CC BY
209
УДК 543.854.75 + 582.751.42
МЕТОДИКА КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУММАРНОГО СОДЕРЖАНИЯ ПОЛИСАХАРИДОВ В СЕМЕНАХ ЛЬНА (LINUM USITATISSIMUM L.)
*
© Д.Н. Оленников , Л.М. Танхаева
Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, ул. Сахьяновой, 6, Улан-Удэ, 670047 (Россия). E-mail: [email protected]
Разработана методика количественного определения суммарного содержания полисахаридов в семенах льна с относительной ошибкой не более 2%. Проведенный метрологический анализ показал, что методика является правильной и воспроизводимой. Содержание полисахаридов в семенах льна в пересчете на ксилозу находится в пределах 4,20-7,23%.
Сокращения: ПС - полисахариды; ВРПС - водорастворимые полисахариды; Ara - арабиноза; Gal - галактоза; GalUA - галактуроновая кислота; Glc - глюкоза; Xyl - ксилоза.
Введение
Ранее нами рассмотрена возможность модификации антронового метода Дрейвуда для спектрофотометрического определения углеводов, результатом которой является увеличение точности и воспроизводимости получаемых результатов [1]. С применением разработанных подходов создан ряд методик количественного анализа полисахаридов в растительном сырье [2-4].
Семена льна - официнальное лекарственное сырье, качество которого регламентируется Государственной фармакопеей [5], которая не предлагает методик количественного анализа. Целью настоящей работы является разработка методики количественного определения суммарного содержания ПС в семенах льна, которая в дальнейшем может быть использована для регламентирования показателей качества данного вида растительного сырья.
Экспериментальные условия
Семена льна приобретены через аптечную сеть: ОАО «СТ-Медифарм», серия 040205 (1), серия 060406 (2); ОАО «Красногорсклексредства», серия 010604 (3), серия 120106 (4); АО «Агроберес», серия 150704 (5), серия 120405 (6); ООО «Природа фарма», серия 240605 (7). В качестве стандартных образцов использовали ксилозу (Acros Organics, > 99%) и глюкозу (Roquette, > 99%). Спектры поглощения регистрировали на приборе Cecil CE 2011. Хроматографический анализ проводили, как описано ранее [6], исследование процесса гидролиза - по методу [2].
Комплекс ВРПС выделяли из цельных семян льна экстракцией 1% раствором NaCl (модуль 1 : 70) в условиях кипящей водяной бани в течение 1 ч. Экстракцию повторяли еще два раза. Объединенное извлечение концентрировали до 1/10 объема; ПС осаждали 90% этанолом (1 : 5), осадок отделяли центрифугированием и высушивали сменой растворителей. Продукт очищали переосаждением из воды, минеральную часть удаляли с применением КУ-2 (Н+-форма), белковые компоненты - по методу Севага. Характеристика конечного продукта: углеводы - 98,54±2,14%, зольность - < 0,2%, белок - < 0,5%.
* Автор, с которым следует вести переписку.
Методика количественного определения суммарного содержания полисахаридов в семенах льна в пересчете на ксилозу. Около 1 г (точная навеска) сырья помещают в коническую плоскодонную колбу вместимостью 100 мл с притертой пробкой, приливают 70 мл 1% раствора натрия хлорида в воде очищенной, нагревают содержимое колбы на кипящей водяной бане в течение 1 ч. После охлаждения извлечение фильтруют в мерную колбу вместимостью 200 мл. Извлечение повторяют в тех же условиях еще раз и доводят объем объединенного фильтрата до метки водой очищенной (раствор А).
