CC BY
20
© Коллектив авторов, 2021
Никольский А. А.1, Шиловский И.П.1, Юмашев К.В.1' 2, Вишнякова Л.И.1, Барвинская Е.Д.1, Ковчина В.И.1, Корнеев А.В.1' 2, Туренко В.Н.1, Каганова М.М.12, Брылина В.Е.2, Никонова А.А.1, Козлов И.Б.1, Кофиади И.А.1, Сергеев И.В.1, Маерле А.В.1, Петухова О.А.1, Кудлай Д. А.1' 3, Хаитов М.Р.1 4
Влияние локального подавления экспрессии гена Stat3 на нейтрофильное воспаление легких в экспериментальной модели на мышах
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация
2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА имени К. И. Скрябина Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, 109472, г. Москва, Российская Федерация
3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), 119991, г. Москва, Российская Федерация
4 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 117997, г. Москва, Российская Федерация
Резюме
Введение. Бронхиальная астма (БА) - это хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей. Длительное время считалось, что БА развивается исключительно по ТЬ2-зависимому механизму, однако к настоящему времени выделяют несколько фенотипов заболевания, один из них - нейтрофильная БА. У таких пациентов болезнь характеризуется резистентностью к стандартной терапии глюкокортикостероидами, определяя необходимость создания новых способов терапии. Нейтрофильное воспаление легких при БА протекает по ИЛ-6/8ТАТ3-зависимому механизму, что делает компоненты этого сигнального пути перспективными терапевтическими мишенями. Один из способов, посредством которого можно регулировать экспрессию генов, - это интерференция РНК.
Цель данного исследования - оценить эффекты локального подавления экспрессии гена Stat3 на модели нейтрофильной БА у мышей.
Материал и методы. На фоне развития признаков нейтрофильной БА мышам ингаляционным способом вводили комплекс молекул малых интерферирующих РНК (миРНК) и пептида-носителя. После курса ингаляций у животных оценивали степень выраженности основных проявлений БА: уровень аллерген-специфических антител, изменение гиперреактивности бронхов, клеточный состав бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ), гистопатологические изменения в легких.
Результаты. Осуществлен дизайн 5 вариантов молекул миРНК против гена Stat3 и в экспериментах in vitro показано, что вариант siSTAT3-1426 в 5 раз снижал экспрессию целевого гена. Создан комплекс молекул миРНК и пептида-носителя LTP, который подавлял экспрессию генов Stat3 и Il17a в ТЫ7-лимфоцитах. В исследованиях in vivo на модели нейтрофильной БА у мышей показано, что 3-кратное ингаляционное введение этого комплекса приводило к подавлению экспрессии гена Stat3 в клетках БАЛ в 2 раза и, как следствие, к ослаблению ТЫ7-иммунного ответа, а в итоге - к 3-кратному снижению инфильтрации легких нейтрофилами и восстановлению толщины стенок бронхов.
Заключение. Создан комплекс молекул миРНК, направленных против гена Stat3, и пептида-носителя, ингаляции которым приводят к уменьшению ТЫ7-зависимого ней-трофильного воспаления легких в модели нейтрофильной БА у мышей. Применение созданного комплекса может быть многообещающим подходом к терапии нейтрофильной кортикостероид-резистентной БА.
Ключевые слова: нейтрофильная бронхиальная астма; РНК-интерференция; Stat3
Для корреспонденции
Никольский Александр Аркадьевич -младший научный сотрудник лаборатории противовирусного иммунитета
ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: aa.nikolskii@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-4169-0760
Статья получена 15.09.2021. Принята в печать 17.11.2021.
Для цитирования: Никольский А.А., Шиловский И.П., Юмашев К.В., Вишнякова Л.И., Барвинская Е.Д., Ковчина В.И., Корнеев А.В., Туренко В.Н., Каганова М.М., Брылина В.Е., Никонова А.А., Козлов И.Б., Кофиади И.А., Сергеев И.В., Маерле А.В., Петухова О.А., Кудлай Д.А., Хаитов М.Р. Влияние локального подавления экспрессии гена Stat3 на нейтрофильное воспаление легких в экспериментальной модели на мышах. Иммунология. 2021; 42 (6): 600-614. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-600-614
Финансирование. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта № 20-34-90151.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Nikolskii A.A.1, Shilovskiy I.P.1, Yumashev K.V.1, 2, Vishniakova L.I.1, Barvinskaia E.D.1, Kovchina V.I.1, Korneev A.V.1' 2, Turenko V.N.1, Kaganova M.M.1 2, Brylina V.E.2, Nikonova A.A.1, Kozlov I.B.1, Kofiadi I.A.1, Sergeev I.V.1, Maerle A.V.1, Petukhova О.А.1, Kudlay D.A.1 3, Khaitov M.R.1 4
Effect of local suppression of Stat3 gene expression
in a mouse model of pulmonary neutrophilic inflammation
1 National Research Center - Institute of Immunology, Federal Medical-Biological Agency of Russia, 115522, Moscow, Russian Federation
2 Moscow State Academy of Veterinary Medicine and Biotechnology - MVA named after K.I. Skryabin of the Ministry of Agriculture of the Russian Federation, 109472, Moscow, Russian Federation
3 I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of the Ministry of Health of the Russian Federation (Sechenov University), 119991, Moscow, Russian Federation
4 N.I. Pirogov Russian National Research Medical University (RNRMU) of the Ministry of Health of the Russian Federation, 117997, Moscow, Russian Federation
Abstract
Introduction. Bronchial asthma (BA) is a chronic inflammatory disease of the airways. For a long time, it was believed that BA developed exclusively according to the Th2-dependent mechanism, however, to date, several phenotypes of the disease have been distinguished, one of which is neutrophilic BA. Neutrophilic BA is characterized by resistance to standard corticosteroid therapy, that need to search for new way of treatment. Neutrophilic inflammation of the lungs is developed under activation of IL-6/STAT3-pathway, that makes the molecular components of this pathway to be the promising targets. One of the technologies by which genes expression can be regulated is RNA interference.
The aim of this study was to evaluate the effects of local suppression of Stat3 gene expression in a mouse model of neutrophilic BA.
Material and methods. During the development of BA features mice were inhaled with a complex of small interfering RNA (siRNA) and a carrier peptide. After the course of inhalations, the severity of BA manifestations was assessed: the level of allergen-specific antibodies, changes in bronchial hyperreactivity, the cellular composition of the bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, histopathological alterations in the lungs.
Results. 5 variants of siRNA against Stat3 gene were designed. In vitro experiments established that the variant siSTAT3-1426 significantly (5 times) reduced the expression of the target gene. A complex of siRNA and a carrier peptide LTP down-regulated the expression of Stat3 and Il17a genes in Th17-lymphocytes. In vivo studies in a mouse model of neutrophilic BA revealed, that the inhalations with the complex led to a 2-fold inhibition of Stat3 gene expression in BAL fluid cells, 3-fold decrease in neutrophilic infiltration of the lungs and recovery of the thickness of the airway walls.
Conclusion. The complex of siRNA targeted to Stat3 gene and the carrier peptide was developed. The inhalations with the complex decreased Th17-dependent neutrophilic inflammation of the lungs in neutrophilic BA model in mice, that can be a promising approach to the therapy of neutrophilic corticosteroid-resistant BA.
Keywords: neutrophilic bronchial asthma; RNA interference; Stat3
Received 15.09.2021. Accepted 17.11.2021.
For correspondence
Nikolskii Aleksandr Arkadievich -Junior Researcher of the Antiviral Immunity Laboratory, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: aa.nikolskii@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-4169-0760
For citation: Nikolskii A.A., Shilovskiy I.P., Yumashev K.V., Vishniakova L.I., Barvinskaia E.D., Kovchina V.I., Korneev A.V., Turenko V.N., Kaganova M.M., Brylina V.E., Nikonova A.A., Kozlov I.B., Kofiadi I.A., Sergeev I.V., Maerle A.V., Petukhova O.A., Kudlay D.A., Khaitov M.R. Effect of local suppression of Stat3 gene expression in a mouse model of pulmonary neutrophilic inflammation. Immunologiya. 2021; 42 (6): 600-14. DOI: https://doi. org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-600-614 (in Russian)
Funding. The study was supported by RFBR, project number 20-34-90151.
Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.
Введение
Бронхиальная астма (БА) - это гетерогенное хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей [1]. За последние десятилетия резко выросло количество больных БА; в отдельных странах заболеваемость достигает 15-18 % [2]. В России общее число больных БА приближается к 10 млн человек, что составляет около 7 % населения [3]. Стандартная терапия БА предусматривает применение кортикостероидов, ингибиторов лейкотриенов и бронходилататоров, которые снижают выраженность проявлений заболевания у значительной доли пациентов [1]. Успешно применяют аллерген-специфическую иммунотерапию [4], но она имеет свои ограничения (опасность возникновения нежелательных явлений, невозможность применения у пациентов с неаллергической БА) [5].
Длительное время считалось, что БА развивается исключительно по ТЬ2-зависимому механизму, в котором центральную роль играют ТЬ2-клетки, продуцирующие провоспалительные цитокины интерлейкин(ИЛ)-5, ИЛ-4 и ИЛ-13, активность которых приводит к формированию основных проявлений БА (эозинофильное воспаление легких, гиперреактивность бронхов, ремодели-рование дыхательных путей и пр.) [6].
