проведения колориметрической реакции инулина с резорцином и определение параметров предварительной обработки сырья - корневищ и корней девясила высокого - для проведения анализа на содержание ПФр.
Экспериментальные условия
Для регистрации спектров поглощения применяли спектрофотометры Cecil CE 2011 и Agilent 8453E UV-Vis.
В работе использовали фруктозу (Acros Organics, 98%), инулин (Sigma); остальные реактивы имели степень чистоты ч.д.а. Корневища и корни девясила приобретены через аптечную сеть (ООО «Травы Башкирии», серия 0905).
Стандартные растворы фруктозы и резорцина готовили в 95% этиловом спирте в концентрациях 0,8 и
1 мг/мл, соответственно; инулина - 1 мг/мл в воде очищенной.
Автор, с которым следует вести переписку.
Приготовление извлечения корневищ и корней девясила высокого. 1 г (0,5-1,0 мм) измельченного сырья помещают в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, приливают 100 мл 95% этилового спирта, присоединяют обратный холодильник и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин. После охлаждения извлечение фильтруют. Экстракцию сырья повторяют в тех же условиях еще 2 раза со 100 и 50 мл этанола. К обезжиренному сырью приливают 100 мл воды очищенной и нагревают на кипящей водяной бане в течение 60 мин. Извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 250 мл. Экстракцию сырья повторяют в тех же условиях еще 2 раза со 100 и 50 мл воды очищенной. Объем объединенного фильтрата доводят водой очищенной до метки (раствор А).
Определение соотношения вода - кислота - спирт этиловый проводили по следующей схеме. Конечный объем реакционной пробы был выбран 20 мл (меньший объем приводит к резкому изменению концентраций, что не позволяет добиться плавности результатов; больший объем приводит к громоздкости эксперимента и менее удобен). В составе реакционных проб неизменными оставались объемы стандартных растворов резорцина и фруктозы - по 1 мл, объемы воды, кислоты и спирта этилового изменялись так, как описано ниже:
1 группа: Ун2о = 0 мл, Ус2Н5ои : Уиа = 20 : 0, 19 : 1 ... 0 : 20;
2 группа: Ун2о = 1 мл, Ус2Н5ои: Уиа = 19 : 0, 18 : 1 ... 0: 19;
20 группа: Ун2о = 19 мл, Ус2Н5ои : Уиа = 1 : 0, 0 : 1.
После составления пробы ее нагревали на кипящей водяной бане в течение 8 мин, переносили в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили объем до метки водой. Манипуляции в пробах одной группы проводились одновременно в одинаковых условиях. Оптическую плотность проб определяли при длине волны 480 нм относительно раствора сравнения. По результатам эксперимента строили поверхности отклика в координатах Скислоты с спирта этилового А.
Растворимость инулина определяли по следующей методике: 100 мг инулина помещали в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, приливали 100 мл 20, 40, 60, 80 и 95% спирта этилового, присоединяли обратный холодильник и нагревали на кипящей водяной бане в течение 60 мин. После охлаждения (холодная фильтрация) или сразу (горячая фильтрация) извлечение фильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили объем раствора до метки тем же растворителем.
Остаток после фильтрации вместе с фильтром переносили в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, приливали 70 мл воды очищенной, присоединяли обратный холодильник и нагревали на кипящей водяной бане в течение 60 мин. После охлаждения извлечение фильтровали в мерную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию повторяли в тех же условиях с 30 мл воды очищенной. Объем объединенного раствора доводили до метки водой очищенной.
1 мл растворов переносили в пробирку вместимостью 25 мл, приливали 1 мл раствора тиомочевины, 1 мл раствора резорцина, 8 мл этанола, 9 мл кислоты хлористоводородной и нагревали при 100 °С в течение 8 мин. После охлаждения реакционные смеси переносили в мерные колбы вместимостью 100 мл и доводили объемы растворов до меток очищенной водой. Оптические плотности растворов определяли при длине волны 480 нм.