2 мл раствора А переносят в центрифужную пробирку, приливают 6 мл 95% этилового спирта, перемешивают и нагревают на водяной бане в течение 10 мин. После охлаждения содержимое пробирки центрифугируют в течение 10 мин со скоростью вращения 3000 об/мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок суспендируют с 5 мл 95% этанола и повторно центрифугируют в тех же условиях. Надосадочную жидкость сливают, осадок продувают в пробирке горячим воздухом до удаления следов этанола. К осадку приливают 4 мл реактива, нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин. Содержимое пробирки после охлаждения переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл 95% спиртом этиловым и доводят до метки тем же растворителем (раствор Б).
Оптическую плотность раствора Б измеряют на спектрофотометре при длине волны 430 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют 4 мл реактива, выдержанные в тех же условиях, что и опытная смесь.
Содержание полисахаридов (Х, %) в пересчете на ксилозу и абсолютно сухое сырье рассчитывают по формуле:
с • kV • 0.91 100
X —----------6-------------100,
m-106 100 - W
где с - содержание ксилозы в растворе Б, найденное по градуировочному графику, мкг/мл; k - коэффициент разбавления (2500); 0,91 - коэффициент гидролиза; 106 - коэффициент пересчета микрограммов в граммы; m - масса навески сырья, г; W - потеря в массе при высушивании сырья, %.
Реактив готовят следующим образом: 100 мг антрона (МРТУ 6-09-1214-64), предварительно перекри-сталлизованного из бензола, помещают в мерную колбу вместимостью 200 мл и доводят до метки кислотой серной концентрированной (ГОСТ 4204-77, р ~ 1,83). Срок годности раствора 5 ч.
Построение градуировочных графиков. Около 100 мг ксилозы или глюкозы (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в воде очищенной и доводят до метки тем же растворителем (раствор А). В пробирки вносят 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 мл раствора А и доводят до объема 0,6 мл водой очищенной, приливают 4 мл реактива, нагревают на кипящей водяной бане в течение 10 мин. После охлаждения содержимое пробирок переносят в мерные колбы вместимостью 25 мл 95% спиртом этиловым и доводят до метки тем же растворителем (раствор Б). Оптическую плотность растворов Б измеряют на спектрофотометре при длине волны 430 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют смесь 4 мл реактива и 0,6 мл воды очищенной, выдержанную в тех же условиях, что и опытная смесь. Градуировочный график строят в системе координат концентрация ксилозы (мкг/мл) - оптическая плотность.
При проведении эксперимента с применением в качестве стандартного образца глюкозы в числитель расчетной формулы вводится дополнительный коэффициент пересчета, равный 1,22.
Метрологический анализ результатов проводили согласно рекомендациям Государственной фармакопеи и др. [7, 8]. Инструментальную ошибку спектрофотометра (Кнотр) рассчитывали по бихромату калия [9]. Регрессионный анализ выполняли с применением пакета программ Advanced Grapher ver. 2.07 (Alentum Software Inc.).
Результаты и их обсуждение
Ранее различными исследователями установлено, что во всех случаях доминирующим моносахаридом гидролизата ПС-комплекса семян льна является Xyl [10-12], поэтому все расчеты проводили в пересчете на это соединение. При анализе спектров поглощения продуктов взаимодействия ВРПС семян льна, Xyl и Glc с антроном в концентрированной серной кислоте в среде спирта этилового установлено, что они обладают общим максимумом при 430 нм, который выбран в качестве аналитической длины волны (рис. 1).
1.0
0.5
350 450 550 650 ,
А, НМ
Рис. 1. Спектры поглощения Glc (1), Xyl (2) и ВРПС семян льна (3)
Интенсивность оптической плотности для растворов Xyl на 22% выше, чем у Glc. Последняя, в отличие от Xyl, более доступный реактив, поэтому после введения дополнительного расчетного коэффициента (1,22) возможно ее использование в качестве стандартного вещества. Линейность оптической плотности в диапазоне 0,2-0,7 опт.ед. наблюдается для растворов Xyl и Glc с концентрациями 4-16 и 5-19 мкг/мл соответственно. Уравнения линейной регрессии имеют вид АХу1 = 0,0428505-cX'1 + 0,0222 (г2 = 0,9988, s2 = 2,04-10-2) и AGlc = 0,0378621-cGlc + 0,0064 (г2 = 0,9997, s2 = 6,95-10-3) (^инс1р 0,98).