К настоящему времени БА рассматривается как гетерогенное заболевание, включающее несколько фенотипов, один из них - нейтрофильная БА [7]. У пациентов с такой формой астмы воспаление легких связано с инфильтрацией дыхательных путей другими про-воспалительными клетками - нейтрофилами. Болезнь, как правило, протекает тяжело и характеризуется резистентностью к стандартной терапии глюкокортикосте-роидами [8]. Все это создает необходимость разработки новых способов терапии этой патологии. Исследования клеточных и молекулярных механизмов патогенеза данного фенотипа установили взаимосвязь степени тяжести БА и нейтрофильного воспаления легких, которое коррелировало с активацией ТЫ7-иммунного ответа, а также с повышенным содержанием ИЛ-17А, ИЛ-17Б и ИЛ-8 в мокроте [9].
Стоит отметить, что поляризация иммунного ответа в сторону ТЬ2-клеток происходит при активации сигнального пути ИЛ-4/8ТАТ6 [6], тогда как ТЫ7-клетки формируются при активации сигнального пути ИЛ-6/ 8ТАТ3 [10, 11]. В свою очередь ТЫ7-клетки секрети-руют цитокины ИЛ-17А, ИЛ-17Б, ИЛ-21 и ИЛ-22, которые приводят к развитию проявлений БА: нейтро-фильному воспалению легких, гиперсекреции слизи
и ремоделированию респираторного тракта [12]. Учитывая это, компоненты сигнального пути HH-6/STAT3 являются перспективными биомишенями для разработки новых лекарственных средств терапии кортико-стероид-резистентной БА.
Появляются новые способы регуляции активности генов, например основанные на интерференции РНК. Они заключаются в использовании молекул малых интерферирующих РНК (миРНК), способных сиквенс-специ-фично деградировать мРНК целевых генов, включая гены, вовлеченные в воспаление легких [13]. Главная проблема, затрудняющая использование молекул миРНК, -сложность их доставки в клетки-мишени [14]. Для доставки миРНК к месту их биологического эффекта применяют так называемые векторы, липосомы [15], полимеры и пептиды [16, 17]. В данном исследовании изучались антивоспалительные свойства комплекса, состоящего из молекул миРНК, направленных против гена, кодирующего STAT3, и катионного пептида LTP, на модели нейтрофильной БА у мышей [18].
Материалы и методы
Проектирование и синтез миРНК. При помощи программного обеспечения OligoWalk (http://rna.urmc. rochester.edu/cgi-bin/server_exe/oligowalk/oligowalk_ form.cgi) были спроектированы последовательности миРНК, направленные к гену Stat3 мыши (табл. 1) [19]. Синтез осуществлен с использованием автоматического синтезатора Oligo Pilot 10 (Cytiva, США).
Скрининг активности миРНК in vitro. Для скрининга активности миРНК in vitro в 24-луночный планшет засевали 100 тыс. клеток L929 (фибробласты мыши) в полной питательной среде DMEM (Gibco, США) [10 % фетальной бычьей сыворотки (Biosera, Филиппины), 2 % буферного раствора HEPES («ПанЭко», Россия), 0,1 % антибиотика гентамицина (Gibco, США), 0,6 % L-глутамина («ПанЭко», Россия)] и инкубировали 1 сут при 37 оС в СО2-инкубаторе до достижения 75 % конфлюэнтности. Затем заменяли среду на бессывороточную DMEM (Gibco, США) [2 % буферного раствора HEPES, 0,1 % антибиотика гентамицина, 0,6 % L-глутамина]. Трансфекцию 1 мкг миРНК против гена Stat3 проводили в бессывороточной среде OPTIMEM (Gibco, США) при помощи трансфекционного агента Lipofectamine 2000 (Invitrogen, США), объем смеси составлял 100 мкл. В качестве контроля также трансфе-цировали миРНК к гену Gfp (green fluorescent protein). Приготовленную смесь выдерживали 15 мин при
Таблица 1. Варианты миРНК, направленных против гена Stat3
миРНК Последовательность Предсказанная эффективность, % Сходство с другими генами мыши, %
siSTAT3-465 UUUCUGUUCUAGAUCCUGCtt 96 84
siSTAT3-930 UAAGUUUCUGAACAGCUCCtt 94 84
siSTAT3-1426 UAUACCACAGGAUUGAUGCtt 94 79
siSTAT3-1826 UUGCUGCUCUCGCUGAAGCtt 95 84
siSTAT3-2492 UUAUCACCCACACUCACUCtt 96 84
комнатной температуре и вносили в лунки с монослоем клеток. Клетки инкубировали при 37 оС в СО2-инкубаторе. Через 4 ч в каждую лунку добавляли 50 мкл 10 % фетальной бычьей сыворотки (ФБС) (Biosera, Филиппины). После этого клетки инкубировали при 37 оС в СО2-инкубаторе в течение 24 ч. Затем из лизатов клеток выделяли тотальную РНК и анализировали экспрессию мРНК Stat3.
Исследование активности комплекса миРНК/ пептид in vitro. Проведено исследование активности комплекса, состоящего из миРНК против гена Stat3 и пептида-носителя LTP (siSTAT3/LTP) в экспериментах in vitro. Активность исследовалась на 2 типах клеток: L929 и Th17-клетках мыши. Для этого клетки L929 засевали в 24-луночный планшет в количестве 100 тыс. клеток на лунку в 600 мкл полной питательной среды DMEM (Gibco, США). Накануне трансфекции клетки инкубировали 1 сут при 37 оС в СО2-инкубаторе до достижения 75 % конфлюэнтности. Перед внесением трансфекционной смеси в лунках с клетками заменяли полную питательную среду DMEM на бессывороточную среду DMEM. Смесь трансфекционного агента общим объемом 100 мкл, состоящего из миРНК против гена Stat3 или Gfp (в качестве контроля) (1, 2 и 4 мкг), а также пептида LTP (12,5; 25 и 50 мкг соответственно), готовили в бессывороточной среде OPTIMEM (Gibco, США). В качестве еще одного контроля использовали коммерческий трансфекционный агент Lipofectamine 2000 (Invitrogen, США). Приготовленную смесь выдерживали 15 мин при комнатной температуре и вносили в лунки с монослоем клеток. Клетки инкубировали при 37 оС в СО2-инкубаторе. Через 4 ч в каждую лунку добавляли 50 мкл 10 % ФБС. После этого клетки инкубировали при 37 оС в СО2-инкубаторе в течение 24 ч и затем из лизатов клеток выделяли тотальную РНК и анализировали экспрессию мРНК Stat3.
Дополнительно активность комплекса siSTAT3/LTP была изучена на !Ы7-клетках мыши. Для этого предварительно выделяли наивные Т-лимфоциты из селезенок мышей с помощью клеточной сортировки и индуцировали их дифференцировку в 1Ы7-клетки.
Селезенки отбирали у мышей, умерщвленных методом цервикальной дислокации, и помещали в 12-луноч-ный планшет в 1,5 мл натрий-фосфатного буфера («Пан-Эко», Россия) с 3 % ФБС. Ткань селезенки измельчали и переносили в 15 мл пробирку с 150 мкл коллагеназы (Collagenase from Clostridium histolyticum Type IA -20 мг/мл - Sigma, США) и 150 мкл ДНКазы (Dnase I -
300 ед/мл - Invitrogen, США). Инкубировали на шей-кере 30 мин при 37 °C. Затем фильтровали через сито с диаметром пор 40 мкм (Corning, США). Полученную суспензию клеток дважды отмывали 3 мл натрий-фосфатного буфера с 3 % ФБС. Для этого центрифугировали при 300g 7 мин при комнатной температуре с последующим отбором осадка клеток, который затем ресуспендировали в 3 мл натрий-фосфатного буфера с 3 % ФБС. Далее анализировали на проточном цито-метре FACSAria (BD, США), где из общего пула клеток отбирали только те, которые несли CD4 и CD62L и на которых отсутствовали CD44 и CD25. Эти клетки и представляют собой наивные T-лимфоциты. Затем клетки помещали в 96-луночный планшет с предварительно (за 4 ч) сорбированными анти-CD3-антителами (10 мкг/мл). Для поляризации наивных Т-лимфоцитов в Th17 добавляли анти-CD28-антитела, ИЛ-6 и трансформирующий фактор роста ß (ТФРß). К контрольным клеткам добавляли только анти-CD28-антитела. Через 72 ч собирали супернатанты и лизаты клеток. Из последних выделяли тотальную РНК и анализировали экспрессию мРНК Il17a и Stat3.
Установлено, что стимулированные !Ы7-клетки характеризовались повышенной экспрессией генов Il17a и Stat3. Кроме того, методом иммунофермент-ного анализа (ИФА) был выявлен значительный уровень продукции белка HH-17A в супернатантах Th17-клеток. Контрольные и стимулированные клетки имели различный фенотип, наблюдаемый при световой микроскопии.