ВЭТСХ проводили по методике Литвиновой-Калининой [6] на ВЭТСХ-пластинах Армсорб (Реахром), импрегнированных буферным раствором (спирт пропиловый - хлороформ - ДМСО - буферный раствор (51 : 29 : 11 : 9), двукратное элюирование на высоту 4 и 8 см, буферный раствор: 0.07 М №2НР04 - 0,07 М КН2Р04 (96,7 : 3,3), pH 8,0). Детектор - смесь 1% растворов резорцина, п-оксидифенила, фталаниловой кислоты в водонасыщенном спирте бутиловом и 85% кислоты фосфорной в соотношении 5 : 5 : 5 : 1.
Количественный состав спиртовых извлечений ВЭТСХ-денситометрически с применением планшетного сканера Мивїек 2000 и программы для сканирующей денситометрии TLC-Manager 3.1 (@РіпБо/і 2005). В качестве стандартных образцов углеводов применяли глюкозу (Яодиеґґе), фруктозу (Асгоі' О^стс), сахарозу (Реахим).
Результаты и их обсуждение
Для определения количественного содержания ПФр в растительном сырье чаще всего применяется метод, включающий следующие этапы: предварительно обезжиренное сырье обрабатывают водой, и после гидролиза водного извлечения проводится этап образования аналитического компонента по реакции Селиванова, концентрация которого определяется спектрофотометрическим способом. Данная схема определе-
ния ПФр довольно распространена и имеет ряд модификаций, основные отличия которых сводятся к варьированию состава реакционной среды, применению стабилизаторов и изменению параметров регистрации оптической плотности (длина волны) [7-13]. ПФр типа инулина представляют собой гидролитически наименее устойчивый класс ПС. Для расщепления связей между остатками Бге достаточно применения 0,01 М раствора НС1 в условиях 100 °С в течение 3-4 ч [14]. Выделяющаяся в результате гидролиза Бге может быть легко определена в виде окрашенного комплекса фруктозы с резорцином. Данная реакция довольно специфична для кетогексоз и не требует жестких условий ее проведения [15].
Из данных литературы установлено, что регистрацию аналитического компонента предлагается проводить в довольно широком диапазоне длин волн - 398-540 нм. Анализ спектров поглощения показал, что комплексы Бге, 1пи и ІН с резорцином аналогичны и обладают двумя экстремумами в видимой области - 400 и 480 нм (рис. 1). Компоненты раствора по отдельности не влияют на интенсивность максимумов. В качестве аналитической длины волны была выбрана точка 480 нм по причине ее удаленности от коротковолновой области, в которой могут находиться полосы поглощения сопутствующих веществ фенольной природы.
Для проведения реакции необходимо присутствие следующих компонентов: вода, этанол, кислота хлористоводородная и резорцин. Как указывалось ранее, составы реакционной смеси у разных авторов значительно варьируют. Определение состава проводили групповым методом с последующим представлением полученных данных в виде поверхностей, а также построением изоабсорбатных карт, являющихся плоскостными моделями поверхностей отклика в координатах скислоты - сспирта этилового и позволяющих наглядно представить результаты эксперимента. Полученные данные приведены в таблице 1.
При исследовании соотношения компонентов реакционных смесей установлено, что для Іпи и ІН вид поверхностей аналогичен и точка экстремума лежит в области состава: НС1 - 15%, С2Н5ОН - 52%.
Для определения оптимального времени нагрева реакционной смеси, в течение которого развивается максимальная окраска, проводили нагревание в течение 40 мин (рис. 2). Обнаружено, что наибольшая оптическая плотность растворов развивается через 7-8 мин. Дальнейшее нагревание приводит к падению оптической плотности. В целом процесс состоит из двух этапов: быстрый - образование окрашенного компонента (0-8) и медленный - его изменение (или разрушение).
Рис. 1. Спектры поглощения окрашенных комплексов ІН (1), Іпи (2) и Бге (3) с резорцином
Рис. 2. Влияние времени нагрева реакционной смеси: ІН (1), Іпи (2)
Таблица 1. Вид поверхностей отклика и их проекций на ось сЕюн - снсь %
1пи
ІН
Проекция поверхности на ось сЕЮН - снсь %
'43 сеюн’ %
33 29 26 22 18 15 11 7 4
При исследовании устойчивости окрашенного продукта во времени установлено, что оптическая плотность реакционных смесей постепенно снижается, не выходя на прямолинейный участок. Через 1 ч окраска снижается почти на 35%. Для устранения этого недостатка нами исследована возможность стабилизации при введении некоторых компонентов. При проверке ряда веществ мы остановили свой выбор на тиомочевине, как доступном реактиве, не поглощающим видимой области спектра и не влияющим на вид спектра поглощения окрашенного комплекса, а также позволяющим получать удовлетворительные результаты.