Ранее Беляковым [13] предложена методика количественного анализа семян льна, использующая водную экстракцию при комнатной температуре с применением пикратного метода, заключающегося в способности моносахаридов, образующихся в результате гидролиза ПС 8,5% кислотой хлористоводородной, восстанавливать пикриновую кислоту до пикрамовой. Нами проведено сравнительное исследование предлагаемых условий и оптимальных параметров, выбранных нами. Как было показано ранее [14], холодная экстракция водой не позволяет получить максимальный выход ПС; их содержание ниже в 3-4 раза, чем при экстракции 1% раствором NaCl на кипящей водяной бане.
При попытке воспроизведения гидролиза в среде 8,5% кислоты хлористоводородной в качестве гидролизующего агента наблюдается неполная деградация полимеров - 52% (рис. 2). Известно, что ксиланы являются наиболее гидролитически устойчивым типом ПС, расщепление которых возможно только с применением таких агентов, как кислоты серная, азотная, трифторуксусная и др. [15, 16].
В суммарном гидролизате обнаружены Gal, Glc, Ara, следы GalUA и Xyl, т.е. расщеплению подвергаются в основном галактоглюканы и лишь частично галактуронаны и арабиноксиланы, причем у последних отщепляется только Ara боковых цепей. Экспериментальными исследованиями по выбору гидролизующего агента установлено, что при использовании кислоты серной концентрированной ПС-комплекс семян льна распадается полностью в течение 10 мин.
Метрологический анализ разработанной методики проведен с применением экспериментов методами «введено-найдено», независимых определений, а также проведен анализ стандартных образцов Xyl и Glc.
При исследовании методики методом «введено-найдено» установлено, что величина относительной ошибки не превышает 3% и не зависит от природы стандартного вещества (табл. 1, 2). Разброс значений ошибок при использовании Xyl и Glc лежит в одной области. Аналогичный эксперимент с использованием суммарного ПС-комплекса в качестве добавки показал наличие относительной ошибки не более 2% (табл. 3).
Отклонение от среднего в серии из трех независимых определений ПС в семенах льна не превышает 2%, что свидетельствует об удовлетворительной воспроизводимости методики (табл. 4).
В эксперименте со стандартными образцами Xyl и Glc установлено, что относительная ошибка единичного измерения находится в интервалах 0,45-3,18% (Xyl) и 0,00-1,98% (Glc) и может быть как положительной, так и отрицательной (табл. 5, 6). Средние ошибки из трех определений для трех образцов находятся в достаточно узких пределах 1,09-2,55% (Xyl) и 1,04-1,26% (Glc).
Метрологические характеристики разработанной методики приведены в таблице 7.
А. опт.ед.