Для изучения активности siSTAT3/LTP 1Ы7-клетки высевали в 24-луночный планшет в количестве 100 тыс. клеток на лунку в 600 мкл полной питательной среды RPMI 1640 (Gibco, США). Накануне трансфекции клетки инкубировали 1 сут при 37 оС в СО2-инкубаторе до достижения 75 % конфлюэнтности. Перед внесением трансфекционной смеси в лунках с клетками заменяли полную питательную среду RPMI 1640 на бессывороточную среду RPMI 1640. Смесь трансфекционного агента общим объемом 100 мкл, состоящего из миРНК против гена Stat3 или Gfp (в качестве контроля) (1, 2 и 4 мкг), а также пептида LTP (12,5; 25 и 50 мкг соответственно), готовили в бессывороточной среде OPTIMEM (Gibco, США). В качестве еще одного контроля использовали коммерческий трансфекционной агент Lipofectamine 2000 (Invitrogen, США). Приготовленную смесь выдерживали 15 мин при комнатной температуре и вносили в лунки с монослоем клеток. Клетки инкуби-
ровали при 37 оС в СО2-инкубаторе. Через 4 ч в каждую лунку добавляли 50 мкл 10 % ФБС. После этого клетки инкубировали при 37 оС в СО2-инкубаторе в течение 24 ч и затем из лизатов клеток выделяли тотальную РНК и анализировали экспрессию мРНК Stat3.
Выделение РНК, обратная транскрипция и количественный ПЦР-анализ. Для количественной оценки уровня экспрессии генов использовали метод количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для этого из лизатов клеток выделяли общую РНК набором RNeasy Mini Kit (Qiagen, Германия) согласно протоколу производителя. Для получения комплементарной ДНК (кДНК) РНК подвергали обратной транскрипции с использованием случайных гексамерных праймеров набора ОТ-1 («Синтол», Россия). Затем кДНК амплифици-ровали на iCycler IQ5 (Bio-Rad, США) для определения уровня экспрессии генов. В качестве референсного использовали ген ß-актина (Actb).
Дизайн исследования in vivo. Моделирование нейтро-фильной БА проводили на мышах-самках BALB/c в возрасте 6-8 нед, массой 20-22 г, полученных из питомника «Столбовая» ФГБУН НЦБМТ ФМБА России. При поступлении из питомника животные были помещены в карантин на 7 дней, в течение которых проводили ежедневное наблюдение за состоянием животных. При формировании групп в качестве критерия отбора использовали показатель массы тела, так, чтобы индивидуальное значение массы не отклонялось от среднего значения более чем на 10 %. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с принципами Директивы Европейского Союза 2010/63/EU «Законодательство о защите животных, используемых в научных целях» и были одобрены локальным этическим комитетом.
Было сформировано 4 экспериментальные группы. У первых 3 групп индуцировали нейтрофильную БА. Для этого 3-кратно с интервалом в 2 нед внутрибрю-шинно вводили 20 мкг аллергена овальбумина (OVA) (Sigma-Aldrich, США) вместе с полным (в 1-й день) и неполным (в 14-й и 28-й дни) адъювантом Фрейнда (FA) (Sigma-Aldrich, США), с последующей аэрозольной провокацией. Через 2 нед после последней иммунизации осуществляли аэрозольную провокацию по 1 ингаляции в день в течение 5 дней смесью 1 мг/мл OVA и 1 мг/мл липополисахарида из E. coli (ЛПС) (Sigma-Aldrich, США). 4-я группа выступала в качестве контроля, во время сенсибилизации и провокации мыши данной группы подвергались манипуляциям с применением фосфатно-солевого буфера (ФСБ).
На фоне провокаций животным аэрозольно вводили комплекс, содержащий молекулы миРНК против Stat3 и пептид-носитель LTP (siSTAT3/LTP). В качестве контроля аналогичным образом вводили комплекс, содержащий неспецифические молекулы миРНК против гена Gfp и пептид-носитель LTP (siGFP/LTP) (табл. 2). Через 1 сут после последней провокации оценивали гиперреактивность бронхов (ГРБ), а через 2 сут собирали брон-хоальвеолярный лаваж (БАЛ) и извлекали легкие для гистологического исследования (рис. 1А).
Определение уровней иммуноглобулинов в сыворотке крови. Через 1 сут после последней аэрозольной провокации аллергеном из ретроорбитального синуса мышей собирали периферическую кровь. Индивидуальные образцы сывороток получали путем центрифугирования при 350 g в течение 15 мин при комнатной температуре и хранили при -70 °С до анализа. Уровни OVA-специфических IgE-, IgG1- и IgG2a-антител в сыворотке измеряли методом ИФА с использованием коммерческих наборов (Becton Dickinson, США).
Определение гиперреактивности бронхов. Использовали прибор для неинвазивной плетизмографии -FinePointe NAM (Buxco, США). ГРБ определяли при появлении бронхоспазма у экспериментальных мышей, вызванного аэрозольным введением метахолина (Sigma-Aldrich, США) в возрастающих концентрациях (6,25; 12,5; 25 мг/мл), после чего в автоматическом режиме оценивали удельную сопротивляемость дыхательных путей (ее выражали в см вод. ст. х с / мл) [20].
Отбор образцов бронхоальвеолярного лаважа. Через 2 сут после провокации мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации. Дыхательные пути через трахею с помощью шприца промывали дважды 0,5 мл среды RPMI 1640 (Gibco, США), после чего на автоматическом гематологическом анализаторе Abacus Junior Vet (Diatron, Германия) измеряли клеточность БАЛ. Результат выражали в количестве клеток в 1 мл БАЛ. Клетки БАЛ наносили на предметное стекло, дифференциально окрашивали азуром и эозином и подсчитывали количество клеток (макрофагов, нейтрофилов, эозинофилов и лимфоцитов).
Гистологический анализ легких. Через 2 сут после провокации удаляли левое легкое для приготовления микропрепаратов и помещали его в 10 % формалин, обезвоживали путем проводки по спиртам и заливали образцы в парафин. Микротомированием парафиновых блоков получали срезы легких толщиной 2-4 мкм. Полученные препараты окрашивали гематоксилином и эозином (Bio-Optica, Италия) для идентификации эозинофилов, нейтрофилов и лимфоцитов. Гистологическое исследование микропрепаратов легких осуществляли на световом микроскопе (Olympus, Япония). Толщину бронхиального эпителия измеряли в пикселях с использованием микрофотографий ткани легкого при увеличении в 200 раз и программного обеспечения Altami Studio (Альтами, Россия). Анализировали 5 субсегментарных бронхов у каждого экспериментального животного.
Статистический анализ выполняли с применением программного обеспечения Statistica 12.0 (StatSoft inc., США).
Результаты
Молекулы миРНК сиквенс-специфично подавляют экспрессию гена Stat3 in vitro
С помощью программного обеспечения OligoWalk было спроектировано более 200 вариантов миРНК.
Таблица 2. Экспериментальные группы и дозы
№ Группа Сенсибилизация Провокация Введение препарата
1 nBA 20 мкг/мышь OVA + 100 мкл/мышь FA 10 мг/мл OVA + 0,4 мг/мл ЛПС -
2 siGFP/LTP 20 мкг/мышь OVA 10 мг/мл OVA 1,1 мг/мл
+ 100 мкл/мышь FA + 0,4 мг/мл ЛПС siGFP/b-LTP за 2 ч до введения OVA
3 siSTAT3/LTP 20 мкг/мышь OVA 10 мг/мл OVA 1,1 мг/мл
+ 100 мкл/мышь FA + 0,4 мг/мл ЛПС siSTAT3/b-LTP за 2 ч до введения OVA
4 Контроль ФСБ ФСБ -
О
OVA/ЛПС
э
&
1,2
0,9
О
о 0,6
0,3
0,0
siGFP siSTAT3
siGFP siSTAT3 Норма
X X
I I -
siGFP siSTAT3 Норма
IgE
I I
X
=
О
О
СЕНСИБИЛИЗАЦИЯ ПРОВОКАЦИЯ
1 14 28 1 1 1 42 43 44 1 1 1 45 46 i i
1 1 1 t t t 1 1 1 t t t l Г
Внутрибрюшинно OVA + FA Аэрозольно OVA + ЛПС 1. БАЛ 2. Гистологический анализ
t t t Аэрозольно Экспериментальная терапия 1. IgE, IgG1, IgG2a 2. ГРБ
A Stat3 sRaw
6,25 12,50
Концентрация МХ, мг/мл
siGFP ф siSTAT3 Норма
IgG2a
IgG1
О
О
siGFP siSTAT3 Норма
siGFP siSTAT3 Норма
Рис. 1. Влияние комплекса 818ТЛТ3/ЬТР на гиперреактивность бронхов и уровни аллерген-специфических антител в сыворотке крови А - дизайн исследования; Б - уровни экспрессии гена Б1а13 в клетках бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ); В - гиперреактивность бронхов в ответ на возрастающие концентрации метахолина (МХ), измеренная как удельная сопротивляемость бронхов; Г - уровни аллерген-специфических антител классов и в сыворотке крови.
Представлены средние значение ± стандартная ошибка; п = 7; х - статистически значимо отличается от згОЕР по и-критерию Манна-Уитни.