Установлено, что введение тиомочевины вызывает повышение оптической плотности с последующим периодом стабильности окраски до 120 мин. Оптимальной является концентрация 0,01%, показавшая наибольшую оптическую плотность и длительность плато окраски (до 45 мин).
При исследовании влияния температуры на интенсивность колориметрической реакции установлено, что наибольшие значения оптической плотности достигаются в диапазоне температур 96-100 °С (рис. 3).
Для определения содержания водорастворимых полисахаридов в растительном сырье применяется два типа спектрофотометрических методик.
1. Сырье без предварительной обработки экстрагируется водой, после чего ВРПС из водного извлечения осаждаются избытком этанола или ацетона (до конечной концентрации 70-80%). Выпавший осадок ПС используются для образования аналитического сигнала.
2. Сырье предварительно обрабатывают этанолом или ацетоном для удаления свободных моно- и олигосахаридов, затем ПС извлекают водой и проводят аналитические процедуры, не применяя осаждения.
с , % и неї’
81
71
62
52
33
24
14
5
с на’ %
Рис. 3. Влияние температуры реакционной смеси: IH (1), Inu (2)
Рис. 4. Растворимость 1пи в водно-спиртовых смесях: холодное (■) и горячее (▲) фильтрование; сплошная линия -растворимость 1пи, прерывистая линия -нерастворимый остаток
Методики первого типа широко распространены в фитохимическом анализе. ПФр, и частности Inu, относятся к слабоседиментирующимся ПС; этанол, ацетон, соли лития не позволяют проводить осаждение количественно [16-18]. Поэтому для анализа ПФр предпочтительнее применение методик второго типа.
Известно, что в корневищах и корнях девясила высокого помимо связанной формы Frc (ПФр), высоко ее содержание в свободном виде, а также в виде олигомеров - до 10-25% [19]. Экстракция этанолом позволила бы удалить эти компоненты, но для выяснения адекватности проведения этой процедуры, а также концентрации этанола необходимо определить растворимость инулина в водно-спиртовых растворах. Литературные данные, касающиеся этого вопроса, отсутствуют.
Установлено, что при применении холодного фильтрования Inu не растворяется в 95% этаноле, в 80% этаноле растворимость Inu не превышает 8 мкг/мл (рис. 4, табл. 2). При горячем фильтровании Inu проявляет растворимость уже в 95% этаноле - до 13 мг/мл. Уровни 50% растворимости Inu приходятся на концентрацию этанола 61,90 и 65,80% соответственно для холодного и горячего фильтрования. Таким образом, для проведения процедуры удаления Frc и ее олигомерных производных необходимо применение холодного фильтрования и концентрация этанола не ниже 95%.
При исследовании динамики экстракции низкомолекулярных углеводов из сырья установлено, что 3-кратная экстракция 95% этанолом при 100°С позволяет извлечь данную группу компонентов практически полностью (рис. 5). Остаточное содержание Frc не превышает 0,2%.
ВЭТСХ анализ спиртовых извлечений сырья показал присутствие Frc, Sac и Glc в количестве 40-42, 3135, 20-24% от суммарного содержания свободных углеводов соответственно (рис. 6). Содержание компонентов с более высокой степенью полимеризации не превышает 2-4%.
Таблица 2. Растворимость Inu в водно-спиртовых смесях
Концентрация этанола, % Растворимость Inu, мг/мл
холодное фильтрование горячее фильтрование
95 0,000 0,013
80 0,008 0,053
60 0,582 0,697
40 0,939 0,979
20 1,013 нацело
0 нацело
Рис. 5. Динамика экстракции низкомолекулярных углеводов. Контакт фаз: первый, 1 : 100 (■), второй, 1 : 100 (▲), третий, 1 : 50 (•)
Рис. 6. ВЭТСХ-денситограмма спиртового извлечения корневищ с корнями девясила высокого: Sac (1), Glc (2), Frc (3)
Выводы
Для определения полифруктанов в растительном сырье предложен ряд методик, отличающихся условиями проведения. Для установления оптимальных условий проведения аналитической реакции проведены исследования по изучению состава реакционной смеси. Определено, что в состав реакционной смеси должны входить 15% HCl, 52% этанол, что, в свою очередь, позволяет добиться максимальной оптической плотности. Введение тиомочевины замедляет процесс разрушения аналитического компонента.