2
О 5 10 15 20 25 30
Время гидролиза, мин
Рис. 2. Динамика гидролиза ПС-комплекса семян льна в средах 8,5% кислоты хлористоводородной (1) и концентрированной серной (2)
Таблица 1. Метод «введено-найдено» : Ху1
№ ПС в аликвоте, мкг Ху1 Введено Ху1, мкг Теоретическое содержание ПС, мкг Ху1 Найдено ПС, мкг Ху1 Ошибка
абс., мкг отн., %
1 6,52 1,42 7,94 7,72 -0,22 2,77
2 6,52 2,84 9,36 9,41 +0,05 0,53
3 6,52 4,26 10,78 10,51 -0,27 2,51
4 6,52 5,68 12,20 12,09 -0,11 0,90
5 6,52 7,10 13,62 13,79 +0,17 1,25
Таблица 2. Метод «введено-найдено» : в1е
№ ПС в аликвоте, мкг Ху1 Введено О1о, мкг Теоретическое содержание ПС, мкг Ху1* Найдено ПС, мкг Ху1 Ошибка
абс., мкг отн., %
1 6,29 1,67 8,33 8,40 +0,07 0,84
2 6,29 3,34 10,37 10,59 +0,22 2,12
3 6,29 5,01 12,40 12,28 -0,12 0,97
4 6,29 6,68 14,44 14,04 -0,40 2,77
5 6,29 8,35 16,48 16,21 -0,27 1,64
*с учетом коэффициента пересчета (1,22)
Таблица 3. Метод «введено-найдено» : суммарный ПС-комплекс
№ ПС в аликвоте, мкг Ху1 Введено ПС, мкг Ху1 Теоретическое содержание ПС, мкг Ху1 Найдено ПС, мкг Ху1 Ошибка
абс., мкг отн., %
1 7,12 1,23 8,35 8,46 +0,11 1,32
2 7,12 2,46 9,58 9,44 -0,14 1,46
3 7,12 3,69 10,81 10,88 +0,07 0,65
4 7,12 4,92 12,04 12,28 +0,24 1,99
5 7,12 6,15 13,27 13,47 +0,20 1,51
Таблица 4. Метод независимых определений
№ пробы Повторность Содержание ПС в пересчете на Ху1, % Среднее, % Отклонение от среднего, %
1 1 / 2 / 3 5,48 / 5,46 / 5,42 5,45 +0,55 / +0,18 / -0,55
2 1 / 2 / 3 4,48 / 4,52 / 4,42 4,47 +0,22 / +1,12 / -1,22
3 1 / 2 / 3 5,02 / 4,87 / 4,92 4,94 +1,62 / -1,42 / -0,40
Таблица 5. Анализ стандартного образца Xyl
№ Повторность Xyl в аликвоте, мкг Найдено Xyl, мкг Ошибка относительная, %
единичного определения средняя
1 1 / 2 / 3 157 154 / 153 / 152 -1,91 / -2,5 / -3,18 2,55
2 1 / 2 / 3 214 210 / 216 / 215 -1,87 / +0,94 / +0,45 1,09
3 1 / 2 / 3 412 420 / 406 / 405 +1,46 / -1,46 / -1,70 1,54
Таблица 6. Анализ стандартного образца Glc
№ Повторность Glc в аликвоте, мкг Найдено Glc, мкг Ошибка относительная, %
единичного определения средняя
1 1 / 2 / 3 212 208 / 214 / 216 -0,94 / +0,94 / +1,89 1,26
2 1 / 2 / 3 354 361 / 354 / 358 +1,98 / 0,00 / +1,13 1,04
3 1 / 2 / 3 507 499 / 498 / 509 -1,58 / -1,78 / +0,40 1,25
Таблица 7. Метрологические характеристики разработанной методики (n = 6, P = 0,95, tP,f = 2,57)
Сырье* х, % 52 5Х ±Дх, % E, %
1 5,03 2,47-10-3 1,57-10-2 0,04 0,80
2 4,86 7,70-10-3 2,78-10-2 0,06 1,23
3 4,43 4,49-10-3 2,12-10-2 0,05 1,13
4 4,20 2,27-10-3 1,9510-2 0,05 1,19
5 7,01 4,45-10-3 2,72-10-2 0,07 1,00
6 7,23 3,27-10-3 8,3010-3 0,06 0,83
7 6,45 4,45-10-3 1,0910-2 0,07 1,09
* Производители указаны в экспериментальной части.
С применением разработанной методики проанализировано семь партий сырья. Установлено, что содержание ПС в семенах льна может составлять 4,20-7,23%, поэтому в качестве нижнего порога содержания выбрана величина 4%.