3
2
0
Я
120
sO
^^^ 100
а
80
i
s 60
Подавление экспрессии гена Stat3 в культуре клеток L929
э
ä? 125 § 100
я 75 е
Ü 50
ре 25
п
ск
m 0
465 930 1426 1826 2492 siGFP Без
миРНК
Подавление экспрессии гена Stat3 различными концентрациями молекул миРНК в культуре клеток L929
- -__ -
- N. г X —-I -
- ____ X
0 1 2 Количество миРНК, мкг/100 000 клеток • siGFP ■ siStat3-1426
Рис. 2. Подавление экспрессии гена Stat3 молекулами миРНК в экспериментах in vitro
А - скрининг активности молекул миРНК на культуре клеток L929; Б - супрессия экспрессии гена Stat3 с помощью различных концентраций миРНК siSTAT3-1426 в культуре клеток L929. Клетки в количестве 100 тыс. трансфецировали смесью 1 мкг миРНК и коммерческого реагента Lipofecta-mine 2000, после чего определяли активность Stat3 методом количественной ПЦР. В качестве контроля клетки трансфецировали неспецифическими миРНК против гена Gfp (siGFP). Результаты выражали в % относительно активности Stat3 в необработанных клетках. Представлены средние значения ± стандартная ошибка; n = 5; х - статистически значимо отличается от siGFP по U-критерию Манна-Уитни.
Данное программное обеспечение рассчитывает термодинамические параметры гибридизации РНК-олигонук-леотидов, а также предсказывает их свободную энергию связывания с мРНК-мишенью. Для синтеза было выбрано 5 вариантов миРНК. Выбор этих вариантов обусловлен следующими критериями: 1) предсказанная теоретическая эффективность > 90 %; 2) сходство с другими генами в геноме мыши < 84 %, что необходимо для нивелирования off-target-эффектов.
Представленные варианты были синтезированы и очищены, проведен скрининг биологической активности в экспериментах in vitro на культуре клеток L929, так как эти клетки конститутивно экспрессируют Stat3. Для этого 100 тыс. клеток трансфецировали 1 мкг миРНК в смеси с коммерческим реагентом Lipofectamine 2000, после чего оценивали активность целевого гена методом количественной ПЦР. Было показано, что один вариант миРНК (siSTAT3-1426) статистически значимо на 75 % снижал экспрессию Stat3 в клетках по сравнению
с неспецифическими миРНК (siGFP) (рис. 2А). При этом отмечен дозозависимый эффект от применения siSTAT3-1426 (рис. 2Б). Эти данные свидетельствуют о сиквенс-специфическом подавлении экспрессии Stat3.
Комплекс миРНК и пептида-носителя подавляет активность гена Stat3 in vitro
В качестве носителя для созданной молекулы миРНК против гена Stat3 (siSTAT3-1426) мы использовали созданный ранее катионный дендримерный пептид LTP. Этот пептид способен доставлять нуклеиновые кислоты (включая миРНК) в различные типы клеток млекопитающих. Для эффективной доставки необходим 12,5-кратный избыток LTP в комплексе миРНК/пептид [16]. В отдельных экспериментах in vitro была изучена способность комплекса siSTAT3/LTP подавлять экспрессию Stat3 в клетках L929. Для этого в культуру клеток вносили siSTAT3/LTP в различных концентрациях, инкубировали 1 сут и измеряли экспрессию Stat3 методом количественной ПЦР. Как оказалось комплекс siSTAT3/ LTP в количестве 4 мкг (по миРНК) на 100 тыс. клеток статистически значимо супрессирует экспрессию Stat3 в 3,7 раза в сравнении с комплексом siGFP/LTP, в состав которого включены неспецифические молекулы миРНК (рис. 3А).
Также изучена способность комплекса siSTAT3/LTP супрессировать экспрессию Stat3 в ^П-клетках. Для этого ThO-клетки были выделены из селезенок мышей, дифференцированы в ^П-клетки в присутствии анти-СБ28-антител, ИЛ-6, ТФРß в течение 3 сут. В ходе диф-ференцировки клетки были обработаны молекулами миРНК siSTAT3-1426 в комплексе с различными транс-фекционными агентами (Lipofectamine 2000 и LTP). В клетках, обработанных комплексом siSTAT3-1426 с LTP, мы выявили 2-кратное снижение уровня экспрессии мРНК Stat3 и 5-7-кратное снижение уровня экспрессии мРНК 1117а. При этом внесение в культуру клеток комплекса siSTAT3-1426 и Lipofectamine 2000 не приводило к изменению экспрессии этих генов (рис. 3Б). Учитывая, что комплекс молекул siSTAT3-1426 и пептида LTP в массовом соотношении 1/12,5 способен подавлять экспрессию генов Stat3 и 1117а в лимфоцитах, его использовали в последующих исследованиях in vivo на модели нейтрофильной БА у мышей.
Комплекс миРНК и пептида-носителя подавляет активность гена Stat3 in vivo и снижает нейтрофильное воспаление в легких
В экспериментах in vivo мы использовали ранее созданную модель нейтрофильной БА, которая характеризовалась повышенным уровнем аллерген-специфических IgE-антител, развитием гиперреактивности бронхов и нейтрофильным воспалением легких. В ходе исследования животным с индуцированной нейтро-фильной БА проводили ингаляции комплексом молекул siSTAT3-1426 и пептида LTP (siSTAT3/LTP). В качестве контроля осуществляли ингаляции аналогичной дозой комплекса, содержащего неспецифические молекулы миРНК siGFP. После курса ингаляций у мышей оцени-
Рис. 3. Подавление экспрессии гена Stat3 молекулами миРНК в комплексе с пептидом LTP в экспериментах in vitro А - подавление экспрессии гена Stat3 комплексом siSTAT3/LTP на культуре клетокL929. Клетки в количестве 100 тыс. транс-фецировалиразличными количествами комплекса siSTAT3/LTP или siGFP/LTP (в качестве отрицательного контроля). Через 1 сут определяли активность Stat3 методом количественной ПЦР. Результаты нормализовали относительно экспрессии гена Hprt и выражали в виде RQ. Представлены средние значения ± стандартная ошибка; n = 4; х - статистически значимо отличается от siGFP по U-критерию Манна-Уитни; Б - подавление экспрессии гена Stat3 комплексом siSTAT3/ LTP в ThU-клетках. ThO-клетки выделены из селезенок мышей, дифференцированы в ThU-клетки в течение 3 сут. В ходе дифференцировки клетки были обработаны молекулами миРНК siSTAT3-1426 в комплексе с различными транс-фекционными агентами (Lipofectamine 2000 и LTP). Анализировали лизаты клеток методом количественной ПЦР. Результаты нормализовали относительно экспрессии гена «домашнего хозяйства» Actb и выражали в виде RQ. Представлены средние значения ± стандартная ошибка; n = 3; х - статистически значимо отличается от «Без вектора» по U-критерию Манна-Уитни.
О
120
^ 100 -
а
« 80 х
s 60 I 40
а
I 20
m
0
Э
ä? 125
§ 100
^
и 75
и
& 25 с
g „
rn 0
Подавление экспрессии гена Stat3 в культуре клеток L929
465 930 1426 1826 2492 siGFP Без
миРНК
Подавление экспрессии гена Stat3 различными концентрациями молекул миРНК в культуре клеток L929
- -__ -
- гХ _ '---—-ях
0 1 2 Количество миРНК, мкг/100 000 клеток • siGFP ■ siStat3-1426
Общее количество клеток
Макрофаги
Нейтрофилы
750 000
500 000 _
250 000 -
500 000 400 000 300 000 200 000 100 000 0
100 000
75 000 -
/м50 000
25 000 -
siGFP siSTAT3 Норма
siGFP siSTAT3 Норма
siGFP siSTAT3 Норма
Эозинофилы
Лимфоциты
100 000
75 000 -
50 000 -
25 000 -
250 000 200 000 л150 000 К100 000 50 000 0
siGFP siSTAT3 Норма
siGFP siSTAT3 Норма
3 50
0
0
0
Рис. 4. Клеточный состав бронхоальвеолярного лаважа (БАЛ)
Представлены средние значения количества клеток в 1 мл БАЛ ± стандартная ошибка; п = 7; х - статистически значимо отличается от siGFP по и-критерию Манна-Уитни.
Э
Э
Метаплазия
5
х
2
1 -
150
н 100
Толщина стенки бронхов
-
£
50 -
300
I
& 200
х
Количество клеток в перибронхиальных инфильтратах
100
э
siGFP siSTAT3 Норма Гиперплазия
5
х
2
1 -
siGFP siSTAT3 Норма
siGFP siSTAT3 Норма
siGFP siSTAT3 Норма Рис. 5. Гистологические изменения в ткани легких
А - микрофотографии ткани легких после окраски гематоксилином и эозином при увеличении в 400 раз, демонстрирующие выраженность перибронхиальной инфильтрации и утолщение бронхиального эпителия; Б - количество клеток в перибронхиальном инфильтрате; определяли количество клеток в 5 полях зрения; В - для оценки выраженности патологических процессов в дыхательных путях использовался полуколичественный метод оценки после дифференцированной окраски срезов органа гематоксилином и эозином. Выраженность признаков воспаления оценивали в баллах по следующей шкале: 0 - отсутствует; 1 - легкая; 2 - умеренная; 3 - тяжелая. Представлена медиана ± интерквартильный размах; n = 7; для статистического анализа применялся непараметрический критерий Краскела-Уоллиса; Г - толщина эпителия бронхов; измеряли толщину бронхиального эпителия в пикселях с использованием микрофотографий ткани легкого при увеличении в 200 раз и программного обеспечения Altami Studio. Анализировали 5 субсегментарных бронхов у каждого экспериментального животного. Представлены средние значения ± стандартная ошибка средней; n = 7; х - статистически значимо отличается от siGFP по U-критерию Манна-Уитни.