Определено, что инулин обладает частичной растворимостью в водных растворах этанола различной концентрации. 50% растворимость наблюдается уже для растворов этанола с концентрацией 61-65%, поэтому при проведении процедур подготовки растительного сырья для анализа правильно использовать только 95% растворы экстрагента, который при 3-кратной экстракции позволяет практически полностью извлечь низкомолекулярные углеводы.
Список литературы
1. Растительные ресурсы СССР. Семейство Asteraceae / ред. П.Д. Соколов. СПб., 1993. 351 с.
2. Suzuki T., Hara H. Mechanism of the activation of calcium transport by DFAIII // Abstr. V International Fructan Symposium. Cuba, 2004. P. 122.
3. Отт В.Д., Мукыч О.М. Сучасш дашпро роль пребютиюв в дитячому харчуванш // Проблеми харчування. 2005. №5. С. 2-5.
4. Erdei A. Enhancement of the immune response by y-inulin // Abstr. IX Seminar on Inulin. Hungary, 2002. P. 10-11.
5. Государственная фармакопея СССР. XI издание. Вып.2. М., 1990. 398 с.
6. Литвинова Л.С., Калинина К.Б. Разделение и определение продуктов гидролиза камедей с использованием тон-
кослойной хроматографии // Журнал аналитической химии. 1997. Т. 52. №9. С. 987-991.
7. Коренман И.М. Фотометрический анализ органических соединений. М., 1975. 358 с.
8. Roe J.H. A colorimetric method for the determination of fructose in blood and urine // The Journal of Biological Chemistry. 1934. V. 107. P. 15-22.
9. Bacon J.S.D., Bell D.J. Fructose and glucose in the blood of the foetal sheep // Biochemical Journal. 1948. V. 42. P. 397-405.
10. Roe J.H., Epstein J.H., Goldstain N.P. A photometric method for the determination of inulin in plasma and urine // The Journal of Biological Chemistry. 1949. V. 187. P. 839-845.
11. Kulka R.G. Colorimetric estimation of ketopentoses and ketohexoses // Biochemical Journal. 1956. V. 63. P. 542-548.
12. Методы биохимического исследования растений / ред. А.И. Ермаков. Л., 1987. 430 с.
13. Khan M.A., Iqbal Z., Jan M.R., Shan J., Ahmad W., Haq Z.U., Obaidulla Spectrophotometric method for the quantita-
tive determination of lactulose in pharmaceutical preparations // Журнал аналитической химии. 2006. Т. 61. №1. С. 37-41.
14. Свиридов А.Ф., Чижов О.С. Химические методы частичного расщепления полисахаридов // Биоорганическая химия. 1976. Т. 2. №3. С. 315-350.
15. Shahidullah M., Khorasani S.S.M.A. The sensitivity and selectivity of the Seliwanoff test for fructose // Analytica Chimica Acta. 1972. V. 61. P. 317-319.
16. Thaysen A.C., Backer W.E., Green B.M. LII. On the Nature of the Carbohydrates Found in the Jerusalem Artichoke // The Biochemical Journal. 1929. V. 23. №3. P. 444-455.
17. Bacon J.S.D., Edelman J. The Carbohydrates of the Jerusalem Artichoke and Other Compositae // The Biochemical Journal. 1951. V. 48. №1. P. 114-126.
18. Bell D.J., Palmer A. Structural Studies on Inulin from Inula helenium and on Levans from Dactylis glomerata and Lo-lium italicum // Journal of Biochemical Society. 1952. P. 3763-3770.
19. Багаутдинова Р.И., Федосеева Г.П., Оконешникова Т.Ф. Фруктозосодержащие углеводы растений разных семейств - локализация и состав // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровские сообщения. 2005. №5. С. 13-16.
Поступило в редакцию 24 марта 2007 г.
После переработки 12 октября 2007 г.