Выводы
Семена льна (Linum usitatissimum L.) - официнальное растительное сырье, качество которого регламентируется Государственной Фармакопеей. Наряду с другими БАС действующим классом, обуславливающим фармакологическую активность семян льна, являются ПС. Ранее для определения количественного содержания ПС была предложена методика, использующая пикриновый метод, которая не позволяет адекватно оценивать количество ПС в сырье.
Разработана методика, использующая солевой экстрагент с последующим спектрофотометрическим определением содержания ПС с применением модифицированного метода Дрейвуда. Метрологический анализ показал, что разработанная методика обладает удовлетворительным уровнем правильности и воспроизводимости. Для сохранения принципа адекватности определения анализируемого компонента (ксиланы) предложено вести расчет содержания ПС в пересчете на ксилозу. Показано, что в качестве стандартного вещества допустимо использование глюкозы с предварительным введением поправочного коэффициента, учитывающего различие в интенсивностях оптических плотностей.
Список литературы
1. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Спектры поглощения углеводов и родственных соединений в серной кислоте // Химия природных соединений. 2006. №1. С. 218-220.
2. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Применение метода Дрейвуда для количественного анализа листьев Plantago major L. // Химия природных соединений. 2006. №1. С. 221-223.
3. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Разработка способа получения экстракта подорожника большого сухого // Химия растительного сырья. 2006. №1. С. 47-53.
4. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Новые подходы к стандартизации листьев подорожника большого // Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья: материалы II Всероссийской конференции. Кн. 2. Барнаул, 2005. С. 456-458.
5. Государственная фармакопея СССР. XI издание. Вып.2. М., 1990. 398 с.
6. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М., Николаева Г.Г., Цыренжапов А.В., Николаев С.М., Чехирова Г.В. Биологически активные вещества листьев Cacalia hastata L. 1. Углеводы листьев Cacalia hastata L. и их гипогликемиче-ская активность // Химия природных соединений. 2004. №1. С. 4-9.
7. Александров Ю.И., Беляков В.И. Погрешность и неопределенность результата химического анализа // Журнал аналитической химии. 2002. Т. 57. №2. С. 118-129.
8. Смагунова А.Н. Способы оценки правильности результатов анализа // Журнал аналитической химии. 1997. Т. 52. №10. С. 1022-1029.
9. Харитонов Ю.Я. Аналитическая химия (аналитика). Кн.2. М., 2001. 398 с.
10. Warrant! J., Michaud P., Picton L., Muller G., Courtois B., Ralainirina R., Courtois J. Flax (Linum usitatissimum) seed cake: A potential source of high molecular weight arabinoxylans // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2005. V. 53. №5. P. 1449-1459.
11. Warrand J., Michaud P., Picton L., Muller G., Courtois B., Ralainirina R., Courtois J. Structural investigation of the neutral polysaccharide of Linum usitatissimum L. seed mucilage // International Journal of Biological Maromolecules. 2005. V. 35. №3-4. P. 121-125.
12. Davis A.E., Derouet C., Herve Du Penhoat C., Morvan C. Isolation and NMR study of pectins from flax (Linum usitatissimum L.) // Carbohydrate Research. 1990. V. 197. P. 205-215.
13. Беляков К.В. Методологические подходы к определению биологически активных веществ в лекарственном растительном сырье спектрофотометрическим методом. М. , 2004. 186 с.
14. Оленников Д.Н., Танхаева Л.М. Исследование процесса экстракции полисахаридов семян льна (Linum usitatissimum L.) // Химия растительного сырья. 2007. №4. С. 79-83.
15. Свиридов А.Ф., Чижов О.С. Химические методы частичного расщепления полисахаридов // Биоорганическая химия. 1976. Т. 2. №3. С. 315-350.
16. Новосельская И.Л., Воропаев Н.Л., Семенова Л.Н., Рашидова С.Ш. Пектин. Тенденции научных и прикладных исследований // Химия природных соединений. 2000. №1. С. 3-11.
Поступило в редакцию 24 марта 2007 г.
После переработки 12 октября 2007 г.