0
3
3
0
0
0
вали степень выраженности основных проявление БА: уровень аллерген-специфических антител, изменение гиперреактивности бронхов, определяли клеточный состав БАЛ и выраженность гистопатологических изменений в легких.
Ингаляции комплексом, содержащим siSTAT3 и LTP, приводили к подавлению экспрессии гена Stat3 на 50 % в клетках БАЛ (р < 0,05) по сравнению с мышами, получавшими неспецифические молекулы siGFP (рис. 1Б). Изучение ГРБ показало, что у животных, получавших комплекс, состоящий из siSTAT3 и пептида-носителя LTP, не происходило изменения удельной сопротивляемости бронхов в сравнении с мышами, которым ин-галировали комплекс, содержащий неспецифические миРНК; при этом ГРБ была значительно выше, чем в группе интактных животных (рис. 1В).
Аллерген-специфические антитела классов IgE, IgG2a и IgG1 детектировались в обеих экспериментальных группах животных, что свидетельствует о развитии гуморального иммунного ответа на аллер-
ген у животных. При этом ингаляционное введение комплекса, содержащего siSTAT3, не влияло на уровень IgE- и IgGl-антител в сравнении с использованием siGFP. Это свидетельствует об отсутствии влияния супрессии гена Stat3 на формирование ТЬ2-иммунного ответа. Мы также изучили изменение уровня IgG2a-антител в сыворотке крови, который является маркером Thl-иммунного ответа. Обнаружено увеличение уровня IgG2-антител у животных, получавших ингаляции siSTAT3, в сравнении с мышами, получившими siGFP (рис. 1Г).
При индукции у мышей нейтрофильной БА происходило 5-кратное увеличение общего количества клеток в образцах БАЛ по сравнению с интактными животными. Такое увеличение происходило за счет инфильтрации легких макрофагами, лимфоцитами и нейтро-филами. При этом увеличения числа эозинофилов не происходило. Это свидетельствует о развитии нейтро-фильного воспаления в легких. Ингаляции комплексом siSTAT3/LTP приводило к значительному, 3-кратному
уменьшению количества нейтрофилов в сравнении с мышами, получавшими ингаляции неспецифическими молекулами миРНК (бЮРР) (рис. 4).
Гистологический анализ легких не выявил статистически значимого уменьшения выраженности инфильтрации после курса ингаляций комплексом б18ТАТЗ/1ЛР в сравнении с комплексом бЮРР/ЪТР. Отмечена лишь тенденция к уменьшению числа клеток в перибронхиальных инфильтратах на 20 % (р = 0,18) (рис. 5А, 5Б). Также не выявлено уменьшения выраженности гиперплазии и метаплазии бронхиального эпителия у животных, получавших б18ТАТЗ/1ЛР (рис. 5В). Однако у животных, ингалированных комплексом $18ТАТЗ/ЬТР, снижалась толщина стенок бронхов (рис. 5Г).
Изучена экспрессия провоспалительных цитокинов в клетках БАЛ. Было показано, что подавление экспрессии гена Stat3 молекулами миРНК приводит к снижению экспрессии генов ТЫ7-цитокинов (в 2,1 раза для Ш7a, в 4,8 раза для Ш7/). В то же время не наблюдалось выраженного изменения в экспрессии генов ТЬ2-цитокина - П4 и ТЫ-цитокина - Ifng (рис. 6).
Обсуждение
В данной работе мы показали, что локальное подавление экспрессии гена Stat3 молекулами миРНК уменьшает воспаление в легких и ремоделирование респираторного тракта у мышей с индуцированной БА. Путем аэрозольной провокации смесью аллергена и ЛПС у животных воссоздавались следующие патологические изменения: воспаление легких, характеризующееся увеличением числа нейтрофилов, макрофагов и лимфоцитов в дыхательных путях, гиперреактивность и ремоделирование бронхов. Указанные патологические изменения формировались по ТЫ7-зависимому механизму [18], о чем свидетельствует увеличение экспрессии генов Stat3 (рис. 1Б), Ш7a и Ш7f (рис. 6) в клетках БАЛ. Соответственно, супрессия экспрессии Stat3 молекулами миРНК приводила к подавлению ТЫ 7-иммунного ответа, о чем свидетельствует значительное уменьшение экспрессии Ш7a и Ш7f в клетках БАЛ. При этом экспрессия гена Ifng, являющегося маркером ТЫ-иммунного ответа, и гена П4, который является маркером ТЫ-иммунного ответа, не изменялись после ингаляционного введения миРНК (рис. 6).
Примечательно, что подавление экспрессии Stat3 приводило к уменьшению содержания нейтрофилов в БАЛ в 3 раза, в то время как содержание макрофагов и лимфоцитов не изменялось (см. рис. 4). Это объясняется тем, что ТЫ7-клетки и секретируемые ими ци-токины (ИЛ-17А и ИЛ-17Б) участвуют в привлечении нейтрофилов в участок воспаления, в данном случае в легкие [21, 22]. В то же время уменьшение нейтро-фильного воспаления легких не приводило к снижению сопротивляемости бронхов; этот показатель оставался на относительно высоком уровне (см. рис. 1В). По всей видимости, нейтрофилы не вносят значимого вклада в развитие гиперактивности бронхов.
Ifng
Il4
я „ я 3
£
1 -
Е 2
1 -
£
siGFP siSTAT3 Норма Il17f
siGFP siSTAT3 Норма Il17a
я 4 и
К 2
Ü £ IS 5
4
2
£1
siGFP siSTAT3 Норма
siGFP siSTAT3 Норма
Рис. 6. Изменение экспрессии цитокинов в клетках бронхо-альвеолярного лаважа
Представлены средние значения относительной экспрессии генов цитокинов Ifng, Il4, Il17a и Il17f ± стандартная ошибка. Уровень экспрессии гена в группе «Норма» был принят за 1; n = 7; х - статистически значимо отличается от siGFP по U-критерию Манна-Уитни.
Дополнительно мы оценили гистологические изменения в ткани легких, которые показали, что супрессия экспрессии Stat3 и уменьшение нейтрофильного воспаления частично нивелируют признаки ремоделирования бронхов. В частности, происходило восстановление толщины стенок бронхов, но при этом такие признаки ре-моделирования, как метаплазия и гиперплазия бронхиального эпителия, не уменьшались после блокирования гена Stat3. Высокий уровень метаплазии и гиперплазии эпителия объясняет повышенную гиперреактивность бронхов у мышей, получавших миРНК.
Были изучены изменения уровней аллерген-специфических IgE-, IgG1- и ^02а-антител после подавления экспрессии Stat3 молекулами миРНК. Супрессия этого гена не приводила к изменению уровней IgE-и IgGl-антител, являющихся маркерами ТЫ-иммунного ответа [23]. В то же время происходило увеличение уровня IgG2a-антител, что свидетельствует о переключении иммунного ответа в сторону Thl-типа [23] (см. рис. 1Г). Антитела классов IgE и IgGl у мышей важны для развития ГРБ [24, 25]. Учитывая, что уровни этих антител не уменьшаются после супрессии Stat3, это может объяснять отсутствие благоприятного эффекта молекул миРНК на сопротивляемость бронхов.
Известно, что молекулы миРНК самопроизвольно не проникают к месту действия - в цитоплазму клеток-мишеней [15, 26]. Для этого молекулы миРНК водили аэро-зольно в комплексе с катионным пептидом-носителем LTP [16]. Ранее нами было показано, что данный пептид
4
3
о
о
5
6
Я 1 ч 3
а 3
о
о
способен доставлять нуклеиновые кислоты в широкий спектр клеток млекопитающих, включая лимфоциты [16]. В данном исследовании мы получили популяцию ТЫ7-клеток мышей и в эксперименте in vitro обработали ее комплексом молекул миРНК и LTP, что привело к подавлению экспрессии генов Stat3 и Il17a (рис. 3). Это доказывает способность пептида LTP доставлять молекулы миРНК в ТЫ7-клетки и негативно регулировать экспрессию провоспалительных цитокинов.
Полученные нами результаты сходны с ранее проведенными исследованиями других авторов. В работе H. Lim и соавт. [27] осуществлен нокаут гена Stat3 в Т-клетках мышей с последующей индукцией у них экспериментальной БА. Методом проточной цитомет-рии показано уменьшение количества ТЫ7-клеток в ткани легких и в лимфатических узлах после нокаута гена Stat3, при этом количество Th1- и ТЬ2-клеток увеличивалось [27]. Мы также наблюдали супрессию ТЫ7-иммунного ответа в легких после подавления активности гена Stat3 молекулами миРНК (рис. 6). Важно отметить, что инактивация гена Stat3 в Т-клетках не приводила к уменьшению уровня инфильтрации легких провоспалительными клетками [27]. Это согласуется с полученными нами данными. Анализ клеточного состава БАЛ (см. рис. 4) и гистологический анализ ткани легких (см. рис. 5Б) показали отсутствие уменьшения количества инфильтрирующих легкие клеток после подавления активности Stat3 молекулами миРНК. При этом мы обнаружили 3-кратное уменьшение числа нейтрофилов в образцах БАЛ (см. рис. 4), в то же время в работе H. Lim и соавт. [27] не проведена дифференцировка клеток, инфильтрирующих ткань легких, что не позволяет судить об изменении уровня нейтрофилии после нокаута гена Stat3. Также авторы показали что инактивация гена Stat3 в Т-клетках приводила к незначительному уменьшению гиперсекреции слизи эпителием бронхов [27]. Это согласуется с полученными нами результатами, подавление экспрессии гена Stat3 молекулами миРНК не влияло на выраженность метаплазии и гиперплазии эпителия бронхов (см. рис. 5В).
В еще одном исследовании [28] авторами был осуществлен нокаут гена Stat3 в эпителиальных клетках,
■ Литература
1. GINA Committee. Global Initiative for Asthma. Global Strategy for Asthma Management and Prevention. 2020. URL: https://gi-nasthma.org/wp-content/uploads/2020/04/GINA-2020-Appendix_fi-nal-wms.pdf (date of access October 14, 2021)
2. Soriano J.B., Abajobir A.A., Abate K.H., Abera S.F. et al. Global, regional, and national deaths, prevalence, disability-adjusted life years, and years lived with disability for chronic obstructive pulmonary disease and asthma, 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet Respir. Med. 2017; 5: 691-706. DOI: http://doi.org/10.1016/S2213-2600(17) 30293-X
3. Авдеев С.Н., Ненашева Н.М., Жуденков К.В., Петраков-ская В.А., Изюмова Г.В. Распространенность, заболеваемость, фенотипы и другие характеристики тяжелой бронхиальной астмы в Российской Федерации. Пульмонология. 2018; 28: 341-58. DOI: http://doi.org/10.18093/0869-0189-2018-28-3-341-358
после чего у мышей моделировалось экспериментальная БА. У животных с инактивированным геном наблюдались снижение ГРБ, уменьшение инфильтрации легких эозинофилами и ТЬ2-клетками, а также снижался уровень продуцируемых ими цитокинов (ИЛ-4, -5, -13). При этом уровень Thl-цитокина интерферона-у оставался неизменным. Уменьшение количества Th2-клеток в легких авторы связывают со снижением уровня хе-мокина TARC, являющегося аттрактантом этих клеток. Сходные результаты были получены при использовании ингибиторов киназ, вовлеченных в 8ТАТ3-сигнальный путь [28]. В отличие от исследования [28], мы не выявили влияния супрессии гена Stat3 на уровень Th2-цитокинов в легких (рис. 6), что, скорее всего, связано с различиями в используемых моделях воспаления легких. Авторы исследования [28] индуцировали экспериментальную БА путем активации Th2-иммунного ответа, сопряженного с инфильтрацией легких эозино-филами, в то же время в нашем исследовании мы индуцируем нейтрофильное воспаление легких, которое развивается по ThlV-зависимому механизму.
Заключение
Таким образом, был создан комплекс, состоящий из молекул миРНК против гена Stat3 и пептида-носителя LTP, ингаляции которым приводят к уменьшению ThlV-зависимого нейтрофильного воспаления легких. Применение созданного комплекса может быть многообещающим подходом к терапии нейтрофильной корти-костероид-резистентной БА.
Вклад авторов. Концепция и дизайн исследования - Шиловский И.П., Хаитов М.Р.; сбор и обработка материала - Юмашев К.В., Никольский А. А., Вишнякова Л.И., Барвинская Е. Д., Ковчина В.И., Туренко В.Н., Корнеев А.В., Каганова М.М.; статистическая обработка данных - Никольский А. А., Вишнякова Л.И., Барвинская Е.Д., Ковчина В.И.; написание текста - Шиловский И.П., Никольский А. А.; редактирование - Бры-лина В.Е., Никонова А. А.; утверждение окончательного варианта статьи - Козлов И.Б., Кофиади И.А., Пету-хова О.А.; ответственность за целостность всех частей статьи - Сергеев И.В., Маерле А.В, Кудлай Д. А.
4. Moote W., Kim H., Ellis A.K. Allergen-specific immunotherapy. Allergy Asthma Clin. Immunol. 2018; 14: 1-10. DOI: http://doi. org/10.1186/s13223-018-0282-5
5. Павлова К.С., Курбачева О.М., Галицкая М.А., Смирнов Д .С. Актуальные представления о механизмах аллерген-специфической иммунотерапии, потенциальных маркерах эффективности и путях совершенствования. Российский аллергологический журнал. 2017; 14: 5-17. DOI: http://doi.org/10.36691/RJA290
6. Corren J., Lemanske R.F., Hanania N.A., Korenblat P.E., Parsey M.V., Arron J.R., Harris J.M., Scheerens H., Wu L.C., Su Z., Mosesova S., Eisner M.D., Bohen S.P., Matthews J.G. Lebrikizumab treatment in adults with asthma. N. Engl. J. Med. 2011; 365: 1088-98. DOI: http://doi.org/10.1056/NEJMoa1106469
7. Wenzel S.E. Asthma phenotypes: the evolution from clinical to molecular approaches. Nat. Med. 2012; 18: 716-25. DOI: http://doi. org/10.1038/nm.2678
8. Seys S.F., Lokwani R., Simpson J.L., Bullens D.M.A. New insights in neutrophilic asthma. Curr. Opin. Pulm. Med. 2019; 25: 113— 20. DOI: http://doi.org/10.1097/MCP.0000000000000543
9. Liu W., Liu S., Verma M., Zafar I., Good J.T., Rollins D., Gro-shong S., Gorska M.M., Martin R.J., Alam R. Mechanism of TH2/ TH17-predominant and neutrophilic TH2/TH17-low subtypes of asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 2017; 139: 1548-58. DOI: http://doi. org/10.1016/j.jaci.2016.08.032
10. Chaudhry A., Rudra D., Treuting P., Samstein R.M., Liang Y., Kas A., Rudensky A.Y. CD4+ regulatory T cells control Th17 responses in a STAT3-dependent manner. Science. 2009; 326: 986-91. DOI: http://doi.org/10.1126/science.1172702
11. Halwani R., Sultana A., Vazquez-Tello A., Jamhawi A., Al-Masri A.A., Al-Muhsen S. Th-17 regulatory cytokines IL-21, IL-23, and IL-6 enhance neutrophil production of IL-17 cytokines during asthma. J. Asthma. 2017; 54: 893-904. DOI: http://doi.org/10.1080/0 2770903.2017.1283696
12. Shilovskiy I.P., Nikolskii A.A., Kurbacheva O.M., Khai-tov M.R. Modern view of neutrophilic asthma molecular mechanisms and therapy. Biochemistry (Mosc). 2020; 85: 854-68. DOI: http://doi. org/10.1134/S0006297920080027
13. Saw P.E., Song E.W. siRNA therapeutics: a clinical reality. Sci. China Life Sci. 2020; 63: 485-500. DOI: http://doi.org/10.1007/ s11427-018-9438-y
14. Nikam R.R., Gore, K.R. Journey of siRNA: clinical developments and targeted delivery. Nucleic Acid Ther. 2018; 28: 209-24. DOI: http://doi.org/10.1089/nat.2017.0715
15. Koloskova O.O., Nosova A.S., Sebyakin Y.L., Ilyukhina A.A., Shilovskiy I.P., Khaitov M.R. Liposomal siRNA delivery systems (review). Russ. J. Biopharm. 2017; 9: 3-10.
16. Kozhikhova K.V, Andreev S.M., Shilovskiy I.P., Timofe-eva A.V, Gaisina A.R., Shatilov A.A., Turetskiy E.A., Andreev I.M., Smirnov V.V, Dvornikov A.S., Khaitov M.R. A novel peptide dendrimer LTP efficiently facilitates transfection of mammalian cells. Org. Biomol. Chem. 2018; 16: 8181-90. DOI: http://doi.org/10.1039/c8ob02039f
17. Kanasty R., Dorkin J.R., Vegas A., Anderson D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nat. Mater. 2013; 12: 967-77. DOI: http://doi.org/10.1038/nmat3765
18. Шиловский И.П., Никольский А.А., Ковчина В.И., Болотова С.И., Вишнякова Л.И., Соколова А.Р., Барвинская Е.Д., Хаитов М.Р. Активация ЙП-иммунного ответа при экспериментальной нейтрофильной бронхиальной астме у мышей. Иммунология. 2019; 40: 5-15. DOI: http://doi.org/10.24411/0206-4952-2019-16001
■ References
1. GINA Committee. Global Initiative for Asthma. Global Strategy for Asthma Management and Prevention. 2020. URL: https://gi-nasthma.org/wp-content/uploads/2020/04/GINA-2020-Appendix_fi-nal-wms.pdf (date of access October 14, 2021)
2. Soriano J.B., Abajobir A.A., Abate K.H., Abera S.F., et al. Global, regional, and national deaths, prevalence, disability-adjusted life years, and years lived with disability for chronic obstructive pulmonary disease and asthma, 1990-2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2015. Lancet Respir. Med. 2017; 5: 691-706. DOI: http://doi.org/10.1016/S2213-2600(17)30293-X
3. Avdeev S.N., Nenasheva N.M., Zhudenkov K.V., Petra-kovskaya V.A., Izyumova G.V. Prevalence, morbidity, phenotypes and other characteristics of severe bronchial asthma in Russian Federation. Pul'monologiya. 2018; 28: 341-58. DOI: http://doi. org/10.18093/0869-0189-2018-28-3-341-358 (in Russian)
4. Moote W., Kim H., Ellis A.K. Allergen-specific immunotherapy. Allergy Asthma Clin. Immunol. 2018; 14: 1-10. DOI: http://doi. org/10.1186/s13223-018-0282-5
5. Pavlova K.S., Kurbacheva O.M., Galitskaya M.A., Smir-nov D.S. Actual conception of allergen-specific immunotherapy mechanisms, potential biomarkers of efficacy and ways of enhancement. Rossiyskiy allergologicheskiy zhurnal. 2017; 14: 5-17. DOI: http:// doi.org/10.36691/RJA290 (in Russian)
6. Corren J., Lemanske R.F., Hanania N.A., Korenblat P.E., Parsey M.V., Arron J.R., Harris J.M., Scheerens H., Wu L.C., Su Z., Mosesova S., Eisner M.D., Bohen S.P., Matthews J.G. Lebrikizumab treatment in adults with asthma. N. Engl. J. Med. 2011; 365: 1088-98. DOI: http://doi.org/10.1056/NEJMoa1106469
7. Wenzel S.E. Asthma phenotypes: the evolution from clinical to molecular approaches. Nat. Med. 2012; 18: 716-25. DOI: http://doi. org/10.1038/nm.2678
19. Lu Z.J., Mathews D.H. OligoWalk: an online siRNA design tool utilizing hybridization thermodynamics. Nucleic Acids Res. 2008; 36: 104-8. DOI: http://doi.org/10.1093/nar/gkn250
20. Shilovskiy I.P., Sundukova M.S., Babakhin A.A., GaisinaA.R., Maerle A.V., Sergeev I.V., Nikolskiy A.A., Barvinckaya E.D., Kovchi-na V.I., Kudlay D.A., Nikonova A.A., Khaitov M.R. Experimental protocol for development of adjuvant-free murine chronic model of allergic asthma. J. Immunol. Methods. 2019; 468: 10-9. DOI: http:// doi.org/10.1016/j.jim.2019.03.002
21. Chang H.S., Lee T.H., Jun J.A., Baek A.R., Park J.S., Koo S.M., Kim Y.K., Lee H.S., Park C.S. Neutrophilic inflammation in asthma: mechanisms and therapeutic considerations. Expert Rev. Respir. Med. 2017; 11: 29-40. DOI: http://doi.org/10.1080/1747634 8.2017.1268919
22. Newcomb D.C., Peebles R.S. Th17-mediated inflammation in asthma. Curr. Opin. Immunol. 2013; 25: 755-760. DOI: http://doi. org/10.1016/j.coi.2013.08.002
23. Steinke J.W., Borish L. Th2 cytokines and asthma. Interleu-kin-4: its role in the pathogenesis of asthma, and targeting it for asthma treatment with interleukin-4 receptor antagonists. Respir. Res. 2001; 2: 66-70. DOI: http://doi.org/10.1186/rr40
24. Miyajima I., Dombrowicz D., Martin T.R., Ravetch J.V, Ki-net J.P., Galli S.J. Systemic anaphylaxis in the mouse can be mediated largely through IgG1 and Fc gammaRIII. Assessment of the cardiopulmonary changes, mast cell degranulation, and death associated with active or IgE- or IgG1-dependent passive anaphy-laxis. J. Clin. Invest. 1997; 99: 901-14. DOI: http://doi.org/10.1172/ JCI119255
25. Oettgen H.C., Martin T.R., Wynshaw-Boris A., Deng C., Dra-zen J.M., Leder P. Active anaphylaxis in IgE-deficient mice. Nature. 1994; 370: 367-70. DOI: http://doi.org/10.1038/370367a0
26. Juliano R.L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 2016; 44: 6518-48. DOI: http://doi.org/10.1093/ nar/gkw236
27. Lim H., Cho M., Choi G., Na H., Chung Y. Dynamic control of Th2 cell responses by STAT3 during allergic lung inflammation in mice. Int. Immunopharmacol. 2015; 28: 846-53. DOI: http://doi. org/10.1016/j.intimp.2015.03.051
28. Simeone-Penney M.C., Severgnini M., Tu P., Homer R.J., Mariani T.J., Cohn L., Simon A.R. Airway epithelial STAT3 is required for allergic inflammation in a murine model of asthma. J. Immunol. 2007; 178: 6191-9. DOI: http://doi.org/10.4049/jimmu-nol.178.10.6191
8. Seys S.F., Lokwani R., Simpson J.L., Bullens D.M.A. New insights in neutrophilic asthma. Curr. Opin. Pulm. Med. 2019; 25: 11320. DOI: http://doi.org/10.1097/MCP.0000000000000543
9. Liu W., Liu S., Verma M., Zafar I., Good J.T., Rollins D., Gro-shong S., Gorska M.M., Martin R.J., Alam R. Mechanism of TH2/ TH17-predominant and neutrophilic TH2/TH17-low subtypes of asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 2017; 139: 1548-58. DOI: http://doi. org/10.1016/j.jaci.2016.08.032
10. Chaudhry A., Rudra D., Treuting P., Samstein R.M., Liang Y., Kas A., Rudensky A.Y. CD4+ regulatory T cells control Th17 responses in a STAT3-dependent manner. Science. 2009; 326: 986-91. DOI: http://doi.org/10.1126/science.1172702
11. Halwani R., Sultana A., Vazquez-Tello A., Jamhawi A., Al-Masri A.A., Al-Muhsen S. Th-17 regulatory cytokines IL-21, IL-23, and IL-6 enhance neutrophil production of IL-17 cytokines during asthma. J. Asthma. 2017; 54: 893-904. DOI: http://doi.org/10.1080/0 2770903.2017.1283696
12. Shilovskiy I.P., Nikolskii A.A., Kurbacheva O.M., Khaitov M.R. Modern view of neutrophilic asthma molecular mechanisms and therapy. Biochemistry (Mosc). 2020; 85: 854-68. DOI: http://doi. org/10.1134/S0006297920080027
13. Saw P.E., Song E.W. siRNA therapeutics: a clinical reality. Sci. China Life Sci. 2020; 63: 485-500. DOI: http://doi.org/10.1007/ s11427-018-9438-y
14. Nikam R.R., Gore, K.R. Journey of siRNA: clinical developments and targeted delivery. Nucleic Acid Ther. 2018; 28: 209-24. DOI: http://doi.org/10.1089/nat.2017.0715
15. Koloskova O.O., Nosova A.S., Sebyakin Y.L., Ilyukhina A.A., Shilovskiy I.P., Khaitov M.R. Liposomal siRNA delivery systems (review). Russ. J. Biopharm. 2017; 9: 3-10.
16. Kozhikhova K.V, Andreev S.M., Shilovskiy I.P., Timofe-eva A.V, Gaisina A.R., Shatilov A.A., Turetskiy E.A., Andreev I.M., Smirnov V.V, Dvornikov A.S., Khaitov M.R. A novel peptide dendrimer LTP efficiently facilitates transfection of mammalian cells. Org. Biomol. Chem. 2018; 16: 8181-90. DOI: http://doi.org/10.1039/c8ob02039f
17. Kanasty R., Dorkin J.R., Vegas A., Anderson D. Delivery materials for siRNA therapeutics. Nat. Mater. 2013; 12: 967-77. DOI: http://doi.org/10.1038/nmat3765
18. Shilovskiy I.P., Nikolskii A.A., Kovchina V.I., Bolo-tova S.I., Vishniakova L.I., Sokolova A.R., Barvinskaya E.D., Khai-tov M.R. Activation of Th17-immune response in a mouse model of neutrophilic asthma. Immunologiya. 2019; 40: 5-15. DOI: http://doi. org/10.24411/0206-4952-2019-16001 (in Russian)
19. Lu Z.J., Mathews D.H. OligoWalk: an online siRNA design tool utilizing hybridization thermodynamics. Nucleic Acids Res. 2008; 36: 104-8. DOI: http://doi.org/10.1093/nar/gkn250
20. Shilovskiy I.P., Sundukova M.S., Babakhin А.А., Gaisina A.R., Maerle A.V., Sergeev I.V., Nikolskiy A.A., Barvinckaya E.D., Kovchina V.I., Kudlay D.A., Nikonova A.A., Khaitov M.R. Experimental protocol for development of adjuvant-free murine chronic model of allergic asthma. J. Immunol. Methods. 2019; 468: 10-9. DOI: http://doi.org/10.1016/jjim.2019.03.002
21. Chang H.S., Lee T.H., Jun J.A., Baek A.R., Park J.S., Koo S.M., Kim Y.K., Lee H.S., Park C.S. Neutrophilic inflammation in asthma: mechanisms and therapeutic considerations. Expert Rev. Respir. Med. 2017; 11: 29-40. DOI: http://doi.org/10.1080/17476348.2017.1268919
Сведения об авторах
Никольский Александр Аркадьевич - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: aa.nikolskii@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-4169-0760
Шиловский Игорь Петрович - д-р биол. наук, зам. директора по науке и инновациям ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ip.shilovsky@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0001-5343-4230
Юмашев Кирилл Валерьевич - студент ФГБОУ ВО МГАВМиБ -МВА имени К.И. Скрябина; лаборант лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: yumashev.k.98@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-1544-0597
Вишнякова Людмила Ивановна - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: lyudmilochka94@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-3555-3268
Барвинская Екатерина Драгановна - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ed.barvinskaya@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-9407-7054
Ковчина Валерия Ивановна - мл. науч. сотр. лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: kvi-91@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-3134-5776
Корнеев Артем Викторович - студент ФГБОУ ВО МГАВМиБ -МВА имени К.И. Скрябина Минсельхоза России; лаборант лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: korneev.molekula@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-1864-8684
Туренко Владислав Николаевич - лаборант лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: vladislav.turenko.n@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-1817-0844
22. Newcomb D.C., Peebles R.S. Th17-mediated inflammation in asthma. Curr. Opin. Immunol. 2013; 25: 755-760. DOI: http://doi. org/10.1016/j.coi.2013.08.002
23. Steinke J.W., Borish L. Th2 cytokines and asthma. Interleu-kin-4: its role in the pathogenesis of asthma, and targeting it for asthma treatment with interleukin-4 receptor antagonists. Respir. Res. 2001; 2: 66-70. DOI: http://doi.org/10.1186/rr40
24. Miyajima I., Dombrowicz D., Martin T.R., Ravetch J.V, Kinet J.P., Galli S.J. Systemic anaphylaxis in the mouse can be mediated largely through IgG1 and Fc gammaRIII. Assessment of the cardiopul-monary changes, mast cell degranulation, and death associated with active or IgE- or IgG1-dependent passive anaphylaxis. J. Clin. Invest. 1997; 99: 901-14. DOI: http://doi.org/10.1172/JCI119255
25. Oettgen H.C., Martin T.R., Wynshaw-Boris A., Deng C., Drazen J.M., Leder P. Active anaphylaxis in IgE-deficient mice. Nature. 1994; 370: 367-70. DOI: http://doi.org/10.1038/370367a0
26. Juliano R.L. The delivery of therapeutic oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 2016; 44: 6518-48. DOI: http://doi.org/10.1093/nar/gkw236
27. Lim H., Cho M., Choi G., Na H., Chung Y. Dynamic control of Th2 cell responses by STAT3 during allergic lung inflammation in mice. Int. Immunopharmacol. 2015; 28: 846-53. DOI: http://doi. org/10.1016/j.intimp.2015.03.051
28. Simeone-Penney M.C., Severgnini M., Tu P., Homer R.J., Mar-iani T.J., Cohn L., Simon A.R. Airway epithelial STAT3 is required for allergic inflammation in a murine model of asthma. J. Immunol. 2007; 178: 6191-9. DOI: http://doi.org/10.4049/jimmunol.178.10.6191
Authors' information
Aleksandr A. Nikolskii - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: aa.nikolskii@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-4169-0760
Igor P. Shilovskiy - Dr.Sci., PhD, Deputy Director on Science and Innovation, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ip.shilovsky@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0001-5343-4230
Kirill V. Yumashev - Student of MVA named after K.I. Skryabin; Laboratory Assistant of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: yumashev.k.98@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-1544-0597
Liudmila I. Vishniakova - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: lyudmilochka94@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-3555-3268
Ekaterina D. Barvinskaia - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ed.barvinskaya@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0002-9407-7054
Valeriia I. Kovchina - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: kvi-91@mail.ru https://orcid.org/0000-0003-3134-5776
Artem V. Korneev - Student of MVA named after K.I. Skryabin of the MOA of Russia; Laboratory Assistant of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: korneev.molekula@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-1864-8684
Vladislav N. Turenko - Junior Researcher of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: vladislav.turenko.n@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-1817-0844
Магни
Набор реагентов для качественного выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2
ív
МЕТОД LAMP
МАГНИТНЫЕ ЧАСТИЦЫ
Проведение реакции при постоянной температуре 60-65° С, совмещение с обратной транскрипцией благодаря использованию фермента Е^-полимеразы
Лизирование вируса и осаждение РНК на магнитных частицах3
Способствуют сокращению времени
анализа^
Может способствовать снижению количества ложноотрицательных результатов3
1. LAMP - Loop mediated isothermal amplification (англ.) - петлевая изотермическая амплификация. 2. Augustine, R.; Hasan, A.; Das, S.; Ahmed, R.; Mori, Y.; Notomi, T.; Kevadiya, B.D.; Thakor, A.S. Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): A Rapid, Sensitive, Specific, and Cost-Effective Point-of-Саге Test for Coronavlruses in the Context of COVID-19 Pandemic. Biology 2020,9, 182. https://doi.opg/10.3390/biology9080182 (Августин, P.; Хасан, А.; Дас, С.; Ахмед, P.; Мори, Ю.; Нотами, Т.; Кевадия, Б.Д.; Такор А. Петлевая изотермическая амплификация (LAMP): быстрый, чувствительный, специфический и экономичный тест для лечения коронавирусов в контексте пандемии COVID-19. Биология 2020, 9, 182.) 3. Инструкция по применению медицинского изделия для диагностики In vitro «Набор реагентов для выявления РНК коронавируса SARS-CoV-2 методом петлевой изотермапьной амплификации «МагниТест»» по ТУ 21.20.23-096-26329720-2020 4. Notomi Т, Okayama H, Masubuchi H, Yonekawa T, Watanabe K, Amino N, Hase T. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 2000 Jun 15;28(12):E63. doi: 10.1093/nar/28.12.e63. PMID: 10871386; PMCID: PMC102748. (Нотами T, Окаяма X, Масубучи X, Йонекава Т., Ватанабе К, Амино H, Хэйз Т. Петлевая изотермическая амплификация ДНК. Нуклеик Эйсид Ресерч. 2000 15 июня; 28 (12): Е63.)
Информация предназначена для медицинских специалистов. Перед применением ознакомиться с инструкцией по применению.
АО «ГЕНЕРИУМ», 601125, Владимирская обл., Петушинский р-н, п. Вольгинский, ул. Заводская, строение 273. РУ №РЗН 2021/14279 от 12 мая 2021 года
О Generium
Ж ' Pharmaceuticals
Каганова Мария Михайловна - студент ФГБОУ ВО МГАВМиБ -МВА имени К.И. Скрябина; лаборант лаб. противовирусного иммунитета ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: mariya.kaganova.99@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-2596-5779
Брылина Вера Евгеньевна - канд. вет. наук, доц. каф. иммунологии и биотехнологии ФГБОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина, Москва, Российская Федерация E-mail: integrin07@rambler.ru https://orcid.org/0000-0001-9917-2088
Никонова Александра Александровна - канд. биол. наук, науч. сотр. ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: aa.nikonova@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0001-9610-0935
Козлов Иван Борисович - науч. сотр. лаб. молекулярной имму-ногенетики ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: kozlov.nrcii@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-1921-7715
Кофиади Илья Андреевич - д-р биол. наук, зав. лаб. молекулярной иммуногенетики ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: kofiadi@mail.ru http://orcid.org/0000-0001-9280-8282
Сергеев Илья Викторович - канд. биол. наук, науч. сотр. ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: ilya-sergeew@yandex.ru
Маерле Артем Владимирович - науч. сотр. ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация
E-mail: maerle@yandex.ru
Петухова Ольга Андреевна - мл. науч. сотр. лаб. клинической фармакологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: tashirik@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-3339-2608
Кудлай Дмитрий Анатольевич - д-р мед. наук, вед. науч. сотр. лаб. персонализированной медицины и молекулярной иммунологии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. фармакологии Института фармации ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет), Москва, Российская Федерация E-mail: D624254@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-1878-4467
Хаитов Муса Рахимович - член-корр. РАН, д-р мед. наук, проф., директор ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; и.о. зав. каф. иммунологии МБФ РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, Москва, Российская Федерация E-mail: mr.khaitov@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-4961-9640
Mariya M. Kaganova - Student of MVA named after K.I. Skryabin of the MOA of Russia; Laboratory Assistant of the Antiviral Immunity Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: mariya.kaganova.99@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-2596-5779
Vera E. Brylina - PhD, Associate Prof. of the Immunology and Biotechnology Chair, MVA named after K.I. Skryabin of the MOA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: integrin07@rambler.ru https://orcid.org/0000-0001-9917-2088
Alexandra A. Nikonova - PhD, Researcher, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: aa.nikonova@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0001-9610-0935
Ivan B. Kozlov - Researcher of the Molecular Immunogenetics Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation
E-mail: kozlov.nrcii@gmail.com http://orcid.org/0000-0002-1921-7715
Ilya A. Kofiadi - D.Sci., PhD, Head of the Molecular Immunogenetics Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: kofiadi@mail.ru http://orcid.org/0000-0001-9280-8282
Ilya V. Sergeev - PhD, Researcher, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ilya-sergeew@yandex.ru
Artem V. Maerle - Researcher, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: maerle@yandex.ru
Olga A. Petukhova - Junior Researcher of the Clinical Pharmacology Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: tashirik@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-3339-2608
Dmitry A. Kudlay - MD, PhD, Leader Researcher of Laboratory of Personalized Medicine and Molecular Immunology, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of Pharmacology Chair, Institute of Pharmacy, I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Moscow, Russian Federation E-mail: D624254@gmail.com https://orcid.org/0000-0003-1878-4467
Musa R. Khaitov - Corr. Member of RAS, MD, Prof., Director of NRC Institute of Immunology, of the FMBA of Russia; Deputy Head of Immunology Chair, MBF of N.I. Pirogov RNRMU of the MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: mr.khaitov@nrcii.ru https://orcid.org/0000-0003-4961-9640
